Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

बैक्टीरियल केराटाइटिस के खिलाफ दवा उपचार का अध्ययन करने के लिए एक पोर्सिन पूर्व वीवो कॉर्निया मॉडल की स्थापना

Published: May 12, 2020 doi: 10.3791/61156
Automatic Translation
1,2, 3, 4, 1,5, 3, 1,6, 1,7, 1,2
1Sheffield Collaboratorium for Antimicrobial Resistance and Biofilms (SCARAB), University of Sheffield, 2Department of Chemical and Biological Engineering, University of Sheffield, 3Hyderabad Eye Research Foundation, L V Prasad Eye Institute, 4Health Economics and Decision Science, School of Health and Related Research, University of Sheffield, 5Department of Molecular Biology and Biotechnology, University of Sheffield, 6Department of Materials Science and Engineering, University of Sheffield, 7Department of Infection, Immunity and Cardiovascular Disease, University of Sheffield

Summary

यह लेख बैक्टीरियल केराटिटिस के एक पूर्व वीवो पोर्सिन मॉडल स्थापित करने के लिए एक कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। स्यूडोमोनास एरुगिनोसा का उपयोग प्रोटोटीपिक जीव के रूप में किया जाता है। यह अभिनव मॉडल वीवो संक्रमण में नकल करता है क्योंकि बैक्टीरियल प्रसार कॉर्नियल ऊतक को नुकसान पहुंचाने के लिए जीवाणु की क्षमता पर निर्भर करता है।

Abstract

उपन्यास रोगाणुरोधी विकसित करते समय, पशु परीक्षणों की सफलता वीवो में इन विट्रो परीक्षणों से पशु संक्रमण तक एंटीमाइक्रोबियल प्रभावकारिता के सटीक एक्सपेरिमेंट पर निर्भर करती है। मौजूदा इन विट्रो परीक्षण आमतौर पर एंटीमाइक्रोबियल प्रभावकारिता को अधिक आंकते हैं क्योंकि प्रसार बाधा के रूप में मेजबान ऊतक की उपस्थिति का हिसाब नहीं है। इस अड़चन को दूर करने के लिए, हमने एक प्रोटोटीपिक जीव के रूप में स्यूडोमोनास एरुगिनोसा का उपयोग करके बैक्टीरियल केराटिटिस का एक पूर्व वीवो पोर्सिन कॉर्नियल मॉडल विकसित किया है। यह लेख संक्रमण की स्थापना के लिए पोर्सिन कॉर्निया और प्रोटोकॉल की तैयारी का वर्णन करता है। बेस्पोक ग्लास मोल्ड संक्रमण अध्ययन के लिए कॉर्निया के सीधे सेटअप को सक्षम करते हैं। मॉडल वीवो संक्रमण में नकल करता है क्योंकि बैक्टीरियल प्रसार कॉर्नियल ऊतक को नुकसान पहुंचाने के लिए जीवाणु की क्षमता पर निर्भर करता है। संक्रमण की स्थापना व्यवहार्य प्लेट गिनती के माध्यम से मूल्यांकन कॉलोनी बनाने इकाइयों की संख्या में वृद्धि के रूप में सत्यापित किया जाता है। परिणाम प्रदर्शित करते हैं कि संक्रमण को यहां वर्णित विधि का उपयोग करके पूर्व वीवो कॉर्निया में अत्यधिक प्रजनन योग्य फैशन में स्थापित किया जा सकता है। इस मॉडल को भविष्य में पी एरुगिनोसाके अलावा अन्य सूक्ष्मजीवों के कारण केराटिटिस की नकल करने के लिए बढ़ाया जा सकता है । मॉडल का अंतिम उद्देश्य वीवो संक्रमण में अधिक प्रतिनिधि परिदृश्य में जीवाणु संक्रमण की प्रगति पर एंटीमाइक्रोबियल कीमोथेरेपी के प्रभाव की जांच करना है। ऐसा करने में, यहां वर्णित मॉडल परीक्षण के लिए जानवरों के उपयोग को कम करेगा, नैदानिक परीक्षणों में सफलता दर में सुधार करेगा और अंततः क्लिनिक में उपन्यास रोगाणुरोधी का तेजी से अनुवाद सक्षम करेगा।

Introduction

कॉर्नियल संक्रमण अंधापन के महत्वपूर्ण कारण हैं और कम और मध्य आय वाले देशों में महामारी के अनुपात में होते हैं। रोग की एटियोलॉजी क्षेत्र से क्षेत्र में भिन्न होती है लेकिन बैक्टीरिया इन मामलों में से अधिकांश के लिए खाते हैं। स्यूडोमोनास एरुगिनोसा एक महत्वपूर्ण रोगजनक है जो तेजी से प्रगतिशील बीमारी का कारण बनता है। कई मामलों में, रोगियों को स्ट्रोमल जख्म, अनियमित astigmatism के साथ छोड़ दिया जाता है, प्रत्यारोपण की आवश्यकता होती है या सबसे खराब स्थिति में, एक आंख1,2खो देते हैं ।

पी एरुगिनोसा के कारण बैक्टीरियल केराटाइटिस विशेष रूप से पी एरुगिनोसाके एंटीमाइक्रोबियल प्रतिरोधी उपभेदों के बढ़ते उद्भव के कारण इलाज करने के लिए एक कठिन आंख संक्रमण है। पिछले दशक के भीतर, यह स्पष्ट हो गया है कि सामान्य रूप से कॉर्नियल संक्रमणों के लिए नए उपचारों का परीक्षण और विकास, और विशेष रूप से स्यूडोमोनास एसपी की वजह से, एंटीबायोटिक प्रतिरोध3में वर्तमान प्रवृत्ति का मुकाबला करने के लिए आवश्यक हैं।

कॉर्नियल संक्रमणों के लिए नए उपचारों की प्रभावकारिता का परीक्षण करने के लिए, पारंपरिक इन विट्रो माइक्रोबायोलॉजिकल विधियां प्रयोगशाला संस्कृति के दौरान और वीवो में संक्रमण के साथ-साथ मेजबान इंटरफेस4,5की कमी के कारण बैक्टीरियल फिजियोलॉजी में अंतर के कारण एक खराब सरोगेट हैं। वीवो पशु मॉडल में, हालांकि, महंगे, समय लेने वाले हैं, केवल प्रतिकृति की एक छोटी संख्या प्रदान कर सकते हैं और पशु कल्याण के बारे में चिंताएं बढ़ा सकते हैं।

इस लेख में, हम केराटिटिस के एक सरल और प्रजनन योग्य ऑर्गेनोटिपिक एक्स वीवो पोर्सिन मॉडल प्रदर्शित करते हैं जिसका उपयोग तीव्र और पुराने संक्रमणों के लिए विभिन्न उपचारों का परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है। हमने इस प्रयोग के लिए पी एरुगिनोसा का उपयोग किया है लेकिन मॉडल अन्य बैक्टीरिया और कवक और खमीर जैसे जीवों के साथ भी अच्छी तरह से काम करता है जो केराटिटिस का कारण बनते हैं।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

घर कार्यालय अनुमोदित प्रोटोकॉल के तहत अन्य नियोजित प्रायोगिक कार्य के लिए प्रयोगशाला में एल्बिनो प्रयोगशाला खरगोशों की बलि दी गई थी। उन अध्ययनों में प्रयोगात्मक उपयोग के लिए आंखों की आवश्यकता नहीं थी इसलिए उनका उपयोग इस प्रोटोकॉल के लिए किया गया था।

1. नसबंदी

  1. महत्वपूर्ण कदम: आसुत पानी में डिस्टेल के 5% (v/v) समाधान में 1 घंटे के लिए भिगोने से सभी संदंश और कैंची को कीटाणुरहित करें, ब्रश से साफ करें, नल के पानी से कुल्ला करें और न्यूनतम 2 घंटे के लिए 185 डिग्री सेल्सियस पर ओवन में स्टरलाइज करें।
  2. 15 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर ऑटोक्लेविंग द्वारा अन्य सभी ग्लासवेयर और रिएजेंट्स को स्टरलाइज करें या निर्माता के निर्देशों के अनुसार रिएजेंट तैयार करें। द्वितीय श्रेणी के माइक्रोबायोलॉजी सुरक्षा कैबिनेट में निम्नलिखित प्रक्रियाओं को पूरा करें।

2. नमूना संग्रह

  1. पोर्सिन आंखों का संग्रह
    1. बड़े सफेद लैंडरेस बोता है, एक हैंपशायर सूअर के साथ एक क्रॉस का इस्तेमाल किया गया था। जानवर बिजली के करंट से दंग रह गए और आंखों को 2 घंटे बाद बूचड़खाने में ही बदल दिया गया ।
    2. महत्वपूर्ण कदम: एक बार enucleated, एक बाँझ फॉस्फेट बफर खारा (PBS) समाधान में प्रयोगशाला के लिए आंखों को स्थानांतरित करने के लिए उंहें बाहर सुखाने से रोकने के लिए और उंहें तुरंत आने पर प्रक्रिया ।
  2. खरगोश आंखों का संग्रह
    1. कॉर्निया को एक्साइज कर बाँझ पीबीएस में लैब में भेजें।

3. कॉर्नियोस्कलल बटन की तैयारी

  1. आंखों की पुतली के आसपास के ऊतकों को पकड़ने और इसे पेट्री डिश में स्थानांतरित करने के लिए बाँझ संदंश का उपयोग करें। स्केलपेल ब्लेड नंबर 15 और संदंश का उपयोग कर पेट्री डिश पर आंखों की पुतली के चारों ओर कंजक्टिवा और मांसपेशी ऊतक निकालें।
  2. धीरे से आंखों की पुतली उठा, जबकि संदंश के साथ ऑप्टिक तंत्रिका पकड़ और बाँझ PBS से भरा एक ०.५ एल जार को स्थानांतरित ।
  3. एक बार जब सभी आंखें आसपास के ऊतकों से साफ हो जाती हैं, तो उन्हें बाँझ संदंश का उपयोग करके पीबीएस में 3% (v/v) पोविडोन आयोडीन से भरे एक और 0.5 एल जार में ले जाएं और 1 मिनट के लिए छोड़ दें।
  4. बाँझ पीबीएस के साथ एक और 0.5 एल जार करने के लिए आंखों हस्तांतरण।
  5. एक पेट्री डिश पर अभी भी आंख पकड़ने के लिए संदंश का उपयोग करें और एक स्केलपेल ब्लेड नहीं 10A के साथ कॉर्निया के पास एक कट बनाते हैं।
  6. महत्वपूर्ण कदम: कटौती के किनारे पकड़ो और कॉर्निया के आसपास के लगभग 3 मिमी स्क्लेरा छोड़ने के लिए कैंची का उपयोग करें। सुनिश्चित करें कि कैंची का तेज अंत आईरिस या कोरॉयड ऊतक को छेदता नहीं है और सुपरा-कोरॉयडल स्पेस में है।
  7. संदंश के साथ कॉर्नियोस्कल बटन पकड़ो और यूवील ऊतक को धीरे-धीरे अलग करने के लिए नुकीले अंत संदंश की एक और जोड़ी का उपयोग करें।
  8. शेष ग्लोब से कॉर्नियोस्लील बटन उठाएं और 12 अच्छी प्लेट में पीबीएस में 1.5% (v/v) पोविडोन आयोडीन समाधान में संक्षेप में कुल्ला करें।
  9. बाँझ पीबीएस से भरी एक और 12 अच्छी तरह से प्लेट में कॉर्नियोस्कल बटन रखें।
  10. सभी आंखों को संसाधित करने के बाद(एक बैच में अधिकतम 40 आंखों की सिफारिश की),प्रत्येक कॉर्नियोस्कल बटन को एक व्यक्तिगत पेट्री डिश (34 मिमी व्यास) एपिथेलियल साइड अप में रखें और संस्कृति माध्यम के 3 एमएल में डालें पूर्व-गर्म 37 डिग्री सेल्सियस तक।
    नोट: संस्कृति माध्यम की संरचना इस प्रकार है: Dulbecco संशोधित ईगल के माध्यम (DMEM): हैम [1:1] 5 μg∙mL-1इंसुलिन और 10 एनजी∙mL-1 एपिडर्मल विकास कारक (EGF), के साथ पूरक 10% (v/v) भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस), १०० यू∙एमएल-1 पेनिसिलिन, १०० यू∙एमएल-1स्ट्रेप्टोमाइसिन और २.५ माइक्रोन∙एमएल-1 एम्फोटेरिसिन बी । एक वैकल्पिक चरण के रूप में, आगे के इनक्यूबेशन चरणों के दौरान उत्पादित कॉर्निया की सूजन को रोकने के लिए माध्यम को50 ग्राम∙एल-1 डेक्सट्रान के साथ पूरक किया जा सकता है।
  11. एक आर्द्रीकृत ऊतक संस्कृति इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।

4. कॉर्नियोस्लील बटन का रखरखाव

  1. 24 घंटे के बाद, मीडिया को हटाने के लिए aseptic तकनीक का उपयोग करें और एंटीबायोटिक दवाओं युक्त ताजा पूर्व गरम संस्कृति मीडिया के 3 एमएल के साथ बदलें । कॉर्निया को कीटाणुरहित करने के लिए 48 घंटे के लिए एंटीबायोटिक दवाओं के साथ मीडिया में कॉर्नियोस्कल बटन रखें। एक आर्द्रीकृत ऊतक संस्कृति इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
  2. महत्वपूर्ण कदम: 48 घंटे के बाद, मीडिया को हटा दें और पीबीएस के 2 एमएल के साथ कॉर्निया कुल्ला करें। फिर ऊतक से अवशिष्ट एंटीबायोटिक दवाओं को हटाने के लिए, प्रायोगिक संक्रमण से तीन दिन पहले कम से कम दो या आदर्श रूप से एंटीबायोटिक-मुक्त मीडिया में कॉर्नियोस्कल बटन रखें।
  3. एक आर्द्रीकृत ऊतक संस्कृति इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट। इन तीन दिनों के भीतर कम से कम एक बार मीडिया बदलें। यदि एंटीबायोटिक मुक्त माध्यम में कोई टर्बिडिटी विकसित होती है तो कॉर्निया त्यागें।

5. एक इनोकुलम की तैयारी

  1. एक फोम डाट के साथ एक 50 एमएल शंकु फ्लास्क में पौंड शोरबा के 10 एमएल डालो।
  2. पी एरुगिनोसा तनाव PAO1 की एक कॉलोनी स्थानांतरित करें या एक ताजा आगर प्लेट से PA14 तनाव और 3-4 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट जब तक बैक्टीरिया मध्य लॉग चरण में हैं ।
  3. बैक्टीरिया की संस्कृति को 50 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें और 5 मिनट के लिए 3,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज करें। सुपरनेट निकालें और पीबीएस में सेल पैलेट को फिर से निलंबित करें।
  4. कोशिकाओं को धोने के लिए दो बार कदम 5.3 दोहराएं। पीबीएस में सेल पेलेट को फिर से निलंबित करें और 600 एनएम पर ऑप्टिकल घनत्व को खाली के रूप में बाँझ पीबीएस का उपयोग करके लगभग 0.6 पर समायोजित करें।

6. कॉर्नियोस्लील बटन को संक्रमित करना

  1. पेट्री डिश से मीडिया निकालें और बाँझ PBS के 1 मिलील के साथ दो बार कॉर्निया कुल्ला ।
  2. बीच-बीच में कॉर्निया पकड़े हुए धीरे-धीरे संदंश निचोड़ें। चार कटौती करने के लिए 10A स्केलपेल का उपयोग करें - दो ऊर्ध्वाधर, दो क्षैतिज - एपिथेलियल परत के माध्यम से कॉर्नियोस्केरल बटन के केंद्रीय खंड में अंतर्निहित स्ट्रोमा तक।
  3. एक बाँझ ग्लास मोल्ड को 6-अच्छी प्लेट में विस्तृत भाग के साथ रखें और कॉर्निया को ग्लास मोल्ड के बीच में रखें, एपिथेलियम साइड नीचे का सामना करना पड़ रहा है। कांच मोल्ड के नीचे के हिस्से के केंद्र में कट सही बनाओ।
  4. महत्वपूर्ण कदम: कॉर्निया के साथ पूरी तरह से ग्लास मोल्ड को भरने के लिए डीएमईएम में भंग 1% (w/v) कम पिघलने वाले बिंदु एगर के 1 एमसीएल डालें।
  5. एगर को सेट करने दें और फिर ग्लास मोल्ड को उलट दें ताकि कॉर्नियल एपिथेलियम ऊपर की ओर आ जाए।
  6. ऑड600एनएम = 0.6 के साथ बैक्टीरियल संस्कृति का पिपेट 15 माइक्रोन (पी एरुगिनोसा के लिए यह लगभग 1 x 10 7 कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों(सीआईएफयू) के बराबर है 15 माइक्रोन में सीधे एक कट क्षेत्र में और फिर कॉर्न एपिसेलियम को नमी रखने के लिए शीर्ष पर पीबीएस के 85 μL जोड़ें। इनोकुलम के लिए कॉलोनी बनाने इकाइयों की गिनती करने के लिए आगर पर शेष जीवाणु संस्कृति और प्लेट को पतला करें।
  7. ग्लास मोल्ड के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से नीचे एंटीबायोटिक दवाओं के बिना डीएमईएम के 1 एमसीएल जोड़ें। 24 घंटे तक 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर आर्द्रीकृत इनक्यूबेटर में संक्रमित कॉर्नियोस्केरल बटन के साथ 6-वेल प्लेट को इनक्यूबेट करें।
  8. हर प्रयोग के साथ असंक्रमित नियंत्रण कॉर्निया स्थापित करें। असंक्रमित नियंत्रण स्थापित करने के लिए, चरण 6.6 में बैक्टीरियल संस्कृति के 15 माइक्रोन को बाँझ पीबीएस के साथ बदलें।

7. बैक्टीरिया फसल के लिए कॉर्निया का समरूपीकरण

  1. डीएमईएम माध्यम को 6 वेल प्लेट के नीचे से त्यागें और कुएं के नीचे कुल्ला करने के लिए बाँझ पीबीएस का 1 मिलीएल जोड़ें।
  2. कॉर्नियोस्कलल बटन के मध्य भाग को छुए बिना पाइपिंग करके पीबीएस को धीरे से हटा दें। बाँझ संदंश का उपयोग कर कांच की अंगूठी निकालें और यह 5% Distel में जगह है।
  3. धीरे से पीबीएस के 1 एमएल के साथ कॉर्नियोस्लील बटन के शीर्ष को दो बार कुल्ला [वैकल्पिक]।
  4. कॉर्नियोस्कलल बटन के किनारे को बारीक टिप संदंश के साथ पकड़ें और नीचे एगर से अलग करें।
  5. कॉर्निया को पीबीएस की बर्फ ठंड 1-2 एमएल से भरी 50 एमएल ट्यूब में ट्रांसफर करें।
  6. संक्रमित कॉर्निया के शीर्ष को सरासर करने के लिए एक ठीक टिप समरूप का उपयोग करें। ऊतक को पूरी तरह से तरल नहीं होना चाहिए। होमोजेनाइजर कॉर्नियल एपिथेलियम और कट एरिया से बैक्टीरिया को अलग करने में मदद करता है।
  7. भंवर सामग्री मिश्रण करने के लिए कुछ सेकंड के लिए PBS में कॉर्निया।
  8. पीबीएस के 180 माइक्रोन में समरूप के 20 माइक्रोन जोड़ें और 96 अच्छी प्लेट में सीरियल कमजोर करते हैं।
  9. क्रमिक रूप से निलंबन को 10-4 और 10-5 कमजोर पड़ने और रक्त आगर प्लेट पर बैक्टीरिया के साथ पतला समरूप के 10 माइक्रोन को पतला करें। 8 घंटे के लिए थाली इनक्यूबेट और CFU की संख्या गिनती। रोगाणुरोधी के प्रभाव का परीक्षण करते समय, उचित कमजोर पड़ने वाला कारक प्रायोगिक रूप से आ जाना चाहिए।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ग्लास मोल्ड्स का डिजाइन एक अभिनव और मूल विचार है, जिसके उपयोग ने हमें संदूषण के साथ न्यूनतम/कोई मुद्दा नहीं के साथ एक सुसंगत फैशन में मॉडल स्थापित करने की अनुमति दी । सांचों को शेफील्ड विश्वविद्यालय में एक ग्लास ब्लोअर द्वारा एक डिजाइन(चित्रा 1A)के आधार पर तैयार किया गया था। प्रायोगिक सेटअप कॉर्निया के उत्तल आकार को बनाए रखता है और एपिथेलियम के शीर्ष पर बैक्टीरिया रखता है जहां संक्रमण होता है(चित्र 1बी)।

पोर्सिन कॉर्निया आमतौर पर मध्यम में कुछ दिनों के बाद फूल जाता है। यह सामान्य है और हमने पाया कि डेक्सट्रान के अलावा और बिना कॉर्निया के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था, जिसे आमतौर पर कॉर्निया(चित्रा 1H)की सूजन को रोकने के लिए जोड़ा जाता है। कॉर्निया आमतौर पर बैक्टीरिया एपिथेलियम में प्रवेश करने में मदद करने के लिए घायल होते हैं। हालांकि घायल (कट) और बिना घाव (अनकट) कॉर्निया के बीच संक्रमण की प्रगति में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था, हमने अनकट कॉर्निया(चित्रा 1C)में प्रतिकृति के बीच अधिक भिन्नताएं देखीं। पीबीएस के साथ दो बार कॉर्निया धोने से अतिरिक्त बैक्टीरिया निकल जाते हैं जो एपिथेलियम से अटैच नहीं होते थे। पी एरुगिनोसा PAO1 से संक्रमित धोया और अधुन पोर्सिन कॉर्निया के बीच 24 घंटे(चित्रा 1D)के लिए एक महत्वपूर्ण अंतर था । PA14 और PAO1(चित्रा 1ई, 1F)से संक्रमित पोर्सिन और खरगोश कॉर्निया के बीच CFU गिनती में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था । दोनों मॉडलों के परिणाम प्रजनन योग्य थे। 24 घंटे के बाद, या तो स्यूडोमोनास तनाव से संक्रमित कॉर्निया हमेशा अस्पष्टता विकसित करता है और असंक्रमित कॉर्निया(चित्रा 1G)की तुलना में कट क्षेत्र अधिक दृश्यमान और खुला हो जाताहै।

Figure 1
चित्रा 1: पूर्व वीवो कॉर्निया स्यूडोमोनास एरुगिनोसा सेसंक्रमित । (क)कॉर्निया के आकार को बनाए रखने और बैक्टीरिया और उपचार की शुरूआत को सुविधाजनक बनाने के लिए उपयोग किए जाने वाले ग्लास मोल्ड की योजनाबद्ध तस्वीर। कांच के सांचों की मोटाई 1.5 मिमी होती है और यह बोरोसिलिकेट ग्लास से बने टेस्ट ट्यूब की मोटाई के समान होती है। (ख)प्रायोगिक स्थापित की योजनाबद्ध तस्वीर । (ग)समरूपता के बाद अंतिम सीएलयू गिनती पर घायल होने के प्रभाव का परीक्षण । अनकट (एन = 16) और कट (एन = 28) कॉर्निया पी एरुगिनोसा PAO1 और पी एरुगिनोसा PA14 से 24 घंटे के लिए संक्रमित थे । होमोजेनाइजेशन से पहले कॉर्निया को पीबीएस के 1 एमएल से धोया गया था। त्रुटि सलाखों मानक विचलन का संकेत मिलता है। (घ)पीबीएस (एन = 6) के 2 x 1 एमएल के साथ कॉर्निया धोने के प्रभाव का परीक्षण और 24 घंटे के लिए पी एरुगिनोसा PAO1 के साथ संक्रमण के बाद अंतिम सीएलयू गिनती पर धोने (एन = 6) नहीं । त्रुटि सलाखों मानक विचलन का संकेत मिलता है। (ई) पी एरुगिनोसा PAO1 और पी एरुगिनोसा PA14 से संक्रमित पोर्सिन कॉर्निया में अंतिम सीएलयू गिनती 24 घंटे (एन = 10) के लिए । कॉर्निया को धोया गया और काटा गया। त्रुटि सलाखों मानक विचलन का संकेत मिलता है। (एफ)24 घंटे के लिए पी एरुगिनोसा PAO1 और पी एरुगिनोसा PA14 से संक्रमित खरगोश कॉर्निया में अंतिम सीएलयू गिनती (एन = 6) । कॉर्निया को धोया गया और काटा गया। त्रुटि सलाखों मानक विचलन का संकेत मिलता है। (जी) पी एरुगिनोसा PAO1 से संक्रमित पूर्व वीवो पोर्सिन कॉर्निया की तस्वीरें 24 घंटे के लिए । नियंत्रण घायल हो गया था लेकिन कोई बैक्टीरिया नहीं जोड़ा गया । संक्रमित कॉर्निया घायल हो गए और १०७ सीएलयू को कट साइड में जोड़ा गया । कंट्रोल कॉर्निया से कोई सीएलयू बरामद नहीं हुआ । (ज) अंतिम सीएलयू ने डेक्सट्रान (एन = 2) और डेक्सट्रान (एन = 9) के बिना इलाज किए गए कॉर्निया से पी एरुगिनोसा PAO1 के साथ संक्रमण के 24 घंटे बाद बरामद किया । कॉर्निया को धोया गया और काटा गया। त्रुटि सलाखों मानक विचलन का संकेत मिलता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

पूर्व वीवो पोर्सिन कॉर्निया का उपयोग करके इस केराटिटिस मॉडल के विकास के पीछे मुख्य चालक शोधकर्ताओं को प्रीक्लिनिकल चरणों में एंटीमाइक्रोबियल प्रभावकारिता को अधिक सटीक रूप से निर्धारित करने के लिए विट्रो मॉडल में एक प्रतिनिधि के साथ उपन्यास एंटीमाइक्रोबिल्स विकसित करना है। यह पूर्व नैदानिक चरणों में दवा डिजाइन और निर्माण पर नए रोगाणुरोधी अधिक नियंत्रण विकसित करने में शामिल शोधकर्ताओं को प्रदान करेगा, नैदानिक परीक्षणों में सफलता में वृद्धि, लक्षित अध्ययन को सक्षम करके जानवरों के उपयोग को कम करने और क्लिनिक के लिए नए रोगाणुरोधी के तेजी से अनुवाद में परिणाम ।

कई अध्ययनों में विभिन्न जानवरों से पूर्व वीवो कॉर्निया पर संक्रमण के प्रभाव की जांच की गई है जैसे: खरगोश6,कुत्ता7,बकरी8 और सूअर9,10, 11। इनमें से अधिकांश अध्ययन6 को स्थापित करने और संक्रमण की कल्पना करने के तरीकों पर ध्यान केंद्रित करते हैं , लेकिन अभी तक केवल कुछ प्रकाशनों में दवा परीक्षण और बैक्टीरिया के सटीक मात्राकरण पर ध्यान केंद्रित किया गया है6,7,8,12.

हमारे मॉडल का प्राथमिक लाभ खाद्य श्रृंखला के हिस्से के रूप में पोर्सिन कॉर्निया की उपलब्धता है। इसलिए पूर्व वीवो पोर्सिन कॉर्निया का उपयोग 3Rs के सिद्धांत के साथ संरेखित होता है, जो मेजबान इंटरफेस का प्रतिनिधि मॉडल प्रदान करते हुए अनुसंधान में जानवरों के उपयोग को बदलना, परिष्कृत और कम करना है। यदि प्रोटोकॉल का कड़ाई से पालन किया जाता है तो हमने कॉर्नियल एक्सप्लांट के संदूषण के साथ कोई समस्या नहीं देखी है । कांच के मोल्ड विशेष उपकरणों के लिए किसी भी आवश्यकता के बिना उपयोग करने के लिए बहुत आसान, त्वरित और सरल हैं। शीर्ष पर संकीर्ण अंगूठी एक परीक्षण दवा (100 माइक्रोल) या बैक्टीरिया की एक छोटी मात्रा के अलावा सुविधाजनक बनाता है। ग्लास मोल्ड की अंगूठी पीबीएस को बैक्टीरिया या दवा के घोल के साथ कॉर्निया के मध्य भाग में बनाए रखने की अनुमति देती है और बैक्टीरिया को कॉर्निया के नीचे होने से रोकती है। अंगूठी को साफ और स्टरलाइज करना आसान है, और संक्रमण के दौरान कॉर्निया के शीर्ष पर होने वाले परिवर्तनों के अवलोकन की अनुमति देता है। फ्लोरोसेंटी-टैग किए गए बैक्टीरिया के उपभेदों का उपयोग संक्रमण की कल्पना करने या फ्लोरोसेंट कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके ऊतक में संक्रमण के प्रसार की मात्रा निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। पूरे कॉर्निया को हिस्टोलॉजी या इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के लिए आगे संसाधित किया जा सकता है।

प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम चिह्नित किए गए हैं। सफल संक्रमण सुनिश्चित करने के लिए प्रोटोकॉल को अंजाम देते समय इन कदमों पर अतिरिक्त ध्यान दिया जाना चाहिए । प्रोटोकॉल के भीतर सबसे महत्वपूर्ण कदम यह सुनिश्चित कर रहे हैं कि कॉर्निया को तैयारी के दौरान संक्रमण को रोकने के लिए पर्याप्त एंटीबायोटिक दवाओं के साथ इलाज किया जाता है और फिर इस मामले में पी एरुगिनोसाको संक्रमित जीव की शुरुआत से पहले एंटीबायोटिक दवाओं को पर्याप्त रूप से समाप्त कर दिया जाता है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके प्रयोगों की स्थापना करते समय, कुछ उदाहरणों में, एंटीबायोटिक-मुक्त माध्यम में इनक्यूबेशन के दौरान टर्बिडिटी विकसित हुई। यह टर्बिडिटी एंटीबायोटिक मुक्त माध्यम में सूक्ष्मजीवों के विकास का संकेत था। यह एंटीबायोटिक दवाओं का उपयोग कर या हैंडलिंग के दौरान संदूषण के कारण कॉर्निया के अधूरे उपचार के कारण हो सकता है। इन कॉर्निया को आगे के प्रयोगों के लिए आगे नहीं ले जाया गया और उन्हें छोड़ दिया गया । एंटीबायोटिक मुक्त माध्यम में कॉर्निया इनक्यूबेटिंग जब इनक्यूबेटर के विकास से बचा गया था इनक्यूबेटर में लगातार नसबंदी रन को नियोजित करके, एक फिल्टर के साथ डिस्पोजेबल पिपेट युक्तियों का उपयोग करके और पोर्सिन आंखों से कॉर्निया को उत्तेजित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले उपकरणों को स्टरलाइज करते समय पर्याप्त देखभाल की जाती है। एक और महत्वपूर्ण कदम है जब कॉर्निया संक्रमण से पहले कांच मोल्ड में रखा जाता है। ग्लास मोल्ड कॉर्निया के उत्तल आकार को बनाए रखने में सक्षम बनाता है। कॉर्निया की उत्तलता या तो संक्रमित खुराक या कॉर्निया की सतह पर चिकित्सीय एजेंट को बनाए रखने के लिए एक चुनौती है। इसलिए, कॉर्निया और ग्लास मोल्ड के बीच पर्याप्त सील की उपस्थिति सुनिश्चित करना आवश्यक है। जब कॉर्निया और ग्लास मोल्ड के बीच पर्याप्त सील होती है, तो मोल्ड के ऊपर की अंगूठी संरचना संक्रमित खुराक या चिकित्सीय एजेंट को बनाए रखने के लिए एक जलाशय बनाती है। डीएमईएम एगर के साथ ग्लास मोल्ड के विस्तृत खंड को पूरी तरह से भरकर एक पर्याप्त सील सुनिश्चित की जाती है।

जैसा कि किसी भी मॉडल के मामले में है, वर्णित पूर्व वीवो पोर्सिन कॉर्निया मॉडल से जुड़ी सीमाएं हैं। यहां वर्णित मॉडल कॉर्निया में आंसू फिल्म की संरचना, प्रवाह और भरपाई की नकल नहीं करता है। पलक झपकते ही प्रदान की गई यांत्रिक कार्रवाई को भी मॉडल में शामिल नहीं किया गया है। साहित्य में समझौता है कि फिल्म रचना और गतिशीलता आंसू, और निमिष महत्वपूर्ण रक्षा तंत्र है कि आंख13से विदेशी कणों और सूक्ष्मजीवों को दूर कर रहे हैं । दरअसल, मॉडल में एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का भी अभाव है जो वीवो में संक्रमण के दौरान शुरू होता है। यह संभावना है कि इन रक्षा तंत्रों की उपस्थिति में वीवो में संक्रमण की प्रगति यहां वर्णित पूर्व वीवो मॉडल में देखी गई है। इन सीमाओं के बावजूद, पूर्व वीवो पोर्सिन कॉर्नियल मॉडल दो मुख्य कारणों से मौजूदा और उभरते रोगाणुरोधी की प्रभावशीलता का परीक्षण करने के लिए प्रासंगिक है: 1) पूर्व वीवो मॉडल में बैक्टीरिया का शरीर विज्ञान वीवो स्थितियों में नकल करता है क्योंकि जीवाणु प्रसार कॉर्नियल ऊतक को नुकसान पहुंचाने की उनकी क्षमता पर निर्भर करता है, और 2) मॉडल में तीन आयामी ऊतकों को चिकित्सीय के लिए प्रसार बाधा के रूप में शामिल किया गया है। इसलिए, पूर्व वीवो मॉडल रोगाणुरोधी संवेदनशीलता परीक्षण के लिए पारंपरिक तकनीकों पर लाभप्रद है।

यहां वर्णित पूर्व वीवो पोर्सिन कॉर्निया मॉडल का उपयोग बैक्टीरिया, कवक और खमीर के विभिन्न उपभेदों का अध्ययन करने के लिए भी किया जा सकता है जो केराटाइटिस का कारण बनते हैं। यह पूर्व वीवो कॉर्निया मॉडल प्रजनन योग्य है और वीवो मॉडल के विपरीत थोड़े समय के भीतर प्रतिकृति उत्पन्न करने की अनुमति देता है। पीबीएस के बजाय, कृत्रिम आंसू या मेजबान प्रतिरक्षा रक्षा कोशिकाओं सैद्धांतिक रूप से लाइव परिदृश्य की नकल करने के लिए जोड़ा जा सकता है । कॉर्निया सूअरों की एक ही नस्ल से प्राप्त कर रहे हैं और के बारे में 21-23 सप्ताह पुराने जब वध। इसलिए, मानव शवों से प्राप्त लोगों की तुलना में प्रतिकृति के बीच कम परिवर्तनशीलता है। बायोमेडिकल अनुप्रयोगों के लिए पोर्सिन पूर्व वीवो कॉर्निया मॉडल का उपयोग करने की अवधारणा ने पिछले कुछ वर्षों के भीतर मानव आंखों में जैविक समानता के कारण अधिक लोकप्रियता प्राप्त की है जो इस मॉडल की तुलना करना आसान बनाता है। 15 ,16या सूखी आंखों के लिए एक मॉडल के रूप में 15,16 या घाव भरने18 के लिए पोर्सिन कॉर्निया का उपयोग करने में रुचि बढ़ गई है ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक चेस्टरफील्ड में इलियट बूचड़खाने को पोर्सिन आंखें उपलब्ध कराने के लिए धन्यवाद देना चाहेंगे । ग्लास रिंग्स शेफील्ड यूनिवर्सिटी के केमिस्ट्री विभाग से ग्लास ब्लोअर डैन जैक्सन ने हमारे डिजाइन के आधार पर बनाए थे । लेखक वित्तपोषण के लिए चिकित्सा अनुसंधान परिषद (एमआर/एस004688/1) का शुक्रिया अदा करना चाहेंगे । लेखक कॉर्निया तैयार करने के साथ तकनीकी मदद के लिए श्रीमती शानाली डिकवेला का भी शुक्रिया अदा करना चाहेंगे । लेखकों को चित्रों स्वरूपण के साथ मदद के लिए श्री जोनाथन एमरी शुक्रिया अदा करना चाहते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
50 mL Falcon tube SLS 352070
Amphotericin B Sigma A2942
Cellstar 12 well plate Greiner Bio-One 665180
Dextran Sigma 31425-100mg-F
Distel Fisher Scientific 12899357
DMEM + glutamax SLS D0819
Dual Oven Incubator SLS OVe1020 Sterilising oven
Epidermal growth factor SLS E5036-200UG
F12 HAM Sigma N4888
Foetal calf serum Labtech International CA-115/500
Forceps Fisher Scientific 15307805
Handheld homogeniser 220 Fisher Scientific 15575809 Homogeniser
Heracell VIOS 160i Thermo Scientific 15373212 Tissue culture incubator
Heraeus Megafuge 16R VWR 521-2242 Centrifuge
Insulin, recombinant Human SLS 91077C-1G
LB agar Sigma L2897
Multitron Infors Not appplicable Bacterial incubator
PBS SLS P4417
Penicillin-Streptomycin SLS P0781
Petri dish Fisher Scientific 12664785
Petri dish 35x10mm CytoOne Starlab CC7672-3340
Povidone iodine Weldricks pharmacy 2122828
Safe 2020 Fisher Scientific 1284804 Class II microbiology safety cabinet
Scalpel blade number 15 Fisher Scientific O305
Scalpel Swann Morton Fisher Scientific 11849002

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vazirani, J., Wurity, S., Ali, M. H. Multidrug-Resistant Pseudomonas aeruginosa Keratitis Risk Factors, Clinical Characteristics, and Outcomes. Ophthalmology. 122 (10), 2110-2114 (2015).
  2. Sharma, S. Keratitis. Bioscience Reports. 21 (4), 419-444 (2001).
  3. Sharma, G., et al. Pseudomonas aeruginosa biofilm: Potential therapeutic targets. Biologicals. 42 (1), 1-7 (2014).
  4. Ersoy, S. C., et al. Correcting a Fundamental Flaw in the Paradigm for Antimicrobial Susceptibility Testing. EBioMedicine. 20, 173-181 (2017).
  5. Kubicek-Sutherland, J. Z., et al. Host-dependent Induction of Transient Antibiotic Resistance: A Prelude to Treatment Failure. EBioMedicine. 2 (9), 1169-1178 (2015).
  6. Pinnock, A., et al. Ex vivo rabbit and human corneas as models for bacterial and fungal keratitis. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 255 (2), 333-342 (2017).
  7. Harman, R. M., Bussche, L., Ledbetter, E. C., Van de Walle, G. R. Establishment and Characterization of an Air-Liquid Canine Corneal Organ Culture Model To Study Acute Herpes Keratitis. Journal of Virology. 88 (23), 13669-13677 (2014).
  8. Madhu, S. N., Jha, K. K., Karthyayani, A. P., Gajjar, D. U. Ex vivo Caprine Model to Study Virulence Factors in Keratitis. Journal of Ophthalmic & Vision Research. 13 (4), 383-391 (2018).
  9. Vermeltfoort, P. B. J., van Kooten, T. G., Bruinsma, G. M., Hooymans, A. M. M., vander Mei, H. C., Busscher, H. J. Bacterial transmission from contact lenses to porcine corneas: An ex vivo study. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (6), 2042-2046 (2005).
  10. Duggal, N., et al. Zinc oxide tetrapods inhibit herpes simplex virus infection of cultured corneas. Molecular Vision. 23, 26-38 (2017).
  11. Brothers, K., et al. Bacterial Impediment of Corneal Cell Migration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (7), (2015).
  12. Alekseev, O., Tran, A. H., Azizkhan-Clifford, J. Ex vivo Organotypic Corneal Model of Acute Epithelial Herpes Simplex Virus Type I Infection. Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).
  13. Sack, R. A., Nunes, I., Beaton, A., Morris, C. Host-Defense Mechanism of the Ocular Surfaces. Bioscience Reports. 21 (4), 463-480 (2001).
  14. Kunzmann, B. C., et al. Establishment of a porcine corneal endothelial organ culture model for research purposes. Cell and Tissue Banking. 19 (3), 269-276 (2018).
  15. Oh, J. Y., et al. Processing Porcine Cornea for Biomedical Applications. Tissue Engineering Part C-Methods. 15 (4), 635-645 (2009).
  16. Shi, W. Y., et al. Protectively Decellularized Porcine Cornea versus Human Donor Cornea for Lamellar Transplantation. Advanced Functional Materials. 29, 1902491-1902503 (2019).
  17. Menduni, F., Davies, L. N., Madrid-Costa, D., Fratini, A., Wolffsohn, J. S. Characterisation of the porcine eyeball as an in-vitro model for dry eye. Contact Lens & Anterior Eye. 41 (1), 13-17 (2018).
  18. Castro, N., Gillespie, S. R., Bernstein, A. M. Ex vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies. Journal of Visualized Experiments. (144), (2019).

Tags

इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 159 स्यूडोमोनास एरुगिनोसा,केराटिटिस कॉर्निया पूर्व वीवो आंख पोर्सिन
बैक्टीरियल केराटाइटिस के खिलाफ दवा उपचार का अध्ययन करने के लिए एक पोर्सिन पूर्व वीवो कॉर्निया मॉडल की स्थापना
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Okurowska, K., Roy, S., Thokala, P., … More

Okurowska, K., Roy, S., Thokala, P., Partridge, L., Garg, P., MacNeil, S., Monk, P. N., Karunakaran, E. Establishing a Porcine Ex Vivo Cornea Model for Studying Drug Treatments against Bacterial Keratitis. J. Vis. Exp. (159), e61156, doi:10.3791/61156 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter