Summary
В этой статье описывается пошаговой протокол для настройки ex vivo свиной модели бактериального кератита. Pseudomonas aeruginosa используется в качестве прототипа организма. Эта инновационная модель имитирует инфекцию in vivo, поскольку бактериальная пролиферция зависит от способности бактерии повредить ткани роговицы.
Abstract
При разработке новых противомикробных препаратов успех испытаний на животных зависит от точной экстраполяции эффективности противомикробных препаратов от тестов in vitro до инфекций животных in vivo. Существующие тесты in vitro обычно переоценивают эффективность противомикробных препаратов, поскольку наличие ткани-хозяина в качестве диффузионные барьеры не учитывается. Чтобы преодолеть это узкое место, мы разработали ex vivo свиной роговицы модель бактериального кератита с использованием Pseudomonas aeruginosa в качестве прототипа организма. В этой статье описывается подготовка свиной роговицы и протокол для установления инфекции. Индивидуальные стеклянные формы позволяют простой установки роговицы для исследования инфекции. Модель имитирует инфекцию in vivo, так как бактериальная пролиферция зависит от способности бактерии повредить ткани роговицы. Установление инфекции проверяется как увеличение числа колоний, образующих единицы, оцениваемые с помощью жизнеспособных подсчетов пластин. Результаты показывают, что инфекция может быть установлена в весьма воспроизводимой моды в ex vivo роговицы с использованием метода, описанного здесь. Модель может быть расширена в будущем, чтобы имитировать кератит, вызванный микроорганизмами, кроме P. aeruginosa. Конечная цель модели заключается в расследовании влияния противомикробной химиотерапии на прогресс бактериальной инфекции в сценарии более представительный инфекций in vivo. При этом описанная здесь модель позволит сократить использование животных для тестирования, повысить показатели успешности клинических испытаний и в конечном итоге обеспечить быстрый перевод новых противомикробных препаратов в клинику.
Introduction
Инфекции роговицы являются важными причинами слепоты и происходят в масштабах эпидемии в странах с низким и средним уровнем дохода. Этиология заболевания варьируется от региона к региону, но бактерии составляют подавляющее большинство этих случаев. Pseudomonas aeruginosa является важным патогеном, который вызывает быстро прогрессирующее заболевание. Во многих случаях пациенты остаются с стромальными рубцами, нерегулярным астигматизмом, требуют пересадки или в худшем случае теряютглаз 1,2.
Бактериальный кератит, вызванный P. aeruginosa является трудно глазной инфекции для лечения особенно в связи с увеличением появления противомикробных устойчивых штаммов P. aeruginosa. В течение последнего десятилетия, стало очевидно, что тестирование и разработка новых методов лечения инфекций роговицы, в целом, и те, вызванные Pseudomonas sp., в частности, имеют важное значение для борьбы с нынешней тенденцией в устойчивости кантибиотикам 3.
Для тестирования эффективности новых методов лечения инфекций роговицы, обычные микробиологические методы in vitro являются плохой суррогатной из-за разницы в бактериальной физиологии во время лабораторной культуры и во время инфекций in vivo, а также из-за отсутствияинтерфейса хозяина 4,5. В vivo животных моделей, однако, являются дорогостоящими, трудоемкими, может доставить лишь небольшое количество репликаций и поднять озабоченность по поводу благополучия животных.
В этой статье мы демонстрируем простую и воспроизводимую органотипную модель свинины ex vivo, которая может быть использована для тестирования различных методов лечения острых и хронических инфекций. Мы использовали P. aeruginosa для этого эксперимента, но модель также хорошо работает с другими бактериями, и организмы, такие как грибы и дрожжи, которые вызывают кератит.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Альбино лабораторных кроликов были принесены в жертву в лаборатории для других запланированных экспериментальных работ в соответствии с домашним офисом утвержденных протоколов. Глаза не были необходимы для экспериментального использования в этих исследованиях, поэтому они были использованы для этого протокола.
1. Стерилизация
- CRITICAL STEP: Дезинфицировать все типсы и ножницы, замачивая в течение 1 ч в 5% (v/v) раствор Distel в дистиллированной воде, очистить щеткой, промыть водопроводной водой и стерилизовать в духовке при температуре 185 градусов по Цельсию в течение как минимум 2 ч.
- Стерилизовать все остальные стеклянные изделия и реагенты, автоклав при 121 градусе по Цельсию в течение 15 минут или подготовить реагенты в соответствии с инструкциями производителя. Выполнить следующие процедуры в кабинете безопасности микробиологии II класса.
2. Сбор образцов
- Коллекция свиных глаз
- Большие белые сеют землю, был использован крест с кабаном Хэмпшира. Звери были ошеломлены электрическим током и глаза были enucleated 2 ч позже в скотобойне.
- CRITICAL STEP: После того, как enucleated, передать глаза в лабораторию в стерильный фосфат буферизированный солевой раствор (PBS), чтобы предотвратить их от высыхания и обрабатывать их сразу по прибытии.
- Коллекция кролика глаза
- Акциз роговицы и отправить в лабораторию в стерильных PBS.
3. Подготовка роговицы кнопки
- Используйте стерильные типсы, чтобы удерживать ткани, окружающие глазное яблоко, и передавать его в чашку Петри. Удалите конъюнктиву и мышечную ткань вокруг глазного яблока на чашке Петри с помощью скальпельного лезвия No 15 и типсов.
- Аккуратно поднимите глазное яблоко, удерживая зрительный нерв с типсами и перенесите в банку 0,5 л, наполненную стерильным PBS.
- После того, как все глаза очищены от окружающих тканей, переместить их с помощью стерильных типсов в другой 0,5 л банку заполнены 3% (V / V) povidone йода в PBS и оставить на 1 мин.
- Перенесите глазные яблоки в другую банку 0,5 л со стерильным PBS.
- Используйте типсы, чтобы держать глаз еще на чашке Петри и сделать разрез возле роговицы скальпелем лезвие No 10A.
- CRITICAL STEP: Держите край разреза и используйте ножницы, чтобы подрезать роговицу, оставляя около 3 мм склеры, окружающей роговицу. Убедитесь, что острый конец ножниц не пронзает радужную оболочку или хороидную ткань и находится в надхоровидном пространстве.
- Держите роговицы кнопку с типсами и использовать другую пару остроконечных конечных типсов, чтобы мягко отделить увеальной ткани.
- Поднимите роговицу от оставшегося глобуса и кратко промойте ее в 1,5% (v/v) раствора йода в PBS в 12 хорошо пластины.
- Поместите роговицу кнопку в другой 12 хорошо пластины заполнены стерильными PBS.
- После обработки всех глаз(рекомендуется максимум 40 глаз в одной партии),поместите каждую роговицу кнопку на индивидуальную чашку Петри (диаметр 34 мм) эпителиальной стороной вверх и влейте в 3 мл среды культуры предварительно разогретую до 37 градусов по Цельсию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Состав среды культуры таков: модифицированная среда орла Дульбекко (DMEM): Хам в «1:1» дополнен 5мкгл -1 инсулином и 10ng'mL -1 эпидермальным фактором роста (EGF), 10% (v/v) сывороткой теленка плода (FCS), 100U'mL -1 penicillin, 100 УМЛ-1 стрептомицин и 2,5мкг-мл -1 амфотерицин Б. В качестве дополнительного шага, среда может быть дополнена 50г-л -1 декстран, чтобы предотвратить отек вырезанной роговицы во время дальнейших шагов инкубации. - Инкубация при 37 градусов по Цельсию в инкубаторе культуры увлажненной ткани.
4. Обслуживание кукурузных кнопок
- Через 24 часа используйте асептический метод для удаления мультимедиа и замены 3 мл свежих предварительно разогретых средств культуры, содержащих антибиотики. Держите роговицы кнопки в средствах массовой информации с антибиотиками в течение 48 ч для дезинфекции роговицы. Инкубация при 37 градусов по Цельсию в инкубаторе культуры увлажненной ткани.
- CRITICAL STEP: После 48 часов, удалить средства массовой информации и промыть роговицы с 2 мл PBS. Затем держите кукурузные кнопок в без антибиотиков средств массовой информации в течение как минимум двух или в идеале за три дня до экспериментальной инфекции, чтобы удалить остаточные антибиотики из ткани.
- Инкубация при 37 градусов по Цельсию в инкубаторе культуры увлажненной ткани. Изменение средств массовой информации по крайней мере еще раз в течение этих трех дней. Откажитесь от роговицы, если какая-либо мутность развивается в среде, свободной от антибиотиков.
5. Подготовка инокулума
- Налейте 10 мл бульона LB в коническую колбу 50 мл с пенопластовой пробкой.
- Передача колонии P. aeruginosa штамм PAO1 или штамм PA14 из свежей пластины агара и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение 3-4 ч, пока бактерии находятся в середине этапа журнала.
- Перенесите культуру бактерий в трубку и центрифугу 50 мл при 3000 х г в течение 5 мин. Удалите супернатант и повторно приостановить гранулы клетки в PBS.
- Повторите шаг 5.3 еще два раза, чтобы вымыть клетки. Повторно приостанавливайте гранулы клеток в PBS и отрегулируйте оптическую плотность на 600 нм примерно до 0,6, используя стерильный PBS в качестве пробела.
6. Заражение роговицы кнопку
- Удалить средства массовой информации из чашки Петри и промыть роговицы дважды с 1 мл стерильных PBS.
- Аккуратно сожмите типсы, удерживая роговицу между ними. Используйте скальпель 10A, чтобы сделать четыре разреза - два вертикальных, два горизонтальных - в центральной части роговицы кнопки через эпителиальный слой к основной строме.
- Поместите стерильную стеклянную форму в 6-хорошо пластины с широкой частью вверх и место роговицы в середине стеклянной формы, эпителия стороны лицом вниз. Сделайте разрез прямо в центре нижней части стеклянной формы.
- CRITICAL STEP: Налейте 1 мл 1% (w/v) низкой точки плавления агара, растворенного в DMEM, чтобы полностью заполнить стеклянную форму роговицей.
- Разрешить агар установить, а затем инвертировать стеклянную форму так, что эпителий роговицы сталкивается вверх.
- Pipette 15 йл бактериальной культуры с OD600nm 0,6 (для P. aeruginosa это приравнивается к примерно 1 х10 7 единиц колонии формирования (CFU) в 15 йл) непосредственно в разрезе области, а затем добавить 85 йЛ PBS к вершине, чтобы сохранить эпителий роговицы влажной. Разбавить оставшуюся бактериальную культуру и пластину на агаре, чтобы посчитать колонию, образуя единицы для инокулума.
- Добавить 1 мл DMEM без антибиотиков на дно каждого хорошо со стеклянной плесенью. Инкубировать 6-хорошо пластины с инфицированными роговицы кнопки в увлажненной инкубатор при 37 градусов по Цельсию с 5% CO2 на срок до 24 ч.
- Настройка неинфицированных контроля роговицы наряду с каждым экспериментом. Чтобы настроить неинфицированный контроль, замените 15 МКЛ бактериальной культуры в шаге 6.6 стерильным PBS.
7. Гомогенизация роговицы для сбора бактерий
- Отбросьте среду DMEM из нижней части пластины 6 хорошо и добавить 1 мл стерильных PBS для полоскания нижней части хорошо.
- Снимите PBS осторожно, трубя, не касаясь центральной части роговицы кнопки. Снимите стеклянное кольцо с помощью стерильных типсов и поместите его в 5% Distel.
- Аккуратно промойте верхнюю часть роговицы с помощью 1 мл PBS дважды .optional.
- Держите край роговицы кнопку с тонкой типсы кончика и отделить его от агара под ним.
- Перенесите роговицу в трубку 50 мл, наполненную ледяным холодом 1-2 мл PBS.
- Используйте тонкий кончик гомогенизатора, чтобы чисто верхней части инфицированной роговицы. Ткань не должна быть полностью ликвидирована. Гомогенизатор помогает отделить бактерии от эпителия роговицы и области разреза.
- Vortex роговицы в PBS в течение нескольких секунд, чтобы смешать содержимое.
- Добавьте 20 МКЛ гомогената в 180 МКЛ PBS и выполните серийные разбавления в пластине 96 хорошо.
- Серийно разбавляют суспензию до 10-4 и 10-5 разбавления и пипетки 10 МКЛ разбавленного гомогената бактериями на агарную пластину крови. Инкубировать тарелку в течение 8 часов и подсчитать количество CFU. При тестировании эффекта противомикробных препаратов, соответствующий фактор разбавления должны быть прибыли в экспериментальном порядке.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Дизайн стеклянных форм являются инновационной и оригинальной идеей, использование которой позволило нам настроить модель в последовательной моды с минимальными / нет проблем с загрязнением. Формы были подготовлены стеклодувом в Университете Шеффилда на основе дизайна(рисунок 1A). Экспериментальная установка поддерживает вытявную форму роговицы и держит бактерии на верхней части эпителия, где происходит инфекция(рисунок 1B).
Свиные роговицы обычно набухают после нескольких дней в среде. Это нормально, и мы обнаружили, что не было никакой существенной разницы между роговицы с и без добавления декстрана, который обычно добавляется для предотвращения отек роговицы (Рисунок 1H). Роговицы, как правило, ранены, чтобы помочь бактериям проникнуть в эпителий. Хотя не было существенной разницы в прогрессе инфекции между ранеными (вырезать) и раскручивается (необрезанный) роговицы, мы заметили больше различий между репликациями в необрезанных роговицы (Рисунок 1C). Мытье роговицы дважды с PBS удаляет избыток бактерий, которые не прикрепляются к эпителию. Существовала значительная разница в CFU между промытой и немытой свиной роговицы инфицированных P. aeruginosa PAO1 в течение 24 часов(рисунок 1D). Не было существенной разницы в подсчетах CFU между свиной и кролик роговицы инфицированных PA14 и PAO1(рисунок 1E,1F). Результаты для обеих моделей были воспроизведены. После 24 часов, роговица инфицированных либо Pseudomonas штамм всегда развивается непрозрачность и разрез области становится более заметным и открытым по сравнению с неинфицированных роговицы (Рисунок 1G).
Рисунок 1: Ex vivo роговицы инфицированных Pseudomonas aeruginosa. (A) Схематическая картина стеклянной формы, используемой для поддержания формы роговицы и облегчения введения бактерий и лечения. Толщина стеклянных форм составляет 1,5 мм и такая же, как толщина пробирок из борозиликатного стекла. (B)Схематическая картина экспериментальной настройки. (C) Тестирование влияния раны на окончательный отсчет CFU после гомогенизации. Необрезанные (n No 16) и разрезанные (n No 28) роговицы были инфицированы P. aeruginosa PAO1 и P. aeruginosa PA14 в течение 24 часов. Роговицы промыли 1 мл PBS до гомогенизации. Бары ошибок указывают на стандартное отклонение. (D) Тестирование эффекта мытья роговицы с 2 х 1 мл PBS (n No 6) и не мыть (n No 6) на окончательный отсчет CFU после заражения P. aeruginosa PAO1 в течение 24 часов. Бары ошибок указывают на стандартное отклонение. (E ) Окончательный отсчет CFU в свиной роговицы инфицированных P. aeruginosa PAO1 и P. aeruginosa PA14 в течение 24 часов (n No 10). Корнеи промыли и порезали. Бары ошибок указывают на стандартное отклонение. (F ) Окончательный отсчет CFU в роговицах кролика зараженных P. aeruginosa PAO1 и P. aeruginosa PA14 в течение 24 часов (n No 6). Корнеи промыли и порезали. Бары ошибок указывают на стандартное отклонение. (G) Фотографии ex vivo свиней роговицы, инфицированных P. aeruginosa PAO1 в течение 24 часов. Контроль был ранен, но никаких бактерий не было добавлено. Зараженные роговицы были ранены и 107 CFU были добавлены в сторону разреза. Нет CFU были извлечены из контроля роговицы. (H) Окончательный CFU выздоровел после 24 часов инфекции с P. aeruginosa PAO1 от роговицы лечение декстрана (n No 2) и те, без декстрана (n No 9). Корнеи промыли и порезали. Бары ошибок указывают на стандартное отклонение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Основной причиной разработки этой модели кератита с использованием ex vivo свиной роговицы является предоставление исследователям, разрабатывая новые противомикробные препараты с репрезентативной моделью in vitro для более точного определения эффективности противомикробных препаратов на доклинических стадиях. Это обеспечит исследователям, участвующим в разработке новых противомикробных препаратов, больший контроль над разработкой и разработкой лекарств на доклинических стадиях, повысит успех клинических испытаний, сократит использование животных за счет предоставления целевых исследований и приведет к более быстрому переводу новых противомикробных препаратов в клинику.
Ряд исследований исследовали влияние инфекций на ex vivo роговицы от различных животных, таких как:кролик 6,собака7,коза 8 и свиней 9,10,11. Большинство из этих исследований сосредоточены на путисоздания 6 и визуализацииинфекции 9, но до сих пор было только несколько публикаций упором на тестирование на наркотики и точнойколичественной оценки бактерий 6,7,8,12.
Основным преимуществом нашей модели является наличие свиной роговицы как части пищевой цепи. Поэтому использование свиных роговиц ex vivo согласуется с принципом 3Rs, который заключается в замене, уточнении и сокращении использования животных в исследованиях, обеспечивая при этом репрезентативную модель интерфейса хоста. Мы не наблюдали никаких проблем с загрязнением роговицы explants, если протокол строго соблюдается. Стеклянные формы очень просты, быстры и просты в использовании без каких-либо требований к специализированному оборудованию. Узкое кольцо в верхней части делает добавление небольшого количества испытанного препарата (100 МКЛ) или бактерий удобным. Кольцо стеклянной формы позволяет PBS с бактериями или раствором препарата быть сохранены в центральной части роговицы и предотвращает бактерии от получения под роговицу. Кольцо легко чистить и стерилизовать, и позволяет наблюдение за изменениями, которые происходят на верхней части роговицы во время инфекции. Штаммы флуоресцентно помеченных бактерий могут быть использованы для визуализации инфекции или количественного распространения инфекции в ткани с помощью флуоресцентной конфокальной микроскопии. Вся роговица может быть дополнительно обработана для гистологии или электронной микроскопии изображений.
Критические шаги отмечены в протоколе. Особое внимание следует уделить этим шагам при выполнении протокола для обеспечения успешной инфекции. Наиболее важными шагами в рамках протокола являются обеспечение того, чтобы роговицы лечатся достаточным количеством антибиотиков для предотвращения инфекции во время подготовки, а затем, что антибиотики достаточно устранены до введения инфекционного организма, в данном случае P. aeruginosa. При настройке экспериментов с использованием этого протокола, в некоторых случаях, мутность развивалась во время инкубации в среде, свободной от антибиотиков. Эта мутность свидетельствует о росте микроорганизмов в среде, свободной от антибиотиков. Это может быть связано с неполным лечением роговицы с использованием антибиотиков или из-за загрязнения во время обработки. Эти роговицы не были выдвинуты для дальнейших экспериментов и были отброшены. Развитие мутности при инкубации роговицы в среде, свободной от антибиотиков, удалось избежать, используя частые стерилизации работает в инкубаторе, используя одноразовые советы пипетки с фильтром и принимая адекватный уход при стерилизации инструментов, используемых для экскрементов роговицы из свиных глаз. Другим важным шагом является, когда роговицы помещаются в стеклянную форму до заражения. Стеклянная плесень позволяет поддерживать вытявную форму роговицы. Выкачиваемость роговицы является проблемой для удержания либо инфекционной дозы или терапевтического агента на поверхности роговицы. Поэтому важно обеспечить наличие адекватного уплотнения между роговицей и стеклянной плесенью. Когда есть адекватное уплотнение между роговицей и стеклянной формы, кольцо структуры над плесенью создает резервуар, чтобы сохранить либо инфекционной дозы или терапевтического агента. Адекватная печать обеспечивается путем полного заполнения широкого раздела стеклянной формы с DMEM агар до краев.
Как и в случае с любой моделью, Есть ограничения, связанные с ex vivo свиной роговицы модели описаны. Описанная в настоящем деле модель не имитирует композицию, поток и пополнение слезной пленки по всей роговице. Механическое действие, предоставляемое миганием, также не включено в модель. Существует согласие в литературе, что слезоточивый состав пленки и динамики, и мигает являются важными защитные механизмы, которые удаляют иностранные частицы и микроорганизмы изглаза 13. Действительно, модель также не хватает иммунного ответа, который вызывается во время инфекции in vivo. Вполне вероятно, что прогрессирование инфекции in vivo в присутствии этих защитных механизмов отличается от того, что наблюдается в модели ex vivo, описанной здесь. Несмотря на эти ограничения, ex vivo свиной роговицы модель имеет отношение к тестированию эффективности существующих и возникающих противомикробных препаратов по двум основным причинам: 1) физиология бактерий в модели ex vivo имитирует условия in vivo, как бактериальная пролиферация зависит от их способности повредить ткани роговицы, и 2) модель включает в себя трехмерную ткань в качестве диффузного барьера для терапевтических так же, как в терапевтической ситуации. Таким образом, модель ex vivo выгодна по сравнению с обычными методами для тестирования на восприимчивость к противомикробным препаратам.
Экс Виво свиной роговицы модель, описанная здесь может быть также использован для изучения различных штаммов бактерий, грибков и дрожжей, которые вызывают кератит. Эта модель ex vivo роговицы воспроизводится и позволяет генерировать репликации в течение короткого времени в отличие от моделей in vivo. Вместо PBS, искусственные слезы или клетки иммунной защиты хозяина теоретически могут быть добавлены, чтобы имитировать живой сценарий. Корнеи получаются из той же породы свиней и около 21-23 недель, когда забивают. Таким образом, существует меньшая изменчивость между репликациями по сравнению с теми, которые получены из человеческих трупов. Концепция использования свиной модели ex vivo роговицы для биомедицинских приложений приобрела большую популярность в течение последних нескольких лет из-за его биологического сходства с человеческим глазом, что делает эту модельлегче сравнить 14. Существует повышенный интерес к использованию свиной роговицы длятрансплантации 15,16 или в качестве модели для сухого глаза17 или заживленияран 18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторов нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Эллиота Абаттуара в Честерфилде за предоставление свиных глаз. Стеклянные кольца были сделаны на основе нашего дизайна стеклодувом Дэном Джексоном (Dan Jackson) из химического факультета Шеффилдского университета. Авторы хотели бы поблагодарить Совет медицинских исследований (MR/S004688/1) за финансирование. Авторы также хотели бы поблагодарить г- жу Шанали Диквеллу за техническую помощь в подготовке роговицы. Авторы хотели бы поблагодарить г-на Джонатана Эмери за помощь в форматировании фотографий.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL Falcon tube | SLS | 352070 | |
| Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
| Cellstar 12 well plate | Greiner Bio-One | 665180 | |
| Dextran | Sigma | 31425-100mg-F | |
| Distel | Fisher Scientific | 12899357 | |
| DMEM + glutamax | SLS | D0819 | |
| Dual Oven Incubator | SLS | OVe1020 | Sterilising oven |
| Epidermal growth factor | SLS | E5036-200UG | |
| F12 HAM | Sigma | N4888 | |
| Foetal calf serum | Labtech International | CA-115/500 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 15307805 | |
| Handheld homogeniser 220 | Fisher Scientific | 15575809 | Homogeniser |
| Heracell VIOS 160i | Thermo Scientific | 15373212 | Tissue culture incubator |
| Heraeus Megafuge 16R | VWR | 521-2242 | Centrifuge |
| Insulin, recombinant Human | SLS | 91077C-1G | |
| LB agar | Sigma | L2897 | |
| Multitron | Infors | Not appplicable | Bacterial incubator |
| PBS | SLS | P4417 | |
| Penicillin-Streptomycin | SLS | P0781 | |
| Petri dish | Fisher Scientific | 12664785 | |
| Petri dish 35x10mm CytoOne | Starlab | CC7672-3340 | |
| Povidone iodine | Weldricks pharmacy | 2122828 | |
| Safe 2020 | Fisher Scientific | 1284804 | Class II microbiology safety cabinet |
| Scalpel blade number 15 | Fisher Scientific | O305 | |
| Scalpel Swann Morton | Fisher Scientific | 11849002 |
References
- Vazirani, J., Wurity, S., Ali, M. H. Multidrug-Resistant Pseudomonas aeruginosa Keratitis Risk Factors, Clinical Characteristics, and Outcomes. Ophthalmology. 122 (10), 2110-2114 (2015).
- Sharma, S.
- Sharma, G., et al. Pseudomonas aeruginosa biofilm: Potential therapeutic targets. Biologicals. 42 (1), 1-7 (2014).
- Ersoy, S. C., et al. Correcting a Fundamental Flaw in the Paradigm for Antimicrobial Susceptibility Testing. EBioMedicine. 20, 173-181 (2017).
- Kubicek-Sutherland, J. Z., et al. Host-dependent Induction of Transient Antibiotic Resistance: A Prelude to Treatment Failure. EBioMedicine. 2 (9), 1169-1178 (2015).
- Pinnock, A., et al. Ex vivo rabbit and human corneas as models for bacterial and fungal keratitis. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 255 (2), 333-342 (2017).
- Harman, R. M., Bussche, L., Ledbetter, E. C., Van de Walle, G. R. Establishment and Characterization of an Air-Liquid Canine Corneal Organ Culture Model To Study Acute Herpes Keratitis. Journal of Virology. 88 (23), 13669-13677 (2014).
- Madhu, S. N., Jha, K. K., Karthyayani, A. P., Gajjar, D. U. Ex vivo Caprine Model to Study Virulence Factors in Keratitis. Journal of Ophthalmic & Vision Research. 13 (4), 383-391 (2018).
- Vermeltfoort, P. B. J., van Kooten, T. G., Bruinsma, G. M., Hooymans, A. M. M., vander Mei, H. C., Busscher, H. J. Bacterial transmission from contact lenses to porcine corneas: An ex vivo study. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (6), 2042-2046 (2005).
- Duggal, N., et al. Zinc oxide tetrapods inhibit herpes simplex virus infection of cultured corneas. Molecular Vision. 23, 26-38 (2017).
- Brothers, K., et al. Bacterial Impediment of Corneal Cell Migration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (7), (2015).
- Alekseev, O., Tran, A. H., Azizkhan-Clifford, J. Ex vivo Organotypic Corneal Model of Acute Epithelial Herpes Simplex Virus Type I Infection. Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).
- Sack, R. A., Nunes, I., Beaton, A., Morris, C.
- Kunzmann, B. C., et al. Establishment of a porcine corneal endothelial organ culture model for research purposes. Cell and Tissue Banking. 19 (3), 269-276 (2018).
- Oh, J. Y., et al. Processing Porcine Cornea for Biomedical Applications. Tissue Engineering Part C-Methods. 15 (4), 635-645 (2009).
- Shi, W. Y., et al. Protectively Decellularized Porcine Cornea versus Human Donor Cornea for Lamellar Transplantation. Advanced Functional Materials. 29, 1902491-1902503 (2019).
- Menduni, F., Davies, L. N., Madrid-Costa, D., Fratini, A., Wolffsohn, J. S. Characterisation of the porcine eyeball as an in-vitro model for dry eye. Contact Lens & Anterior Eye. 41 (1), 13-17 (2018).
- Castro, N., Gillespie, S. R., Bernstein, A. M. Ex vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies. Journal of Visualized Experiments. (144), (2019).
