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Biology

Confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा एकल सेल जन्मजात प्रतिदीप्ति हस्ताक्षर का पुनर्निर्माण

Published: May 27, 2020 doi: 10.3791/61120
Automatic Translation
*1, *2, 1, 2,3, *2,3
1Graduate School of Life and Environmental Sciences, University of Tsukuba, 2Faculty of Life and Environmental Sciences, University of Tsukuba, 3Microbiology Research Center for Sustainability, University of Tsukuba
* These authors contributed equally

Summary

यहां, एक प्रोटोकॉल ऑप्टिकल रूप से निकालने और जन्मजात सेलुलर प्रतिदीप्ति हस्ताक्षर (यानी, सेलुलर ऑटोफ्लोरेसेंस) को तीन आयामी स्थान में वितरित प्रत्येक व्यक्ति लाइव सेल से कैटलॉग करने के लिए प्रस्तुत किया गया है। यह विधि एक एकल-कोशिका संकल्प पर विविध जैविक प्रणालियों के जन्मजात प्रतिदीप्ति हस्ताक्षर का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त है, जिसमें बैक्टीरिया, कवक, खमीर, पौधों और जानवरों से कोशिकाएं शामिल हैं।

Abstract

यहां वर्णित confocal प्रतिबिंब माइक्रोस्कोपी-सहायता प्राप्त एकल-सेल जन्मजात प्रतिदीप्ति विश्लेषण (CRIF) है, जो तीन आयामी (3 डी) अंतरिक्ष में वितरित आबादी में प्रत्येक व्यक्तिगत लाइव सेल से जन्मजात सेलुलर प्रतिदीप्ति हस्ताक्षर के पुनर्निर्माण के लिए एक न्यूनतम इनवेसिव विधि है। एक सेल का जन्मजात प्रतिदीप्ति हस्ताक्षर सेल के भीतर विभिन्न बायोमोलेक्यूल्स द्वारा उत्सर्जित प्रतिदीप्ति संकेतों का एक संग्रह है। पिछले अध्ययनों ने स्थापित किया कि जन्मजात प्रतिदीप्ति हस्ताक्षर विभिन्न सेलुलर गुणों और शारीरिक स्थिति में अंतर को दर्शाते हैं और सेल लक्षण वर्णन और पहचान के लिए जानकारी का एक समृद्ध स्रोत हैं। जन्मजात प्रतिदीप्ति हस्ताक्षर पारंपरिक रूप से जनसंख्या स्तर पर विश्लेषण किया गया है, एक क्लोनल संस्कृति की आवश्यकता है, लेकिन एकल-सेल स्तर पर नहीं। सीआरआईएफ उन अध्ययनों के लिए विशेष रूप से उपयुक्त है जिनके लिए 3 डी रिज़ॉल्यूशन और / या व्यक्तिगत कोशिकाओं से प्रतिदीप्ति संकेतों के चयनात्मक निष्कर्षण की आवश्यकता होती है। क्योंकि प्रतिदीप्ति हस्ताक्षर एक सेल की एक जन्मजात संपत्ति है, CRIF भी बरकरार और एकल कोशिकाओं के प्रकार और / या शारीरिक स्थिति के टैग-मुक्त पूर्वानुमान के लिए उपयुक्त है। यह विधि सुव्यवस्थित सेल विश्लेषण के लिए एक शक्तिशाली उपकरण हो सकती है, जहां एक विषम आबादी में प्रत्येक एकल सेल के फेनोटाइप का मूल्यांकन सीधे सेल टैगिंग के बिना माइक्रोस्कोप के तहत इसके ऑटोफ्लोरेसेंस हस्ताक्षर द्वारा किया जा सकता है।

Introduction

एक सेल 1 के भीतर विविध बायोमोलेक्यूल्स ऑटोफ्लोरेसेंस संकेतों का उत्सर्जन करते हैं, और एक सेल के जन्मजात प्रतिदीप्ति हस्ताक्षर में इन संकेतों की असेंबली होती है। यह हस्ताक्षर प्रतिदीप्ति विभिन्न सेलुलर गुणों और शारीरिक स्थिति में अंतर को भी दर्शाता है। जन्मजात प्रतिदीप्ति का विश्लेषण न्यूनतम इनवेसिव है और पारंपरिक, अधिक आक्रामक सूक्ष्मजीवविज्ञानी जांच के पूरक हो सकता है जो पूर्ण सेल विनाश के लिए हल्के चयापचय संशोधन से निशान की एक श्रृंखला छोड़ देते हैं। जबकि डीएनए या सेल सामग्री निष्कर्षण 2,3, फ्लोरोसेंट इन सीटू संकरण 4, और जीनोम में फ्लोरोसेंट रिपोर्टर जीन की शुरूआत जैसी पारंपरिक तकनीकें सेल प्रकार या शारीरिक स्थिति को निर्धारित करने में प्रभावी हैं, उन्हें आमतौर पर या तो कोशिकाओं के हेरफेर या आक्रामक टैगिंग की आवश्यकता होती है।

थोक माइक्रोबियल संस्कृति निलंबन 5,6, सक्रिय sludges7, स्तनधारी ऊतक8,9, और स्तनधारी कोशिकाओं 1,10 सहित विभिन्न जीवित और बरकरार माइक्रोबियल कॉलोनियों के जन्मजात प्रतिदीप्ति के अध्ययन से पता चला है कि जन्मजात प्रतिदीप्ति विश्लेषण सेल प्रकार और शारीरिक स्थिति के टैग-मुक्त विश्लेषण की सुविधा प्रदान करता है। जन्मजात प्रतिदीप्ति हस्ताक्षर पारंपरिक रूप से जनसंख्या स्तर पर विश्लेषण किया गया है और एकल-सेल स्तर पर नहीं, और इस प्रकार एक क्लोनल संस्कृति की आवश्यकता होती है। इसके विपरीत, यहां वर्णित कोनफोकल रिफ्लेक्शन माइक्रोस्कोपी-असिस्टेड सिंगल-सेल इनेट फ्लुओरेसेंस विश्लेषण (सीआरआईएफ) तकनीक 11 प्रत्येक व्यक्ति के जीवित माइक्रोबियल सेल के जन्मजात सेलुलर प्रतिदीप्ति हस्ताक्षर का पुनर्निर्माण और कैटलॉग करती है। इसके अलावा, सीआरआईएफ व्यवस्थित रूप से एक आबादी के भीतर एक एकल माइक्रोबियल सेल के जन्मजात प्रतिदीप्ति हस्ताक्षर को व्यवस्थित रूप से एकत्र कर सकता है जिसे तीन आयामी (3 डी) स्थान में वितरित किया जाता है।

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Protocol

1. नमूने की तैयारी

  1. एक ग्लास स्लाइड पर कुओं के साथ एक 1 मिमी मोटी सिलिकॉन गैस्केट रखें।
  2. सिलिकॉन गैस्केट के कुएं में एक 1 मिमी मोटी 0.8% (डब्ल्यू / वी) एगारोज़ स्लैब रखें।
  3. एक मनमाने ढंग से माइक्रोबियल सेल संस्कृति के सेल घनत्व को 600 एनएम (OD660) = 1.0 पर ऑप्टिकल घनत्व के लिए पतला करें।
  4. agarose स्लैब पर सेल निलंबन का एक 5 μL ऐलीकोट रखें।
  5. एक ग्लास कवरस्लिप के साथ धीरे से कवर करें।

2. एक माइक्रोस्कोप का सेटअप

नोट: CRIF तकनीक confocal प्रतिबिंब माइक्रोस्कोपी (CRM) और multichannel confocal microspectroscopy को जोड़ती है। सीआरएम सेलुलर आकृति विज्ञान और स्थानिक स्थानीयकरण के लिए जानकारी के स्रोत के रूप में कार्य करता है, जो सेलुलर जन्मजात प्रतिदीप्ति से स्वतंत्र है। Multichannel confocal microspectroscopy सेलुलर जन्मजात प्रतिदीप्ति की वर्णक्रमीय जानकारी प्रदान करता है। निम्नलिखित प्रोटोकॉल में, CRM या confocal प्रतिदीप्ति microspectroscopy के साथ अधिग्रहित किसी भी छवि को क्रमशः CRM छवि या multichannel confocal microspectroscopy छवि के रूप में संदर्भित किया जाता है।

  1. एक photomultiplier ट्यूब (PMT) या GAAsP डिटेक्टर करने के लिए descanned वर्णक्रमीय चैनलों के साथ एक confocal माइक्रोस्कोप कनेक्ट करें।
    नोट:: ये सेटअप कई निर्माताओं से उपलब्ध हैं।
  2. पर्याप्त आवर्धन के साथ एक उच्च संख्यात्मक एपर्चर (एनए) उद्देश्य के साथ माइक्रोस्कोप से लैस करें।
    नोट: 1.4 > एनए के साथ एक 63x उद्देश्य जीवाणु कोशिकाओं का विश्लेषण करने के लिए अनुशंसित है।
  3. सीआरएम को समायोजित करने के लिए माइक्रोस्कोप को आधे-प्रतिबिंब दर्पण (जैसे, एनटी 80/20) से लैस करें, जो सेल आकृति विज्ञान की कल्पना करने के लिए घटना प्रकाश के सेलुलर स्कैटर पर निर्भर करता है।
  4. Multichannel confocal microspectroscopy के लिए, माइक्रोस्कोप को डाइक्रोइक दर्पणों से लैस करें। उदाहरण के लिए, MBS InVis405, MBS458, MBS488, MBS458/514, MBS488/543, या MBS 488/543/633 बीम विभाजक क्रमशः 405, 458, 488, 514, 543, या 633 nm उत्तेजना के लिए का उपयोग करें।
  5. एक लेजर पावर मीटर का उपयोग करके प्रत्येक उत्तेजना तरंग दैर्ध्य के लिए रोशनी तीव्रता को समायोजित करें। उत्तेजना तरंग दैर्ध्य के माध्यम से माइक्रोस्कोप के नीचे आउटपुट को स्थिर रखें (उदाहरण के लिए, 63x उद्देश्य के साथ 50 μW का उपयोग करें)।

3. छवि अधिग्रहण

  1. माइक्रोस्कोप सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके पिनहोल आकार को 1 AU पर सेट करें।
  2. प्रत्येक उत्तेजना तरंग दैर्ध्य के लिए पिक्सेल रहने का समय (यानी, स्कैनिंग गति) सेट करें।
    नोट:: एक अत्यधिक लंबे पिक्सेल रहने का समय कक्षों को नुकसान पहुंचा सकता है। कोशिकाओं के लिए photodamage को कम करने के लिए अत्यधिक लंबे पिक्सेल रहने के समय से बचें। जीवाणु नमूनों के लिए, एक पिक्सेल निवास समय <55.6 μs / μm2 (जब माइक्रोस्कोप के तहत विकिरण आउटपुट ~ 17 μW / cm2 है) आमतौर पर विकास निषेध से बचने के लिए उपयुक्त है। यह पैरामीटर जीवों और प्रयोगात्मक सेटअप के आधार पर भिन्न हो सकता है।
  3. स्कैनिंग रिज़ॉल्यूशन सेट करें. बैक्टीरिया जैसी छोटी कोशिकाओं के लिए, 1,024 x 1,024 के स्कैनिंग क्षेत्र का उपयोग करें।
  4. Z-स्कैनिंग श्रेणी सेट करें ताकि रुचि का क्षेत्र कवर किया जा सके.
    नोट: एक agarose स्लैब पर वितरित जीवाणु और खमीर सेल नमूनों के लिए, ~ 15 μm की एक Z-स्कैनिंग सीमा आमतौर पर पर्याप्त है।
  5. दृश्य तरंग दैर्ध्य सीमा (उदाहरण के लिए, 416−691 एनएम) को कैप्चर करने के लिए डिसकैन्ड डिटेक्टर सेट करें। 8−10 nm की वर्णक्रमीय विंडो का उपयोग करें।
  6. प्रतिदीप्ति छवियों के जेड-स्टैक बनाने के लिए सबसे लंबे समय से सबसे कम उत्तेजना तरंग दैर्ध्य तक एक अनुक्रम में मल्टीचैनल कॉन्फोकल माइक्रोस्पेक्ट्रोस्कोपी छवियों को प्राप्त करें।
  7. CRM छवियाँ प्राप्त करें.
  8. अधिग्रहित छवियों को एक निर्देशिका में 16-बिट टिफ़ फ़ाइलों के रूप में सहेजें. नामकरण सम्मेलन XXXcYYzZZ.tif का उपयोग करके फ़ाइलों का नाम दें, जहां XXX उत्तेजना तरंग दैर्ध्य है, YY डिटेक्टर चैनल नंबर है, ZZ Z-स्लाइस नंबर है, और "c" और "z" डिटेक्टर संख्या और Z-स्लाइस संख्या के लिए उपसर्ग हैं, क्रमशः।
    1. उदाहरण के लिए, यदि एक मल्टीचैनल कॉन्फोकल माइक्रोस्पेक्ट्रोस्कोपी छवि को 405 एनएम की उत्तेजना तरंग दैर्ध्य के साथ लिया जाता है, तो डिटेक्टर सरणी का पहला डिटेक्टर चैनल, और जेड-स्टैक का 5 वां टुकड़ा है, तो इसे "405c01z05.tif" नाम दें। CRM छवियों के लिए, XXX के स्थान पर स्ट्रिंग "CRM" का उपयोग करें (उदाहरण के लिए, "CRMc01z05.tif")।
      नोट:: तय करें कि 2D या 3D विभाजन छवि डेटा के लिए सबसे उपयुक्त है। उन स्थितियों में एक 2 डी विभाजन विधि का उपयोग करें जहां छोटी कोशिकाएं 2 डी विमान तक सीमित होती हैं (उदाहरण के लिए, कांच की सतह का पालन करने वाली जीवाणु आबादी)। उन स्थितियों में 3 डी विभाजन विधि का उपयोग करें जहां सेल आबादी को तीन आयामी स्थान (जैसे, बायोफिल्म्स और ऊतक नमूने) में वितरित किया जाता है या सेल आकार ऑप्टिकल स्लाइस (जैसे, खमीर कोशिकाओं, स्तनधारी कोशिकाओं) की मोटाई से बड़े होते हैं। 2डी विभाजन के लिए अनुभाग 4 देखें; 3D विभाजन के लिए, अनुभाग 5 देखें।

4. 2 डी छवि विश्लेषण

  1. छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर (जैसे, MATLAB) के साथ एक कार्यस्थान से लैस करें।
  2. एकल-कोशिका जन्मजात प्रतिदीप्ति हस्ताक्षरों का सेल विभाजन और पुनर्निर्माण करें.
    1. छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर खोलें।
    2. डबल-क्लिक करें और प्रदान की गई स्क्रिप्ट "Script2D.m" में से एक खोलें।
    3. संपादक टैब पर जाएँ, फिर चलाएँ क्लिक करें. कोई फ़ोल्डर चयन विंडो दिखाई देनी चाहिए.
    4. चरण 3.8 में बनाई गई निर्देशिका का चयन करें, फिर आगे बढ़ने के लिए खोलें क्लिक करें. एक संवाद बॉक्स जो विभाजन पैरामीटर के इनपुट को संकेत देता है, स्वचालित रूप से दिखाई देगा।
      नोट:: परीक्षण उद्देश्यों के लिए प्रदान किए गए डेटासेट ("Sample_2D") का चयन करें। नमूना डेटासेट एक संपीड़ित फ़ाइल के रूप में प्रदान किया जाता है और इसे पहले से निकाला जाना चाहिए।
    5. विभाजन पैरामीटर इनपुट करें: छवि Binarization की थ्रेशोल्ड (0−1) छवि Binarization के लिए = 0.45, ऊपरी थ्रेशोल्ड एक सेल क्षेत्र के लिए (पिक्सेल में) = 200, एक सेल क्षेत्र के लिए निचली थ्रेशोल्ड (पिक्सेल में) = 10, और डिटेक्टरों की संख्या = 32. आगे बढ़ने के लिए ठीक क्लिक करें.
      नोट:: इन पैरामीटर छवि गुणवत्ता के आधार पर समायोजन की आवश्यकता हो सकती है।
    6. CRM छवि प्रस्तुत करने वाली एक नई छवि विंडो दिखाई देनी चाहिए. पृष्ठभूमि घटाव के लिए उपयोग करने के लिए एक मनमाना पृष्ठभूमि क्षेत्र (यानी, क्षेत्र जहां कक्ष अनुपस्थित हैं) का चयन करें। माउस खींचकर CRM छवि के भीतर एक आयत आरेखित करें. चयन की पुष्टि करने के लिए चयनित क्षेत्र में डबल-क्लिक करें.
    7. चरण 4.2.4 में चयनित एक ही निर्देशिका में हस्ताक्षर नामक एक नई निर्देशिका ढूँढें.
      नोट:: प्रदान किया गया कोड स्वचालित रूप से इस निर्देशिका बनाता है। "हस्ताक्षर" निर्देशिका एक जनसंख्या के भीतर प्रत्येक माइक्रोबियल सेल के जन्मजात प्रतिदीप्ति हस्ताक्षर को .png फ़ाइलों के रूप में संग्रहीत करती है जो क्रमिक रूप से एक सामान्य उपसर्ग "हस्ताक्षर" के बाद गिने जाते हैं।

5.3D छवि विश्लेषण

  1. छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर (सामग्री की तालिका) के साथ एक कार्यस्थान से लैस करें।
  2. एकल-कोशिका जन्मजात प्रतिदीप्ति हस्ताक्षरों का सेल विभाजन और पुनर्निर्माण करें.
    1. छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर खोलें।
    2. डबल-क्लिक करें और प्रदान की गई स्क्रिप्ट "Script3D.m" खोलें।
    3. संपादक टैब पर जाएँ, फिर चलाएँ क्लिक करें. कोई फ़ोल्डर चयन विंडो दिखाई देनी चाहिए.
    4. चरण 3.8 में बनाई गई निर्देशिका का चयन करें, फिर आगे बढ़ने के लिए खोलें क्लिक करें. एक संवाद बॉक्स जो विभाजन पैरामीटर के इनपुट को संकेत देता है, स्वचालित रूप से दिखाई देगा.
      नोट:: परीक्षण प्रयोजनों के लिए प्रदान किए गए डेटासेट ("Sample_3D") का चयन करें। नमूना डेटासेट एक संपीड़ित फ़ाइल के रूप में प्रदान किया जाता है और इसे पहले से निकाला जाना चाहिए।
    5. विभाजन पैरामीटर इनपुट करें: छवि binarization की दहलीज (0-1) छवि binarization के लिए = 0.01, एक सेल वॉल्यूम के लिए ऊपरी थ्रेशोल्ड (पिक्सेल में) = 1,000, एक सेल क्षेत्र के लिए निचली थ्रेशोल्ड (पिक्सेल में) = 20, X पिक्सेल आकार [μm/पिक्सेल] = 0.26, Y पिक्सेल आकार [μm/पिक्सेल] = 0.26, Z पिक्सेल आकार [μm/पिक्सेल] = 0.42, और डिटेक्टरों की संख्या = 32. आगे बढ़ने के लिए ठीक क्लिक करें; एक संवाद बॉक्स जो उत्तेजना तरंग दैर्ध्य की संख्या के लिए इनपुट को संकेत देता है, दिखाई देगा।
      नोट:: इन पैरामीटर छवि गुणवत्ता के आधार पर समायोजन की आवश्यकता हो सकती है।
    6. छवि अधिग्रहण के लिए उपयोग की जाने वाली तरंग दैर्ध्य की संख्या इनपुट करें (उदाहरण के लिए, यदि 405, 488, 561, 630 का उपयोग किया जाता है, तो संवाद बॉक्स में 4 दर्ज करें)। क्लिक करें,OK.
    7. सबसे छोटे (यानी, बॉक्स नाम: उत्तेजना नंबर 1) से संवाद बक्से में सबसे लंबे समय तक तरंग दैर्ध्य के लिए एक अनुक्रम में उत्तेजना तरंग दैर्ध्य दर्ज करें। आगे बढ़ने के लिए ठीक क्लिक करें; एक नई छवि विंडो जो एक CRM छवि प्रस्तुत करती है, उसे पॉप अप करना चाहिए।
    8. पृष्ठभूमि घटाव के लिए उपयोग किए जाने वाले मनमाने ढंग से पृष्ठभूमि क्षेत्र (यानी, क्षेत्र जहां कोशिकाएं अनुपस्थित हैं) का चयन करें। माउस खींचकर CRM छवि के भीतर एक आयत आरेखित करें. चयन की पुष्टि करने के लिए चयनित क्षेत्र में डबल-क्लिक करें.
    9. चरण 5.2.4 में चयनित निर्देशिका में हस्ताक्षर नामक निर्देशिका ढूँढें.
      नोट:: प्रदान किया गया कोड स्वचालित रूप से इस निर्देशिका बनाता है। "हस्ताक्षर" निर्देशिका एक जनसंख्या के भीतर प्रत्येक एकल माइक्रोबियल सेल के जन्मजात प्रतिदीप्ति हस्ताक्षर को .png फ़ाइलों के रूप में संग्रहीत करती है जो क्रमिक रूप से एक सामान्य उपसर्ग "हस्ताक्षर" के बाद गिने जाते हैं।

6. सांख्यिकीय विश्लेषण

नोट:: सेल आबादी के हाइपरस्पेक्ट्रम के वितरण की कल्पना करने के लिए आयामी कमी तकनीक (जैसे, प्रमुख घटक विश्लेषण [पीसीए]) निष्पादित करें। प्रदान की गई स्क्रिप्ट (PCA.py) दो सेल आबादी (यानी, दो वर्गों) के लिए पीसीए निष्पादित करती है।

  1. प्रोग्रामिंग भाषा और साथ पुस्तकालयों और मॉड्यूल (सामग्री की तालिका) के साथ एक कार्यस्थान से लैस करें।
  2. C ड्राइव (या समकक्ष) में एक खाली निर्देशिका बनाएँ और निर्देशिका को "Parent_directory" नाम दें (यानी, C:/ Parent_ निर्देशिका)।
  3. दो सेल आबादी में से प्रत्येक के प्रतिदीप्ति हस्ताक्षर (उदाहरण के लिए, चरण 4.2.7 में उत्पन्न .png फ़ाइलें) को दो अलग-अलग निर्देशिकाओं में संग्रहीत करें।
    नोट:: दो निर्देशिकाएँ दोनों "Parent_directory" में स्थित होना चाहिए।

    C:/Parent_directory/
    image 12putidaKT2440/
    image 13 image 9हस्ताक्षर01.png
    image 14 image 10हस्ताक्षर02.png
    image 4 image 11:
    image 5putidaKT2442/
     image 6हस्ताक्षर01.png
     image 7हस्ताक्षर02.png
     image 8:
  4. PCA.py को "Parent_directory" में डाउनलोड करें.
  5. कार्यस्थान का कमांड लाइन इंटरफ़ेस खोलें.
  6. कमांड लाइन इंटरफ़ेस में "python C:/Parent_directory/PCA.py" टाइप करें.
  7. 'लक्ष्य निर्देशिका का चयन करें' संदेश प्रदर्शित होने के बाद "Parent_directory" का चयन करें.
  8. "C:/Parent_directory" में, "PCA.png" ढूँढें, जिसमें एक परिणामी PCA प्लॉट है।

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Representative Results

चित्रा 1A एक पारंपरिक स्पेक्ट्रम प्लॉट (शीर्ष) के रूप में और एक हीटमैप (मध्य) के रूप में प्रस्तुत एक जीवाणु सेल के विशिष्ट एकल-सेल प्रतिदीप्ति हस्ताक्षर को दर्शाता है। चित्रा 1B मिट्टी के बैक्टीरिया की आबादी की मूल सीआरएम छवि (स्यूडोमोनास पुतिडा केटी 2440)12 पर एक सटीक 2 डी सेल विभाजन के परिणाम को दर्शाता है। जनसंख्या के लिए परिणामी जन्मजात प्रतिदीप्ति हस्ताक्षर चित्र1D में एक हीटमैप के रूप में प्रस्तुत किए गए हैं। ध्यान दें कि इंट्रापॉपुलेशन परिवर्तनशीलता सफल सेल विभाजन के बाद अपेक्षाकृत मामूली थी। गलत सेल विभाजन का एक उदाहरण चित्र 1 C में दिखाया गया है, जिसे चित्र 1B में दिखाए गए अनुसार P. putida की समान आबादी पर अधिरोपित किया गया है। जनसंख्या के जन्मजात प्रतिदीप्ति हस्ताक्षरों पर गलत सेल विभाजन का प्रभाव काफी संख्या में आउटलायर्स (चित्रा 1ई, लाल त्रिकोण) से आसानी से स्पष्ट है। गलत सेल विभाजन के परिणामस्वरूप पीसीए के बाद एक लूजर क्लस्टर सटीक सेल विभाजन (चित्रा 1 एफ) के बाद प्राप्त तंग क्लस्टर की तुलना में हुआ।

आमतौर पर, intraspecies परिवर्तनशीलता के बावजूद, विभिन्न सेल प्रकारों के जन्मजात प्रतिदीप्ति हस्ताक्षर अलग-अलग क्लस्टर बनाते हैं। चित्रा 2C उपभेदों की एक टैक्सोनोमिक रूप से करीबी जोड़ी के लिए पीसीए विश्लेषण का परिणाम प्रस्तुत करता है (पी. पुतिडा तनाव KT2440 और तनाव KT244213)। प्रत्येक अलग-अलग आबादी (चित्रा 2 ए, बी) के भीतर देखी गई मामूली परिवर्तनशीलता के बावजूद, प्रत्येक आबादी ने पीसीए विश्लेषण प्लॉट (चित्रा 2 सी) पर एक अलग क्लस्टर का गठन किया।

चित्रा 3A सटीक 3 डी सेल विभाजन के परिणाम को नवोदित खमीर Saccharomyces cerevisiae YM427114 की आबादी की मूल सीआरएम छवि पर superimposed से पता चलता है. चित्रा 3B जनसंख्या के लिए परिणामी जन्मजात प्रतिदीप्ति हस्ताक्षर दिखाता है।

Figure 1
चित्र1: विभाजन और स्पष्ट intraspecies परिवर्तनशीलता की सटीकता. (A) एक जीवाणु कोशिका के विशिष्ट एकल-सेल जन्मजात प्रतिदीप्ति हस्ताक्षर (P. putida KT2440), एक स्पेक्ट्रम प्लॉट (शीर्ष) और एक गर्मी मानचित्र (मध्य) के रूप में प्रस्तुत किया गया। उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य को इंद्रधनुष रंग मानचित्र (नीचे) के रूप में इंगित किया जाता है। स्पेक्ट्रम प्लॉट की वाई अक्ष और गर्मी मानचित्र का रंग दोनों सापेक्ष प्रतिदीप्ति तीव्रता का संकेत देते हैं। नीचे की संख्याएं उत्तेजना तरंग दैर्ध्य को इंगित करती हैं। छवि विश्लेषण एल्गोरिथ्म द्वारा सटीक (बी) और गलत (सी) सेल क्षेत्र मान्यता का दृश्य प्रतिनिधित्व। हल्के नीले रंग के छायांकन मिट्टी के जीवाणु P. putida KT 2440 की आबादी के लिए पता लगाए गए सेल क्षेत्रों को इंगित करता है। पैनल सी में लाल नंबरिंग के साथ ब्लॉब्स झूठी पहचान के उदाहरण हैं, जहां एल्गोरिथ्म ने अनुचित बिनाराइजेशन थ्रेशोल्ड सेटिंग्स के कारण गैर-सेल क्षेत्रों (यानी, पृष्ठभूमि शोर) को सेल क्षेत्रों के रूप में वर्गीकृत किया है। स्केल सलाखों = 1 μm भर में. पैनल डी और ई एक ही आबादी के लिए जन्मजात प्रतिदीप्ति हस्ताक्षरों को दर्शाते हैं, जो क्रमशः सटीक और गलत सेल विभाजन के साथ उत्पन्न होते हैं। प्रत्येक स्तंभ एक पुनर्निर्मित एकल-सेल हाइपरस्पेक्ट्रम को 1 x 192 मैट्रिक्स के रूप में प्रस्तुत करता है, जहां पीले-से-नीले रंग का नक्शा सापेक्ष प्रतिदीप्ति तीव्रता को इंगित करता है। (च) पीसीए का उपयोग करके कल्पना किए गए सटीक (हल्के नीले) और गलत (लाल) विभाजनों में जन्मजात प्रतिदीप्ति हस्ताक्षरों का विचरण। प्रत्येक अक्ष लेबल घटक संख्या और पीसीए विश्लेषण में इसके संचयी प्रतिशत योगदान को दर्शाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: जन्मजात प्रतिदीप्ति हस्ताक्षरों की अंतर- और अंतर-प्रजाति परिवर्तनशीलता। जन्मजात प्रतिदीप्ति हस्ताक्षर P. putida KT2440 (A) और P. putida KT2442 (B) की आबादी के लिए गर्मी मानचित्र के रूप में प्रस्तुत किए गए हैं। (C) PCA का उपयोग करके विज़ुअलाइज़ किए गए दो जन्मजात प्रतिदीप्ति हस्ताक्षर जोड़े का प्रक्षेपण, P. putida KT2440 (लाल, n = 288) और P. putida KT2442 (नीला, n = 373) के अनुरूप है। X- और Y-अक्ष क्रमशः PC1 और PC2 का प्रतिनिधित्व करते हैं। इनसेट संख्या प्रत्येक क्लस्टर के केंद्र को इंगित करती है (1: P. putida KT2440, 2: P. putida KT2442)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: 3 डी विभाजन और जन्मजात प्रतिदीप्ति हस्ताक्षर निष्कर्षण का उदाहरण। (ए) उभरते खमीर एस cerevisiae YM4271 की सेल आबादी के रूप में मान्यता प्राप्त क्षेत्रों के 3 डी प्रक्षेपण. इनसेट नंबर पहचान संख्याएं हैं। (बी) 3 डी क्षेत्रों से निकाले गए जन्मजात प्रतिदीप्ति हस्ताक्षरों का हीट मैप। X-अक्ष संख्या पहचान संख्या से मेल खाती है. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

इस विधि में दो महत्वपूर्ण बिंदु हैं जिन्हें पुन: प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्राप्त करने के लिए बारीकी से पालन करने की आवश्यकता है: 1) माइक्रोस्कोप उद्देश्य के तहत लेजर पावर आउटपुट को उत्तेजना तरंग दैर्ध्य और प्रयोगों के माध्यम से सुसंगत रखें, और 2) सटीक सेल विभाजन करें।

विभिन्न प्रयोगों के बीच जन्मजात प्रतिदीप्ति हस्ताक्षर की तुलना करते समय पहला बिंदु विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। उत्तेजना तरंग दैर्ध्य के लिए बस एक ही "प्रतिशत आउटपुट" सेटिंग्स को लागू करने से बचें (यानी, 405, 488, 514 और 530 एनएम लेजर लाइनों के सभी के लिए 5% पावर आउटपुट का उपयोग करके), क्योंकि अधिकतम पावर आउटपुट लेजर लाइनों के बीच परिमाण के आदेश तक भिन्न हो सकता है। इसके अलावा, उद्देश्य और आंतरिक प्रकाशिकी में आमतौर पर असमान ऑप्टिकल अवशोषण विशेषताएं होती हैं, जिन्हें भी जिम्मेदार ठहराया जाना चाहिए। इन कारणों से, वास्तव में लेजर पावर मीटर (सामग्री की तालिका) का उपयोग करके उद्देश्य के तहत आउटपुट को मापने की सिफारिश की जाती है। इस माप को हर कुछ प्रयोगों, या समय-समय पर लेने की भी सिफारिश की जाती है, क्योंकि लेजर लाइनों से आउटपुट कुछ वर्षों में काफी क्षय हो सकता है।

दूसरा बिंदु, सटीक सेल विभाजन, उन स्थितियों में विशेष रूप से महत्वपूर्ण हो जाता है जहां इंट्रा- या इंटरस्पीशीज़ परिवर्तनशीलता एक चिंता का विषय है। गलत सेल विभाजन (चित्रा 1 डी) बाहरी डेटा बिंदुओं (चित्रा 1 ई, लाल त्रिकोण द्वारा इंगित) और अधिक से अधिक स्पष्ट अंतर-प्रजाति परिवर्तनशीलता में परिणाम देता है। विभाजन मापदंडों को सावधानीपूर्वक निर्धारित किया जाना चाहिए, किसी भी आगे के विश्लेषण या प्रशिक्षण मशीन लर्निंग मॉडल पर आगे बढ़ने से पहले, मूल सीआरएम छवि पर विभाजन परिणामों को ओवरलेइंग करके सेल विभाजन सटीकता की जांच करना चाहिए। यदि एक खराब गुणवत्ता वाली छवि के साथ काम कर रहा है, तो सटीक विभाजन प्राप्त करने के लिए अतिरिक्त छवि प्रसंस्करण की आवश्यकता हो सकती है। या तो एक 'गाऊसी फिल्टर' या 'माध्यिका फिल्टर' का उपयोग करके दानेदार कलाकृतियों को हटा दिया जा सकता है, और द्विपक्षीय फ़िल्टर प्रसंस्करण किसी भी धारीदार पृष्ठभूमि को काउंटर करता है।

खराब गुणवत्ता वाले प्रकाशिकी (उदाहरण के लिए, एक गैर-कॉन्फोकल ग्रेड उद्देश्य) या अपर्याप्त डिटेक्टर संवेदनशीलता के साथ, बेहोश जन्मजात प्रतिदीप्ति हस्ताक्षरों का पता लगाने से निपटना चुनौतीपूर्ण हो सकता है। ध्यान दें कि यहां और पहले 11 वर्णित सेटअप का उपयोग करके, हमें किसी भी प्रकार के सेल नमूने का सामना नहीं करना पड़ा, जिसका जन्मजात प्रतिदीप्ति एक जन्मजात प्रतिदीप्ति हस्ताक्षर के पुनर्निर्माण के लिए बहुत बेहोश था। यद्यपि उत्तेजना के लिए उच्च उत्सर्जन आउटपुट और लंबे समय तक पिक्सेल रहने के समय का उपयोग मजबूत उत्सर्जन संकेतों को प्राप्त करने के लिए किया जा सकता है, यह सेल नमूनों को नुकसान पहुंचा सकता है। उन मामलों के लिए एक संभावित समाधान जहां बेहोश जन्मजात प्रतिदीप्ति एक मुद्दा है, पृष्ठभूमि सिग्नल तीव्रता को कम करना है, उदाहरण के लिए शोरबा के बजाय बफर या सिंथेटिक मीडिया में कोशिकाओं को निलंबित करके। सेल कंटेनरों के प्रकार, जैसे कि ग्लास बॉटम डिश और माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस, इस तकनीक के लिए संगत और उपयुक्त हैं, हालांकि यहां और पिछले अध्ययन में कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए एक एगारोज़ स्लैब का उपयोग किया गया था।

confocal माइक्रोस्कोप विधि स्थानिक संकल्प और अनुयायी सेल आबादी, biofilms, और ऊतक के नमूनों के लिए सीटू विश्लेषण में प्रदान करता है। उदाहरण के लिए, इस पद्धति का एक संभावित व्यापार-बंद एक प्रवाह साइटोमीटर की तुलना में अधिकतम थ्रूपुट है। स्कैन के एक सेट के साथ कुछ सौ से एक हजार सहज प्रतिदीप्ति हस्ताक्षर एकत्र करने वाले कॉन्फोकल स्कैन का एक पूरा सेट कुछ मिनटों तक ले जा सकता है। एक प्रवाह साइटोमीटर अपने ऑप्टिकल डिजाइन के कारण कम संवेदनशील है, लेकिन संभावित रूप से परिमाण के कई आदेशों को थ्रूपुट प्राप्त कर सकता है।

एक यौगिक की सख्ती से पहचान करने के लिए जो एक जन्मजात फ्लोरोसेंट हस्ताक्षर में एक विशिष्ट चोटी के लिए जिम्मेदार है, आमतौर पर इसकी जटिल प्रकृति के कारण चुनौतीपूर्ण होता है। हालांकि, यह सुझाव दिया गया है कि विटामिन (उदाहरण के लिए, फ्लेविन एडेनिन डाइन्यूक्लियोटाइड [एफएडी]), कोएंजाइम (जैसे, निकोटिनामाइड एडेनिन डाइन्यूक्लियोटाइड [एनएडीएच]), और लिपोफ्यूसिन पिगमेंट जैसे जैविक रूप से प्रासंगिक अणुओं की एक संख्या, कोशिकाओं में प्रमुख फ्लोरोफोर हो सकती है1,16। उदाहरण के लिए, FAD में 350-450 nm के बीच एक उत्तेजना अधिकतम और लगभग 525 nm16 पर एक उत्सर्जन शिखर है। नि: शुल्क NADH में क्रमशः 340 एनएम और 460 एनएम पर एक उत्तेजना अधिकतम और उत्सर्जन शिखर होता है, हालांकि प्रोटीन-बाउंड एनएडीएच का उत्सर्जन स्पेक्ट्रा 16,17,18 में भिन्न होता है। लिपोपिगमेंट्स जो तनावग्रस्त या वृद्ध कोशिकाओं के साथ जुड़ने के लिए जाने जाते हैं, उनमें एक व्यापक उत्तेजना सीमा (350-500 एनएम) और उत्सर्जन सीमा (450-600 एनएम) 16,18 होती है।

सीआरएम का उपयोग सेल रूपरेखा की पहचान करने के लिए जानकारी का एक स्वतंत्र स्रोत प्रदान करता है और इसलिए सीआरआईएफ का एक और महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करता है: 3 डी स्पेस में वितरित व्यक्तिगत कोशिकाओं से प्रतिदीप्ति संकेतों का चयनात्मक निष्कर्षण। यह एक पूरे माइक्रोबियल कॉलोनी या एक थोक संस्कृति निलंबन की प्रतिदीप्ति विशेषताओं के पारंपरिक विश्लेषण से एक कदम आगे का प्रतिनिधित्व करता है, जो मध्यम घटकों, स्रावित चयापचयों और बाह्य कोशिकीय मैट्रिक्स से गैर-सेल संकेतों से दूषित कोशिकाओं की एक विशाल संख्या से संकेतों का एक औसत मिश्रण है।  एकल-सेल जन्मजात प्रतिदीप्ति हस्ताक्षरों का विश्लेषण बरकरार कोशिकाओं की शारीरिक स्थिति के पूर्वानुमानित लक्षण वर्णन की अनुमति देता है, जो सेल के वितरण और शारीरिक स्थिति के अस्थायी विकास को हल करने के लिए एक संभावित समाधान प्रदान करता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस अध्ययन को जापान के शिक्षा, संस्कृति, खेल और प्रौद्योगिकी मंत्रालय (18K04843) से वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए अनुदान-सहायता द्वारा भाग में समर्थित किया गया था, जो कि JST ERATO (JPMJER1502) से N. Nomura के लिए Y. Yawata को दिया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Wako Chemicals 312-01193
Beam splitters Carl Zeiss, Nikon MBSInVis405, MBS458, MBS488, MBS458/514, MBS488/543, or MBS 488/543/633 beam splitters (Carl Zeiss)
Confocal microscope Carl Zeiss, Nikon Model LSM 880 (Carl Zeiss), Model A1R (Nikon)
Cover slips Matsunami Glass C024601
Glass slides Matsunami Glass S011120
Half-reflection mirror Carl Zeiss, Nikon NT80/20
Laser power meter Thorlabs PM400 (power meter console) and S175C (sensor)
LB Broth Nacalai tesque 20066-95 For bacteria culture
Image analysis software The MathWorks MATLAB version 2019a or later, Image Processing Toolbox is needed
Microscope objective Carl Zeiss, Nikon 440762-9904 e.g. 63x plan Apochomat NA = 1.4 (Carl Zeiss)
Microscope software Carl Zeiss, Nikon ZEN (Carl Zeiss),NIS-elements (Nikon)
PBS(-) Wako Chemicals 166-23555
Programming language Python and libraries, modules (numpy, scikit-learn, scikit-image, os, glob, matplotlib, tkinter) are rquired to run the supplied PCA script.
Silicone gasket ThermoFisher Scientific P24744
Workstation A high-performance workstation with discrete GPUs is recommended.
Yeast extract-peptone-dextrose (YPD) agar medium Sigma-Aldrich Y1500-250G For yeast culture
YPD medium Sigma-Aldrich Y1375-250G

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References

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जीव विज्ञान अंक 159 confocal माइक्रोस्कोपी स्पेक्ट्रोस्कोपी autofluorescence एकल सेल विश्लेषण जन्मजात प्रतिदीप्ति confocal प्रतिबिंब माइक्रोस्कोपी confocal microspectroscopy माइक्रोबायोलॉजी टैग मुक्त विश्लेषण न्यूनतम इनवेसिव विश्लेषण
Confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा एकल सेल जन्मजात प्रतिदीप्ति हस्ताक्षर का पुनर्निर्माण
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Hirayama, T., Takabe, K., Kiyokawa,… More

Hirayama, T., Takabe, K., Kiyokawa, T., Nomura, N., Yawata, Y. Reconstruction of Single-Cell Innate Fluorescence Signatures by Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (159), e61120, doi:10.3791/61120 (2020).

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