Summary
この記事では、細菌性角膜炎のex vivo ブタモデルを設定するためのステップバイステップのプロトコルについて説明します。 緑膿菌 は原型生物として用いられる。細菌増殖は、細菌が角膜組織を損傷する細菌の能力に依存するように、この革新的なモデルは、生体内感染を模倣する。
Abstract
新しい抗菌剤を開発する場合、動物試験の成功は、生体内検査から生体内の動物感染までの抗菌効果の正確な外挿に依存する。既存のin vitro試験は、典型的には拡散障壁としての宿主組織の存在が考慮されないとして抗菌効果を過大評価する。このボトルネックを克服するために、緑膿菌を原型生物として使用した細菌性角膜炎 の エキビボブタコネ角膜モデルを開発しました。この資料では、ブタの角膜の調製と感染の確立のためのプロトコルについて説明します。別注ガラス型は、感染研究のための角膜の簡単なセットアップを可能にする。このモデルは、細菌の増殖が角膜組織を損傷する細菌の能力に依存するので、生体内感染を模倣する。感染の確立は、生存可能なプレート数を介して評価されるコロニー形成ユニットの数の増加として検証される。この結果は、ここで説明する方法を用いて、ex vivo角膜において非常に再現性の高い方法で感染を確立できることを示している。このモデルは、 将来的にP.緑素症以外の微生物によって引き起こされる角膜炎を模倣するために拡張することができます。このモデルの究極の目的は、生体内感染をより代表的なシナリオで抗菌化学療法が細菌感染の進行に及ぼす影響を調査することである。そうすることで、ここで説明するモデルは、検査のための動物の使用を減らし、臨床試験での成功率を向上させ、最終的には新しい抗菌薬をクリニックに迅速に翻訳することを可能にする。
Introduction
角膜感染症は失明の重要な原因であり、低所得国と中所得国の流行割合で発生します。この疾患の病因は地域によって異なるが、細菌はこれらの症例の大部分を占める。緑膿菌は、急速に進行する疾患を引き起こす重要な病原体である。多くの場合、患者は、間質瘢痕、不規則な乱視、移植を必要とする、または最悪のシナリオでは、目1、2を失う。
P.緑素症によって引き起こされる細菌性角膜炎は、特にP.緑素症の抗菌耐性株の出現の増加に起因する治療が困難な眼感染症である。過去10年の間に、角膜感染症の新しい治療法の試験と開発、一般的に、特にシュードモナスspによって引き起こされるものは、抗生物質耐性3の現在の傾向に対抗するために不可欠であることが明らかになった。
角膜感染症に対する新しい治療法の有効性を試験するために、従来のインビトロ微生物学的方法は、実験室培養中および生体内感染中の細菌生理学の差と、宿主界面4,5の欠如による貧弱な代理である。しかし、生体内動物モデルは高価で時間がかかり、少数の複製を提供し、動物の福祉に関する懸念を提起することができます。
本稿では、急性および慢性感染症に対する様々な治療法の試験に使用できる角膜炎の、簡単で再現可能なorganotypic ex vivoブタモデルを示す。今回の実験では P.緑素吸い分を 用いていますが、他の細菌や角膜炎を引き起こす真菌や酵母などの生物ともうまく機能します。
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Protocol
アルビノの実験室ウサギは、ホームオフィス承認のプロトコルの下で他の計画された実験作業のために実験室で犠牲にされました。これらの研究では、目は実験用に必要とされなかったため、このプロトコルに使用されました。
1. 殺菌
- クリティカルステップ:蒸留水にディステルの5%(v/v)溶液に1時間浸漬し、ブラシで洗浄し、水道水で洗い流し、最低2時間185°Cのオーブンで殺菌することによって、すべての鉗子とはさみを消毒します。
- 121°Cで15分間オートクレーブ処理を行い、他のすべてのガラス製品や試薬を殺菌するか、メーカーの指示に従って試薬を準備します。クラスII微生物安全キャビネットで以下の手順を実行します。
2. サンプルコレクション
- ブタの目のコレクション
- 大きな白い競主が雌し、ハンプシャーイノシシとの十字架が使用されました。動物は電流で驚き、目はアバトワールで2時間後に核を摘出した。
- クリティカルステップ:一度核を取り除き、滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)溶液で目をラボに移し、乾燥を防ぎ、到着時にすぐに処理します。
- ウサギの目のコレクション
- 角膜を切除し、滅菌PBSでラボに送ります。
3. 角膜ボタンの準備
- 滅菌鉗子を使用して眼球を取り囲む組織を保持し、ペトリ皿に移します。メスの刃15番と鉗子を使ってペトリ皿の眼球の周りの結膜と筋組織を取り除きます。
- 鉗子で視神経を保持しながら眼球を静かに持ち上げ、滅菌PBSで満たされた0.5 L瓶に移します。
- すべての目が周囲の組織から取り除かれたら、PBSで3%(v/v)ポビドネヨウ素で満たされた別の0.5 L瓶に無菌鉗子を使用してそれらを移動し、1分間放置します。
- 無菌PBSで別の0.5 L瓶に眼球を移す。
- ペトリ皿に目を保持し、メスの刃なし10Aで角膜の近くでカットを行うために鉗子を使用してください。
- クリティカルステップ:カットの端を保持し、角膜を囲むスクレアの約3ミリメートルを残して角膜を切除するためにはさみを使用しています。はさみの鋭い端が虹彩や脈絡膜組織を突き刺さないことを確認し、上脈絡膜空間にあります。
- 角膜ボタンを鉗子で押し、尖ったエンド鉗子の別のペアを使用して、尿組織を穏やかに分離します。
- 残りの地球から角膜ボタンを持ち上げ、PBSの1.5%(v/v)ポビドンヨウ素溶液を12ウェルプレートで短時間すすいだ。
- 角膜ボタンを滅菌PBSで満たされた別の12ウェルプレートに入れてください。
- すべての目(推奨最大40の目を1バッチで)処理した後、各角膜切開ボタンを個々のペトリ皿(直径34mm)上皮側に上に置き、3mLの培養培地を37°Cに予熱して注ぎます。
注:培養培地の組成は次のとおりです:Dulbeccoの修飾イーグルの媒体(DMEM):ハムの[1:1]5μg∙mL-1インスリンと10ng∙mL-1表皮成長因子(EGF)、10%(v/v)胎児血清(FCS)、100 U∙mL -1陰茎、100 U∙mL-1ペニシル 100 U∙mL-1ストレプトマイシンおよび2.5 μg∙mL-1アンホテリシンB.任意工程として、培地は、さらにインキュベーションステップ中に切除角膜の膨潤を防ぐために50g∙L-1デキストランで補うことができる。 - 加湿組織培養インキュベーターで37°Cでインキュベートする。
4. 角膜ボタンのメンテナンス
- 24時間後、無菌技術を使用して培地を除去し、抗生物質を含む新鮮な前温め培養培地の3mLに置き換えます。角膜を消毒するために48時間抗生物質でメディアの角結膜ボタンを維持します。加湿組織培養インキュベーターで37°Cでインキュベートする。
- クリティカルステップ:48時間後、培地を取り出し、2mLのPBSで角膜をすすいます。次に、抗生物質を含まない培地に角膜ボタンを少なくとも2日または理想的には実験感染前に保管し、組織から残留抗生物質を除去する。
- 加湿組織培養インキュベーターで37°Cでインキュベートする。この 3 日以内にメディアを少なくとも 1 回変更してください。抗生物質を含まない培地で濁りが生じた場合は、角膜を捨てる。
5. 接種の準備
- 泡ストッパーと50 mL円錐形フラスコにLBスープの10 mLを注ぎます。
- P.緑素吸い株PAO1または株PA14のコロニーを新鮮な寒天プレートから移し、細菌が中ログ段階になるまで3〜4時間37°Cでインキュベートする。
- 細菌の培養物を50mLチューブ、遠心分離機を3,000 x g で5分間移動します。上清を取り除き、PBSで細胞ペレットを再び懸濁します。
- ステップ 5.3 をさらに 2 回繰り返して、細胞を洗浄します。PBSで細胞ペレットを再懸濁し、無菌PBSをブランクとして使用して600nmから約0.6の光学密度を調整します。
6. 角膜ボタンに感染する
- ペトリ皿から培地を取り出し、1 mLの無菌PBSで角膜を2回洗いすります。
- 角膜を中間に持ちながら、鉗子を軽く絞ります。10Aメスを使用して、上皮層から下層の間質まで角膜ボタンの中央部に4つのカット(2つの垂直、2つの水平)を作ります。
- 広い部分を上にして6ウェルプレートに無菌ガラス型を入れ、角膜をガラス型の真ん中に置き、上皮側を下に向けます。ガラス金型の底部の中央にカットを右にします。
- 臨界ステップ:DMEMに溶解した低融点寒天1%(w/v)の1mLを注ぎ、ガラスモールドを角膜で完全に満たします。
- 角膜上皮が上向きになるように、寒天をセットし、ガラスの型を反転させます。
- OD600nm = 0.6の細菌培養のピペット15 μL(P. 緑素吸皮 症では、これは15μLの約1 x 107 コロニー形成ユニット(CFU)に直接相当し、85μLのPBSを上部に加えて角膜上皮を湿潤させます。残りの細菌培養物とプレートを寒天で希釈し、接種物のコロニー形成単位を数えます。
- ガラスモールドで各井戸の底に抗生物質なしでDMEMの1 mLを追加します。37°Cの加湿インキュベーターで感染した角膜ボタンで6ウェルプレートをインキュベートし、最大24時間5%CO2を使用します。
- すべての実験と一緒に未感染のコントロール角膜を設定します。感染していないコントロールを設定するには、ステップ6.6の細菌培養の15 μLを滅菌PBSに置き換えます。
7. 細菌を収穫する角膜の均質化
- 6ウェルプレートの底からDMEM培地を捨て、1mLの滅菌PBSを加えて井戸の底をすすいだ。
- 角膜ボタンの中央部に触れずにピペット処理を行い、PBSを穏やかに除去します。滅菌鉗子を使用してガラスリングを取り外し、5%のディステルに入れます。
- PBS 1 mL を 2 回使用して角膜ボタンの上部を 2 回やさしくすすります。
- 角膜ボタンの端を細かい先端鉗子で押さえ、下の寒天から取り外します。
- 氷冷1-2mLのPBSで満たされた50 mLチューブに角膜を移します。
- 感染した角膜の上部を薄くするために細かい先端ホモジナイザーを使用してください。組織を完全に清算する必要はありません。ホモジナイザーは、角膜上皮および切り傷領域から細菌を取り外すのに役立ちます。
- 内容物を混ぜるためにPBSで角膜を数秒間渦を入れる。
- 20 μL のホモジネートを PBS の 180 μL に加え、96 ウェルプレートでシリアル希釈を行います。
- 懸濁液を10-4 と10-5 希釈に連続して希釈し、細菌を用いたホモゲネートのピペット10μLを血液寒天板に上に入れる。プレートを8時間インキュベートし、CFUの数を数えます。抗菌薬の効果をテストする場合、適切な希釈因子を実験的に到着する必要があります。
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Representative Results
ガラスの金型の設計は革新的で独創的なアイデアであり、その使用により、汚染に関する問題を最小限に抑えて一貫した方法でモデルを設定することができました。金型は、設計に基づいてシェフィールド大学のガラスブロワーによって製造されました(図1A)。実験のセットアップは角膜の凸形状を維持し、感染が起こる上皮の上に細菌を保持する(図1B)。
ブタの角膜は、通常、培地で数日後に膨れ上がります.これは正常であり、我々は、通常、角膜の腫れを防ぐために添加されるデキストランの添加の有無にかかわらず角膜の間に有意な差がないことを発見した(図1H)。角膜は、通常、細菌が上皮に浸透するのを助けるために傷ついています。傷ついた(切り取り)と傷ついていない(カットされていない)角膜の間の感染の進行に有意な差はなかったが、我々は、無カット角膜における複製間のより多くの変動に気づいた(図1C)。PBSで角膜を2回洗浄すると、上皮に付着しなかった余分な細菌を除去します。 P.緑豆吸 いPAO1に感染した洗浄されたブタの角膜と洗浄されていないブタの角膜の間には、CFUに24時間有意な差があった(図1D)。PA14とPAO1に感染したブタとウサギの角膜の間のCFU数に有意な差はなかった(図1E,1F)。両モデルの結果は再現可能であった。24時間後、 いずれかのシュードモナス 株に感染した角膜は常に不透明度を発症し、切断領域は未感染角膜(図1G)と比較してより視見および開放的になる。
図1:緑膿菌に感染した元生体角膜.(A)角膜の形状を維持し、細菌や治療の導入を促進するために使用されるガラス型の模式図。ガラスの金型の厚さは1.5mmで、ホウケイ酸ガラスから作られた試験管の厚さと同じです。(B)実験用セットアップの概略図。(C) 均質化後の最終的なCFUカウントに対する創傷の影響を試験する。ノーカット(n=16)およびカット(n=28)角膜は、P.緑素吸皮PAO1およびP.緑素吸砂PA14に24時間感染した。角膜を、均質化前に1mLのPBSで洗浄した。誤差範囲は標準偏差を示します。(D) P.緑豆吸PAO1感染後の最終CFUカウントで2 x 1 mLのPBS(n=6)で角膜を洗浄する効果を試験する(n=6)。誤差範囲は標準偏差を示します。(E) P. 緑素吸いPAO1およびP. 緑豆PA14に感染したブタ角膜中の最終CFU数を24時間(n =10)にする。コルネアを洗浄し、切断した。誤差範囲は標準偏差を示します。(F) 24時間のP.緑豆吸いPAO1およびP. 緑素吸砂PA14に感染したウサギの角膜の最終CFU数。コルネアを洗浄し、切断した。誤差範囲は標準偏差を示します。(G) P.緑素吸除PAO1に感染したエキビボブタの角膜の写真 24時間.コントロールは負傷したが、細菌は加えなかった。感染した角膜は負傷し、107 CFUがカット側に追加された。CFUはコントロール角膜から回収されなかった。(H)最終CFUは、デキストラン(n=2)で処置された角膜およびデキストラン(n=9)を用いないものからP.緑素吸除PAO1に感染した24時間後に回復した。コルネアを洗浄し、切断した。誤差範囲は標準偏差を示します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
このケラティスモデルの開発の主な要因は、前臨床段階で抗菌効果をより正確に決定するために、代表的なin vitroモデルを新しい抗菌剤を開発する研究者に提供することです。これは、新しい抗菌薬の開発に関与する研究者に、前臨床段階での薬物設計と製剤をより詳細に制御し、臨床試験での成功を高め、標的研究を可能にすることによって動物の使用を減らし、新しい抗菌薬を診療所に迅速に翻訳することを可能にする。
多くの研究は、例えば、ウサギ6、犬7、ヤギ8と豚9、10、11のような様々な動物からのex vivo角膜に対する感染症の影響を調査しています。これらの研究のほとんどは、6を確立し、感染9を視覚化する方法に焦点を当てていますが、これまでのところ、薬物検査と細菌6、7、8、12の正確な定量化に焦点を当てたいくつかの出版物しかありませんでした。
私たちのモデルの主な利点は、食物連鎖の一部としてブタの角膜の可用性です。したがって、ex vivoブタの角膜の使用は、ホストインターフェイスの代表的なモデルを提供しながら、研究における動物の使用を置き換え、改良し、削減する3Rの原則に沿っています。プロトコルが厳密に従っている場合、角膜外植の汚染に関する問題は見られなかった。ガラスの型は特別な装置のための任意の条件なしで使用することは非常に簡単、迅速かつ簡単である。上部の狭いリングはテストされた薬物(100 μL)または細菌の少量の付加を便利にする。ガラスカビのリングは、細菌や薬物溶液を含むPBSを角膜の中央部に保持し、細菌が角膜の下に入るのを防ぐことができます。リングはきれいになり、殺菌し易く、伝染の間に角膜の上に起こる変化の観察を可能にする。蛍光タグ付き細菌の株は、感染を可視化したり、蛍光共焦点顕微鏡を使用して組織の感染の広がりを定量化するために使用することができます。全体の角膜は、さらに、構造学または電子顕微鏡イメージングのために処理することができます。
重要なステップはプロトコルでマークされます。正常な感染を確実にするためにプロトコルを実行する際には、これらの手順に特別な注意を払う必要があります。プロトコル内で最も重要なステップは、角膜が準備中に感染を防ぐために十分な抗生物質で治療されることを保証し、その後、抗生物質が感染性生物の導入前に十分に排除されることを保証する、この場合 P.緑素吸除。このプロトコルを用いて実験を設定する場合、いくつかの例では、抗生物質を含まない培地中のインキュベーション中に濁りが生じる。この濁度は、抗生物質を含まない培地中の微生物の増殖を示すものでした。これは、抗生物質を使用した角膜の不完全な治療または取り扱い中の汚染による可能性があります。これらの角膜は、さらなる実験のために前進せず、廃棄された。インキュベーターで頻繁に殺菌を行い、フィルター付きの使い捨てピペットチップを使用し、ブタの目から角膜を切除するために使用されるツールを殺菌する際に十分な注意を払うことによって、抗生物質を含まない培地で角膜をインキュベートする際の濁度の開発を回避した。もう一つの重要なステップは、角膜が感染前にガラス型に入れられた場合である。ガラスの型は角膜の凸形を維持することを可能にする。角膜の凸度は、感染用量または角膜の表面上の治療薬の保持のための課題である。したがって、角膜とガラス型との間に適切なシールの存在を確保することが不可欠です。角膜とガラス型の間に適切なシールがある場合、カビの上のリング構造は、感染用量または治療薬のいずれかを保持するリザーバを作成します。ガラスモールドの広い部分をDMEM寒天で完全に充填することで、十分なシールが保証されます。
あらゆるモデルの場合と同様に、記載されているex vivoブタ角膜モデルに関連する制限がある。本明細書に記載されたモデルは、角膜を横切る涙膜の組成、流れおよび補充を模倣しない。まばたきによる機械的な作用もモデルに組み込まれません。文献には、涙膜組成やダイナミクス、および光の点滅が眼13から異物や微生物を除去する重要な防御機構であるという合意がある。実際、このモデルは生体内での感染時に引き起こされる免疫応答も欠けている。これらの防御機構の存在下での生体内感染の進行は、ここで説明するex vivoモデルで観察されたものとは異なる可能性がある。これらの制限にもかかわらず、ex vivoブタ角膜モデルは、2つの主な理由で既存および新興の抗菌薬の有効性をテストするのに関連しています:1)細菌増殖が角膜組織に損傷を与える能力に依存するので、ex vivoモデルの細菌の生理学は生体内の状態を模倣し、2)モデルは3次元組織を組み込んでいます。従って、ex vivoモデルは、抗菌性感受性試験のための従来の技術よりも有利である。
ここで説明するex vivoブタの角膜モデルは、ケラティスを引き起こす細菌、真菌および酵母の異なる株を研究するためにも使用することができる。このex vivo角膜モデルは再現可能であり、in vivoモデルとは異なり、短時間で複製を生成することができます。PBSの代わりに、人工涙または宿主免疫防御細胞は、理論的にはライブシナリオを模倣するために追加することができる。角膜は、殺処分時に生後約21〜23週の豚の同じ品種から得られる。したがって、複製の間の変動性は、ヒトの死体から得られたものと比較して少ない。生物医学の適用のためのブタex vivo角膜モデルを使用するという概念は、このモデルを比較しやすくする人間の目との生物学的類似性のために、ここ数年で人気を集めている。移植用にブタ角膜15,16を用いるか、ドライアイ17または創傷治癒18のモデルとして用いるものが高まっている。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
著者らは、チェスターフィールドのエリオット・アバトワールが豚の目を提供してくれたことに感謝したいと考えています。ガラスリングは、シェフィールド大学化学科のガラスブロワーダンジャクソンによって私たちのデザインに基づいて作られました。著者らは、医学研究評議会(MR/S004688/1)の資金調達に感謝したいと考えています。著者らはまた、角膜の準備に関する技術的な助けをしてくれたシャナリ・ディクウェラ夫人に感謝したいと考えています。著者たちは、写真の書式設定に協力してくれたジョナサン・エメリー氏に感謝したいと考えています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL Falcon tube | SLS | 352070 | |
| Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
| Cellstar 12 well plate | Greiner Bio-One | 665180 | |
| Dextran | Sigma | 31425-100mg-F | |
| Distel | Fisher Scientific | 12899357 | |
| DMEM + glutamax | SLS | D0819 | |
| Dual Oven Incubator | SLS | OVe1020 | Sterilising oven |
| Epidermal growth factor | SLS | E5036-200UG | |
| F12 HAM | Sigma | N4888 | |
| Foetal calf serum | Labtech International | CA-115/500 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 15307805 | |
| Handheld homogeniser 220 | Fisher Scientific | 15575809 | Homogeniser |
| Heracell VIOS 160i | Thermo Scientific | 15373212 | Tissue culture incubator |
| Heraeus Megafuge 16R | VWR | 521-2242 | Centrifuge |
| Insulin, recombinant Human | SLS | 91077C-1G | |
| LB agar | Sigma | L2897 | |
| Multitron | Infors | Not appplicable | Bacterial incubator |
| PBS | SLS | P4417 | |
| Penicillin-Streptomycin | SLS | P0781 | |
| Petri dish | Fisher Scientific | 12664785 | |
| Petri dish 35x10mm CytoOne | Starlab | CC7672-3340 | |
| Povidone iodine | Weldricks pharmacy | 2122828 | |
| Safe 2020 | Fisher Scientific | 1284804 | Class II microbiology safety cabinet |
| Scalpel blade number 15 | Fisher Scientific | O305 | |
| Scalpel Swann Morton | Fisher Scientific | 11849002 |
References
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