建立猪外维沃角膜模型研究药物治疗细菌性角膜炎

Summary

本文描述了建立细菌性角膜炎前活体猪模型的分步协议。 伪多莫纳斯阿鲁吉诺萨 被用作原型生物体。这种创新模式模仿体内感染，因为细菌的增殖取决于细菌破坏角膜组织的能力。

Abstract

在开发新型抗菌药物时，动物试验的成功取决于从体外试验到体内动物感染的抗菌效果的准确推断。现有的体外测试通常高估了抗菌效能，因为主机组织作为扩散屏障的存在没有被考虑在内。为了克服这一瓶颈，我们开发了一种细菌性角膜炎的前活体猪角膜模型，使用 伪多莫纳斯阿鲁吉诺萨 作为原型生物体。本文描述了猪角膜的准备和建立感染的协议。定制玻璃模具可直接设置角膜用于感染研究。该模型模拟体内感染，因为细菌增殖取决于细菌损害角膜组织的能力。感染的建立被证实为通过可行的板数评估的殖民地形成单位数量的增加。结果表明，使用此处描述的方法，可以在前体角膜中以高度可重复的方式建立感染。该模型可以在未来扩展，以模拟角膜炎引起的微生物以外的 P.阿鲁吉诺萨。该模型的最终目标是研究抗菌化疗对细菌感染进展的影响，在更能代表体内感染的情况下。通过这样做，这里描述的模型将减少动物用于测试，提高临床试验的成功率，并最终使新型抗菌素快速翻译到诊所。

Introduction

角膜感染是致盲的重要原因，在低收入和中等收入国家流行。这种疾病的病因因地区而异，但细菌占这些病例的绝大多数。伪多莫纳斯阿鲁吉诺萨是导致一种快速进步的疾病的重要病原体。在许多情况下，患者留下频闪疤痕，不规则的散光，需要移植或在最坏的情况下，失去一只眼睛^1，2。

由 P.aeruginosa 引起的细菌性角膜炎是一种难以治疗的眼睛感染，特别是由于抗微生物药物耐药菌 株的日益出现。在过去十年中，很明显，测试和开发新的治疗角膜感染的方法，一般来说，特别是那些由 伪多莫纳斯 sp.引起的，对于对抗抗生素耐药性³的当前趋势至关重要。

为了测试角膜感染新疗法的疗效，传统的体外微生物方法是一种糟糕的替代方法，因为在实验室培养期间和在体内感染期间细菌生理学的差异，以及由于缺乏宿主接口^4，5。然而，体内动物模型昂贵、耗时，只能提供少量的复制品，并引起人们对动物福利的担忧。

在本文中，我们展示了一个简单和可重复的角膜炎体外猪模型，可用于测试急性和慢性感染的各种治疗方法。我们已经使用 P.aeruginosa 进行这个实验，但模型也与其他细菌，以及生物体，如真菌和酵母，导致角膜炎运作良好。

Protocol

白化病实验室的兔子被牺牲在实验室里，根据内政部批准的协议进行其他计划中的实验工作。这些研究不需要眼睛进行实验性使用，因此它们用于此协议。

1. 绝育

1. 关键步骤：在蒸馏水中浸泡 1 小时（v/v/v） Distel 溶液，用刷子清洁，用自来水冲洗，并在 185 °C 的烤箱中消毒，至少 2 小时，对所有钳子和剪刀进行消毒。
2. 通过在 121 °C 下自动拍击 15 分钟或根据制造商的指示准备试剂，对所有其他玻璃器皿和试剂进行消毒。在 II 类微生物安全柜中执行以下程序。

2. 样本收集

1. 猪眼的集合
   1. 大型白色陆地赛母猪，一个十字架与汉普郡野猪被使用。动物们被电流惊呆了，眼睛在2小时后在屠宰场被细胞核化了。
   2. 关键步骤：一旦电子核化，将眼睛转移到实验室在无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液，以防止他们干涸，并在抵达后立即处理他们。
2. 兔子眼的集合
   1. 将角膜消费税化，然后用无菌PBS送到实验室。

3. 角膜硬膜按钮的准备

1. 使用无菌钳子握住眼球周围的组织，并将其转移到培养皿中。使用 15 号手术刀刀片和钳子取出培养皿上的眼球周围的结膜和肌肉组织。
2. 轻轻抬起眼球，同时用钳子握住视神经，转移到一个装满无菌PBS的0.5L罐子里。
3. 一旦所有的眼睛都清除了周围的组织，用无菌钳子将它们转移到另一个0.5升罐中，里面装满了PBS中3%（v/v）的多维酮碘，然后离开1分钟。
4. 将眼球转移到另一个带有无菌 PBS 的 0.5 L 罐子上。
5. 使用钳子将眼睛静止在培养皿上，并用没有 10A 的手术刀刀片在角膜附近切开。
6. 关键步骤：抓住切口的边缘，用剪刀切除角膜，在角膜周围留下大约3毫米的硬膜。确保剪刀的锐端不会刺穿虹膜或胆囊组织，并处于超胆囊空间。
7. 用钳子按住角膜硬化按钮，然后使用另一对尖端钳子轻轻地分离子宫组织。
8. 将角膜硬化按钮从剩余的球体中提起，并在 12 个井板中的 PBS 中短暂冲洗 1.5% （v/v） povidone 碘溶液。
9. 将角膜硬盘按钮放入另一个充满无菌 PBS 的 12 个井板中。
10. 处理完所有眼睛（建议一批最多40只眼睛），将每个角膜硬化按钮放在单个培养皿（直径34毫米）上部，倒入3mL的培养介质预热至37°C。
    注：培养介质的组成如下：杜尔贝科的改良鹰的介质（DMEM）：哈姆的[1：1]辅以5微克^∙mL-1胰岛素和10∙mL-1表皮生长因子（EGF），1 10% （v/v） 胎儿小腿血清 （FCS）， 100 U∙mL^-1青霉素， 100 U∙mL^{- 1}链霉素和 2.5 μg∙mL^{- 1}安非他明 B.作为可选步骤，可补充50克^∙L-1德克斯特兰，以防止在进一步的孵化步骤中切除角膜肿胀。
11. 在加湿组织培养孵化器中以37°C孵化。

4. 角膜硬性按钮的维护

1. 24小时后，使用无菌技术去除介质，代之以含有抗生素的3mL新鲜预热培养物。用抗生素将角膜硬性按钮放在介质中48小时，对角膜进行消毒。在加湿组织培养孵化器中以37°C孵化。
2. 关键步骤： 48 小时后， 取出介质， 用 2 ml 的 Pbs 冲洗角膜。然后在无抗生素介质中将角膜硬化按钮保存至少两天或理想情况下，在实验感染前三天，从组织中取出残留的抗生素。
3. 在加湿组织培养孵化器中以37°C孵化。在这三天内至少再更换一次媒体。如果无抗生素介质中出现任何浊度，请丢弃角膜。

5. 准备接种

1. 用泡沫塞将 10 毫升 LB 汤倒入 50 毫升圆锥形烧瓶中。
2. 将一群 P.阿鲁吉诺萨 菌株PAO1或菌株PA14从新鲜的醋板中转移，在37°C下孵育3-4小时，直到细菌处于中日志阶段。
3. 将细菌培养转移到 50 mL 管和离心机中，3，000 x g，5 分钟。取出超常剂并重新悬浮 PBS 中的细胞颗粒。
4. 重复步骤 5.3 两次来清洗细胞。重新悬挂PBS中的细胞颗粒，并将光学密度调整为600nm至0.6左右，使用无菌PBS作为空白。

6. 感染角膜硬膜按钮

1. 从培养皿中取出介质，用 1 mL 无菌 PBS 冲洗角膜两次。
2. 轻轻挤压钳子，同时夹住中间的角膜。使用 10A 手术刀在角膜硬化按钮的中心部分（通过上皮层到底层频闪）进行四次切割（两次垂直，两次水平）。
3. 将无菌玻璃模具放在一个6井板中，宽部分向上，并将角膜放在玻璃模具中间，上皮侧朝下。在玻璃模具底部的中心进行切割。
4. 关键步骤： 倒 1 毫升 1% （w/v） 低熔点琼脂溶解在 DMEM 中， 以完全填充玻璃模具角膜。
5. 让琼脂设置，然后倒置玻璃模具，使角膜上皮朝上。
6. 带 OD_600nm = 0.6 的细菌培养物的移液器 15 μL（对于 P. aeruginosa 来说，这相当于大约 1 x 10⁷ 菌落形成单位 （CFU） 在 15 μL 中直接进入切割区域，然后将 85 μL 的 PBS 添加到顶部以保持角膜上皮湿润。稀释阿加上剩余的细菌培养和板，以计数菌落形成单位的培养。
7. 加入1毫升的DMEM没有抗生素到每个井的底部与玻璃模具。在 37 °C 的加湿孵化器中用受感染的角膜硬化按钮孵化 6 井板，5% CO₂ 可长达 24 小时。
8. 在每个实验旁边设置未受感染的对照角膜。要建立未受感染的控制，在步骤 6.6 中用无菌 PBS 替换 15 μL 的细菌培养。

7. 角膜的同质化以收获细菌

1. 从 6 井板底部丢弃 DMEM 介质，并添加 1 mL 的无菌 PBS 冲洗井底。
2. 通过管道轻轻取出 PBS，而无需触摸角膜硬性按钮的中心部分。使用无菌钳子取出玻璃环，并将其放置在 5% Distel 中。
3. 用 1 mL 的 PBS 轻轻冲洗角膜硬化按钮的顶部两次 [可选] 。
4. 用细尖钳按住角膜硬化按钮的边缘，并将其从下面的琼脂中分离。
5. 将角膜转移到一个50 mL管充满了冰冷1-2 mL的PBS。
6. 使用精细的尖端同质化剂来纯粹的受感染角膜的顶部。组织不必完全液化。同质化剂有助于将细菌从角膜上皮和切口区域分离。
7. 在PBS中将角膜漩涡几秒钟以混合内容。
8. 将 20μL 的同质物添加到 180μL 的 PBS 中，并在 96 井板中执行串行稀释。
9. 连续稀释悬架至^10-4 和^10-5 稀释和移液器10μL的稀释同质细菌到血糖板。孵化板8小时，并计算CFU的数量。在测试抗菌素的效果时，必须通过实验得出适当的稀释因子。

Representative Results

玻璃模具的设计是一个创新和原创的想法，其使用使我们能够建立模型在一致的方式与最小的/没有污染的问题。这些模具是由谢菲尔德大学的玻璃鼓风机根据设计（图1A）制备的。实验设置保持角膜的凸形，并将细菌保存在发生感染的上皮上部（图1B）上。

猪角膜通常在中等的几天后膨胀。这是正常的，我们发现角膜之间没有显著的区别，没有添加德克斯特兰，这通常是为防止角膜肿胀（图1H）而添加的。角膜通常受伤，以帮助细菌穿透上皮。虽然受伤（切口）和未切割（未切割）角膜之间的感染进展没有显著差异，但我们注意到未切割角膜（图1C）的复制品之间存在更多差异。用PBS洗两次角膜可以去除不附着在上皮上的多余的细菌。24小时（图1D）中感染P.阿鲁吉诺萨PAO1的洗过和未洗过的猪角膜在CFU方面有显著差异。感染 PA14 和 PAO1 的猪角膜和兔角膜的 CFU 计数没有显著差异（图 1E，1F）。两种型号的结果都是可重复的。24小时后，感染假角膜菌株的角膜总是发育不透明，与未受感染的角膜（图1G）相比，切口区域变得更加明显和开放。

图1：感染 伪多莫纳斯阿鲁吉诺萨的外体角膜。（A） 用于维持角膜形状和促进细菌引入和治疗的玻璃模具的示意图图片。玻璃模具的厚度为 1.5 mm，与用牛酸盐玻璃制成的试管的厚度相同。（B） 实验设置的示意图。（C） 测试同质化后伤人对最终CFU计数的影响。未切割 （n = 16） 和切口 （n = 28） 角膜感染了 P. 阿鲁吉诺萨 PAO1 和 P. 阿鲁吉诺萨 PA14 24 小时。角膜在均质化前用 1 mL 的 PBS 洗净。错误条表示标准偏差。（D） 测试用2×1 mL的PBS（n = 6）清洗角膜的效果，并在感染 P.aeruginosa PAO1后24小时内不清洗（n =6）。错误条表示标准偏差。（E） 感染 P. 阿鲁吉诺萨 PAO1 和 P. 阿鲁吉诺萨 PA14 的猪角膜的最终 CFU 计数为 24 小时 （n = 10）。角膜被洗净和切开。错误条表示标准偏差。（F） 感染 P.阿鲁吉诺萨 PAO1和 P.阿鲁吉诺萨 PA14的兔子角膜的最终CFU计数为24小时（n =6）。角膜被洗净和切开。错误条表示标准偏差。（G） 感染 P.阿鲁吉诺萨 PAO1的外活猪角膜图片24小时。控制受伤，但没有添加细菌。受感染的角膜受伤，切口侧增加了^{10 7} 个CFU。没有从对照角膜中恢复CFU。（H） 最终 CFU 在感染 P. aeruginosa PAO1 24 小时后从用德克斯特兰 （n = 2） 治疗的角膜和那些没有德克斯特兰 （n = 9） 的角膜中恢复。角膜被洗净和切开。错误条表示标准偏差。 请点击这里查看此数字的较大版本。

Discussion

使用外体猪角膜开发这种角膜模型的主要驱动力是为开发新型抗菌素的研究人员提供具有代表性的体外模型，以更准确地确定前脑阶段的抗菌功效。这将为参与开发新的抗菌药物的研究人员提供在临床前阶段对药物设计和配方的更大控制，提高临床试验的成功率，通过有针对性的研究减少动物的使用，并加快将新的抗菌素转化为临床。

多项研究已调查了感染各种动物的外生角膜的影响，例如：兔子^6、狗^7、山羊⁸和猪^{9、10、11。}这些研究大多侧重于建立⁶和可视化感染⁹的方法，但到目前为止，只有少数出版物侧重于药物测试和准确量化细菌^{6，7，8，12。}

我们模型的主要优点是作为食物链一部分的猪角膜的可用性。因此，使用前体猪角膜符合3R原则，即在研究中取代、改进和减少动物的使用，同时提供宿主接口的代表性模型。如果严格遵守协议，我们观察到角膜外泄的污染没有问题。玻璃模具非常简单、快速、简单，无需任何专用设备。顶部的窄环使少量测试药物（100μL）或细菌的添加变得方便。玻璃模具的环允许PBS与细菌或药物溶液保留在角膜的中心部分，并防止细菌进入角膜下面。环易于清洁和消毒，并允许观察感染期间角膜顶部发生的变化。荧光标记细菌菌株可用于使用荧光共生显微镜可视化感染或量化感染在组织中的传播。整个角膜可以进一步处理组织学或电子显微镜成像。

关键步骤在协议中标记。在执行协议时，必须特别注意这些步骤，以确保成功感染。协议内最关键的步骤是确保角膜在制备过程中用足够的抗生素治疗，以防止感染，然后在引入感染生物体之前充分消除抗生素，在这种情况下 ，P. aeruginosa。在使用此协议进行实验时，在某些情况下，在无抗生素介质的孵化过程中出现浊度。这种浊度表明无抗生素介质中微生物的生长。这可能是由于使用抗生素对角膜的治疗不完整，或者由于处理过程中的污染。这些角膜没有进行进一步实验，被丢弃了。在无抗生素介质中孵育角膜时，通过在孵化器中使用频繁的绝育运行，使用带过滤器的一次性移液器提示，以及在消毒用于从猪眼中切除角膜的工具时适当小心，避免了浊度的发展。另一个关键步骤是在感染前将角膜放入玻璃模具中。玻璃模具使一个人能够保持角膜的凸形。角膜的凸起是角膜表面保留感染剂量或治疗剂的挑战。因此，必须确保角膜和玻璃模具之间有足够的密封。当角膜和玻璃模具之间有足够的密封时，霉菌上方的环形结构创建一个储层，以保留感染剂量或治疗剂。通过将 DMEM agar 完全填充玻璃模具的宽段，确保密封充足。

与任何模型一样，描述的前活体猪角膜模型也有限制。此处描述的模型不模仿整个角膜撕裂膜的组成、流动和补充。闪烁提供的机械动作也未纳入模型。文献中一致认为，泪膜的组成和动力学，和闪烁是重要的防御机制，删除外国粒子和微生物从眼睛^13。事实上，该模型也缺乏在体内感染期间触发的免疫反应。在这些防御机制的存在下，体内感染的进展很可能与此处描述的前体内模型所观察到的不同。尽管有这些局限性，但前体猪角膜模型对于测试现有和新兴抗菌素的有效性是相关的，主要有两个原因：1） 前体内模型中的细菌的生理学模仿体内条件，因为细菌增殖取决于它们破坏角膜组织的能力：2） 该模型将三维组织作为治疗的扩散屏障，就像在体内一样。因此，前体内模型比传统的抗菌易感性测试技术具有优势。

这里描述的前活猪角膜模型也可用于研究导致角膜炎的不同菌株、真菌和酵母菌。此前体角膜模型是可重复的，允许一个人在短时间内生成复制，不像在体内模型。理论上可以添加人工眼泪或宿主免疫防御细胞来模拟实时场景，而不是PBS。角膜是从同一品种的猪身上获得的，屠宰时大约21-23周大。因此，与从人类尸体中获得的复制品相比，复制品之间的变异性较小。在过去几年中，使用猪外腔角膜模型进行生物医学应用的概念越来越受欢迎，因为它与人眼在生物学上相似，这使得这个模型更容易比较^14。人们越来越有兴趣使用猪角膜移植^15，16或作为干眼¹⁷或伤口愈合¹⁸的模型。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 mL Falcon tube	SLS	352070
Amphotericin B	Sigma	A2942
Cellstar 12 well plate	Greiner Bio-One	665180
Dextran	Sigma	31425-100mg-F
Distel	Fisher Scientific	12899357
DMEM + glutamax	SLS	D0819
Dual Oven Incubator	SLS	OVe1020	Sterilising oven
Epidermal growth factor	SLS	E5036-200UG
F12 HAM	Sigma	N4888
Foetal calf serum	Labtech International	CA-115/500
Forceps	Fisher Scientific	15307805
Handheld homogeniser 220	Fisher Scientific	15575809	Homogeniser
Heracell VIOS 160i	Thermo Scientific	15373212	Tissue culture incubator
Heraeus Megafuge 16R	VWR	521-2242	Centrifuge
Insulin, recombinant Human	SLS	91077C-1G
LB agar	Sigma	L2897
Multitron	Infors	Not appplicable	Bacterial incubator
PBS	SLS	P4417
Penicillin-Streptomycin	SLS	P0781
Petri dish	Fisher Scientific	12664785
Petri dish 35x10mm CytoOne	Starlab	CC7672-3340
Povidone iodine	Weldricks pharmacy	2122828
Safe 2020	Fisher Scientific	1284804	Class II microbiology safety cabinet
Scalpel blade number 15	Fisher Scientific	O305
Scalpel Swann Morton	Fisher Scientific	11849002