Induzione della lesione completa del midollo spinale di tipo transezione nei topi

Summary

Questo protocollo descrive come creare una laminectomia precisa per l’induzione di lesioni stabili del midollo spinale di tipo transezione nel modello del topo, con danni collaterali minimi per la ricerca sulle lesioni del midollo spinale.

Abstract

La lesione del midollo spinale (SCI) porta in gran parte a una perdita irreversibile e permanente della funzione, più comunemente a causa di un trauma. Diverse opzioni di trattamento, come i metodi di trapianto di cellule, sono in fase di ricerca per superare le disabilità debilitanti derivanti dallo SCI. La maggior parte degli studi precli clinici sugli animali sono condotti in modelli di roditori di SCI. Mentre i modelli di ratti SCI sono stati ampiamente utilizzati, i modelli di topi hanno ricevuto meno attenzione, anche se i modelli di topi possono avere vantaggi significativi rispetto ai modelli di ratti. Le piccole dimensioni dei topi equivalgono a costi di manutenzione degli animali inferiori a quelli dei ratti e la disponibilità di numerosi modelli di topi transgenici è vantaggiosa per molti tipi di studi. Indurre lesioni ripetibili e precise negli animali è la sfida principale per la ricerca SCI, che nei piccoli roditori richiede un intervento chirurgico ad alta precisione. Il modello di lesione di tipo trasezione è stato un modello di lesione comunemente usato nell’ultimo decennio per la ricerca terapeutica basata sui trapianti, tuttavia non esiste un metodo standardizzato per indurre una lesione completa del tipo di transezione nei topi. Abbiamo sviluppato un protocollo chirurgico per indurre una lesione completa del tipo di trasezione nei topi C57BL/6 a livello vertebrale toracico 10 (T10). La procedura utilizza un piccolo trapano a punta al posto dei rongeurs per rimuovere con precisione la lamina, dopo di che viene utilizzata una lama sottile con tagliente arrotondato per indurre la transezione del midollo spinale. Questo metodo porta a lesioni riproducibili di tipo trasezione nei piccoli roditori con danni muscolari e ossei collaterali minimi e quindi riduce al minimo i fattori confondenti, in particolare dove vengono analizzati i risultati funzionali comportamentali.

Introduction

La lesione del midollo spinale (SCI) è un problema medico complesso che si traduce in drastici cambiamenti nella salute e nello stile di vita. Non esiste una cura per SCI e la fisiopatologia di SCI non è compresa a fondo. I modelli Animal SCI, in particolare i modelli di roditori, offrono uno strumento inestimabile per la sperimentazione di nuovi trattamenti e sono stati utilizzati per esplorare SCI per decenni. Ad oggi, oltre il 72% degli studi SCI preclitici ha utilizzato modelli di ratto, rispetto a un solo 16% che ha utilizzato topi¹. Sebbene i ratti, a causa delle loro maggiori dimensioni e della tendenza a formare cavità simili alle SIC umane, siano stati tradizionalmente gli animali modello preferiti per lo studio di nuovi approcci terapeutici, i topi (compresi molti modelli di topi transgenici) sono ora utilizzati più frequentemente per studiare i meccanismi cellulari e molecolari dello SCI². Il modello di topo offre ulteriori vantaggi in termini di una manipolazione più semplice, tassi riproduttivi più rapidi e costi inferiori rispetto ai ratti; i topi mostrano anche un alto grado di somiglianza genomica con^{l’uomo 1,2,3}. Il principale svantaggio del modello di topo è stato identificato come la dimensione significativamente più piccola che crea sfide per gli interventi chirurgici per la creazione e il trattamento delle lesioni del midollo^{spinale 4,5}.

C’è una lacuna nella letteratura esistente che evidenzia la necessità di un protocollo chirurgico robusto e riproducibile per indurre SCI stabile nel modello di mouse. Pertanto, forniamo un approccio chirurgico nuovo e preciso in questo protocollo per superare questi limiti. Questo protocollo fornisce linee guida approfondite per indurre una lesione di tipo transezione nei topi, poiché questo tipo di lesione è stato riconosciuto come il più appropriato per studiare i cambiamenti rigenerativi e degenerativi a seguito di una^{lesione 6,}nonché la neuroplasticità, i circuiti neurali e l’ingegneria tissutale^{si avvicinano a 7}. Abbiamo scelto di indurre la lesione nella regione toracica inferiore, poiché il livello toracico SCI è usato più comunemente nella letteratura¹.

Protocol

Tutte le procedure sono state eseguite con l’approvazione del Griffith University Animal Ethics Committee (ESK/04/16 AEC e MSC/04/18 AEC) sotto le linee guida del National Health and Medical Research Council of Australia. 1. Procedura di set-up animale per l’intervento chirurgico Anestetizza e stabilizza l’animale. Utilizzare topi C57BL/6 femmina di 8-10 settimane. Utilizzare il 5% di isoflurane in 1 L/min di ossigeno per l’induzione dell’anestesia. Per il mantenimento dell’a…

Representative Results

Il metodo risultante, illustrato nella figura 1, comporta un’adeguata stabilizzazione del topo (Figura 1A) e una buona visualizzazione della colonna vertebrale e del tessuto paraspinoso (Figura 1B). Il processo spinoso e le laminae possono essere chiaramente visualizzati con una dissezione muscolare minima e perdita di sangue(Figura 1C,zona evidenziata). La foratura della punta fine viene eseguita come …

Discussion

Questo metodo induce una lesione completa del tipo di trasezione a livello vertebrale T10 nei topi, che si traduce in una paraplegia completa dell’animale, al di sotto del livello di lesione. Nel complesso, questo metodo si traduce in sanguinamento minimo, danni collaterali trascurabili e una lesione stabile e riproducibile. Rispetto ai metodi di trasezione precedentemente pubblicati senza laminectomia¹⁰, questo metodo offre i vantaggi in termini di visualizzazione diretta senza manipolare la curv…

Materials

Baytril injectable 50 mg/mL, 50 mL	Provet	BAYT I	Post-operative care drug
Betadine 500 mL	Provet	BETA AS	Consumable
Castroviejo needle holder, locking	ProSciTech	T149C	Reusable
Ceramic zirconia blade, round with sharp sides, single edge, angled	ProSciTech	TXD101A-X	Reusable
Cotton swabs (5pcs)	Multigate	21-893	Consumable
Dremel Micro	DREMEL	8050-N/18	Cordless rotary tool
Dressing forceps fine	Multigate	06-306	Single use disposable
Drill bits	Kemmer Präzision	SM 32 M 0550 070	Reusable
Dumont #7b forceps	Fine Science Tools	11270-20	Reusable
Dumont tweezers, style 5	ProSciTech	T05-822	Reusable
Fur trimmer	WAHL	WA9884-312	Zero Overlap Hair Trimmer
Iris scissors, Ti, sharp tips, straight, 90mm	ProSciTech	TY-3032	Reusable
Isoflurane isothesia NXT 250	Provet	ISOF 00 HS	Anaesthetic agent
Colibri Retractor – 4cm	Fine Science Tools	17000-04	Reusable
Scalpel handle	ProSciTech	T133	Reusable
Signature latex surgical gloves size 7.5	Medline	MSG5475	Consumable
Sodium Chloride 0.9%	STS	PHA19042005	Consumable
Sterile Dressing Pack	Multigate	08-709	Single use disposable
Sterile Fluid Impervious Drape 60×60 cm	Multigate	29-220	Single use disposable
Surgical spirit 100 mL	Provet	# SURG SP	Consumable
Suture Material – SILK BLK 45CM 5/0 FS-2	Johnson & Johnson Medical	682G	Silk Suture
Suture Material – Vicryl 70CM 5-0 S/A FS-2	Johnson & Johnson Medical	VCP421H	Vicryl Suture
Temgesic 0.3 mg in 1 mL, x 5 ampoules (class S8 drug)	Provet	TEMG I	Post-operative care drug