Induksjon av fullstendig transeksjon-type ryggmargsskade hos mus

Summary

Denne protokollen beskriver hvordan man lager en presis laminektomi for induksjon av stabil transeksjonstype ryggmargsskade i musemodellen, med minimal sikkerhet skade for ryggmargsskade forskning.

Abstract

Ryggmargsskade (SCI) fører i stor grad til irreversibel og permanent tap av funksjon, oftest som følge av traumer. Flere behandlingstilbud, som celletransplantasjonsmetoder, undersøkes for å overvinne de ødeleggende funksjonshemningene som oppstår fra SCI. De fleste prekliniske dyrestudier utføres i gnagermodeller av SCI. Mens rottemodeller av SCI har blitt mye brukt, har musemodeller fått mindre oppmerksomhet, selv om musemodeller kan ha betydelige fordeler fremfor rottemodeller. Den lille størrelsen på mus tilsvarer lavere vedlikeholdskostnader for dyr enn for rotter, og tilgjengeligheten av mange transgene musemodeller er en fordel for mange typer studier. Indusere repeterbar og presis skade hos dyrene er den primære utfordringen for SCI forskning, som i små gnagere krever høy presisjon kirurgi. Transeksjonstypeskademodellen har vært en vanlig skadetamodell det siste tiåret for transplantasjonsbasert terapeutisk forskning, men en standardisert metode for å indusere en fullstendig transeksjonstypeskade hos mus eksisterer ikke. Vi har utviklet en kirurgisk protokoll for å indusere en fullstendig transeksjonstypeskade hos C57BL/6-mus på thorax vertebral nivå 10 (T10). Prosedyren bruker en liten spiss drill i stedet for rongeurs å nøyaktig fjerne lamina, hvorav et tynt blad med avrundet cutting edge brukes til å indusere ryggmargen transeksjon. Denne metoden fører til reproduserbar transeksjonstypeskade hos små gnagere med minimal sikkerhet muskel- og beinskade og minimerer derfor forvirrende faktorer, spesielt der atferdsmessige funksjonelle resultater analyseres.

Introduction

Ryggmargsskade (SCI) er et komplekst medisinsk problem som resulterer i drastiske endringer i helse og livsstil. Det er ingen kur for SCI, og patofysiologien til SCI er ikke grundig forstått. Animal SCI-modeller, spesielt gnagermodeller, tilbyr et uvurderlig verktøy for å prøve nye behandlinger, og har blitt brukt til å utforske SCI i flere tiår. Hittil har over 72% av prekliniske SCI-studier ansatt rottemodeller, sammenlignet med bare 16% som har brukt mus¹. Selv om rotter, på grunn av deres større størrelse og tendens til å danne hulrom beslektet med menneskelige SCIer, tradisjonelt har vært den foretrukne modellen dyr for å studere nye terapeutiske tilnærminger, mus (inkludert mange transgene musemodeller) blir nå brukt oftere for å studere cellulære og^{molekylære mekanismer}i SCI 2 . Musemodellen gir ekstra fordeler når det gjelder enklere håndtering, raskere reproduktive priser og lavere kostnader enn rotter; mus viser også en høy grad av genomisk likhet med mennesker^1,2,3. Den største ulempen med musemodellen har blitt identifisert som den betydelig mindre størrelsen som skaper utfordringer for kirurgiske inngrep for å skape og behandle ryggmargsskader^4,5.

Det er et gap i den eksisterende litteraturen som understreker behovet for en robust og reproduserbar kirurgisk protokoll for å indusere stabil SCI i musemodellen. Derfor gir vi en ny og presis kirurgisk tilnærming i denne protokollen for å overvinne disse begrensningene. Denne protokollen gir dyptgående retningslinjer for å indusere en transeksjon-type skade hos mus, da denne skadetypen har blitt anerkjent for å være den mest hensiktsmessige å studere regenerative og degenerative endringer etter en skade⁶, samt nevroplastisitet, nevrale kretser og vevsteknikk tilnærminger⁷. Vi har valgt å indusere skaden i den nedre thoraxregionen, siden thoraxnivå SCI brukes oftest i litteraturen¹.

Protocol

Alle prosedyrer ble utført med godkjenning av Griffith University Animal Ethics Committee (ESK/04/16 AEC og MSC/04/18 AEC) i henhold til retningslinjene til National Health and Medical Research Council of Australia. 1. Prosedyre for dyreforsøk for operasjonen Bedøve og stabilisere dyret. Bruk 8–10 uker gamle kvinnelige C57BL/6 mus. Bruk 5 % isofluran i 1 l/min oksygen til induksjon av anestesi. For vedlikehold av anestesi, bruk 1,5–2 % isofluran i 1 l/min oksygen. Bekr…

Representative Results

Den resulterende metoden som avbildet i figur 1, innebærer tilstrekkelig stabilisering av musen (figur 1A) og god visualisering av ryggraden og paraspinous vev (Figur 1B). Spinøs prosess og laminae kan tydelig visualiseres med minimal muskelspisseksjon og blodtap (figur 1C, uthevet sone). Boringen av finspiss utføres som vist i figur 1D, for å lage et laminektomivindu s…

Discussion

Denne metoden induserer en fullstendig transeksjonstypeskade på T10 vertebralnivå hos mus, noe som resulterer i fullstendig paraplegi av dyret, under skadenivået. Samlet sett resulterer denne metoden i minimal blødning, ubetydelig sikkerhet skade og en stabil, reproduserbar skade. Sammenlignet med tidligere publiserte metoder for transeksjon uten laminektomi¹⁰, tilbyr denne metoden fordelene når det gjelder direkte visualisering uten å manipulere krumningen i ryggraden, bedre kontroll over f…

Materials

Baytril injectable 50 mg/mL, 50 mL	Provet	BAYT I	Post-operative care drug
Betadine 500 mL	Provet	BETA AS	Consumable
Castroviejo needle holder, locking	ProSciTech	T149C	Reusable
Ceramic zirconia blade, round with sharp sides, single edge, angled	ProSciTech	TXD101A-X	Reusable
Cotton swabs (5pcs)	Multigate	21-893	Consumable
Dremel Micro	DREMEL	8050-N/18	Cordless rotary tool
Dressing forceps fine	Multigate	06-306	Single use disposable
Drill bits	Kemmer Präzision	SM 32 M 0550 070	Reusable
Dumont #7b forceps	Fine Science Tools	11270-20	Reusable
Dumont tweezers, style 5	ProSciTech	T05-822	Reusable
Fur trimmer	WAHL	WA9884-312	Zero Overlap Hair Trimmer
Iris scissors, Ti, sharp tips, straight, 90mm	ProSciTech	TY-3032	Reusable
Isoflurane isothesia NXT 250	Provet	ISOF 00 HS	Anaesthetic agent
Colibri Retractor – 4cm	Fine Science Tools	17000-04	Reusable
Scalpel handle	ProSciTech	T133	Reusable
Signature latex surgical gloves size 7.5	Medline	MSG5475	Consumable
Sodium Chloride 0.9%	STS	PHA19042005	Consumable
Sterile Dressing Pack	Multigate	08-709	Single use disposable
Sterile Fluid Impervious Drape 60×60 cm	Multigate	29-220	Single use disposable
Surgical spirit 100 mL	Provet	# SURG SP	Consumable
Suture Material – SILK BLK 45CM 5/0 FS-2	Johnson & Johnson Medical	682G	Silk Suture
Suture Material – Vicryl 70CM 5-0 S/A FS-2	Johnson & Johnson Medical	VCP421H	Vicryl Suture
Temgesic 0.3 mg in 1 mL, x 5 ampoules (class S8 drug)	Provet	TEMG I	Post-operative care drug