Summary

細菌性角膜炎に対する薬物治療を研究するためのブタEx Vivoコルネアモデルの確立

Published: May 12, 2020
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Summary

この記事では、細菌性角膜炎のex vivo ブタモデルを設定するためのステップバイステップのプロトコルについて説明します。 緑膿菌 は原型生物として用いられる。細菌増殖は、細菌が角膜組織を損傷する細菌の能力に依存するように、この革新的なモデルは、生体内感染を模倣する。

Abstract

新しい抗菌剤を開発する場合、動物試験の成功は、生体内検査から生体内の動物感染までの抗菌効果の正確な外挿に依存する。既存のin vitro試験は、典型的には拡散障壁としての宿主組織の存在が考慮されないとして抗菌効果を過大評価する。このボトルネックを克服するために、緑膿菌を原型生物として使用した細菌性角膜炎 エキビボブタコネ角膜モデルを開発しました。この資料では、ブタの角膜の調製と感染の確立のためのプロトコルについて説明します。別注ガラス型は、感染研究のための角膜の簡単なセットアップを可能にする。このモデルは、細菌の増殖が角膜組織を損傷する細菌の能力に依存するので、生体内感染を模倣する。感染の確立は、生存可能なプレート数を介して評価されるコロニー形成ユニットの数の増加として検証される。この結果は、ここで説明する方法を用いて、ex vivo角膜において非常に再現性の高い方法で感染を確立できることを示している。このモデルは、 将来的にP.緑素症以外の微生物によって引き起こされる角膜炎を模倣するために拡張することができます。このモデルの究極の目的は、生体内感染をより代表的なシナリオで抗菌化学療法が細菌感染の進行に及ぼす影響を調査することである。そうすることで、ここで説明するモデルは、検査のための動物の使用を減らし、臨床試験での成功率を向上させ、最終的には新しい抗菌薬をクリニックに迅速に翻訳することを可能にする。

Introduction

角膜感染症は失明の重要な原因であり、低所得国と中所得国の流行割合で発生します。この疾患の病因は地域によって異なるが、細菌はこれらの症例の大部分を占める。緑膿菌は、急速に進行する疾患を引き起こす重要な病原体である。多くの場合、患者は、間質瘢痕、不規則な乱視、移植を必要とする、または最悪のシナリオでは、目1、2を失う。

P.緑素症によって引き起こされる細菌性角膜炎は、特にP.緑素症の抗菌耐性株の出現の増加に起因する治療が困難な眼感染症である。過去10年の間に、角膜感染症の新しい治療法の試験と開発、一般的に、特にシュードモナスspによって引き起こされるものは、抗生物質耐性3の現在の傾向に対抗するために不可欠であることが明らかになった。

角膜感染症に対する新しい治療法の有効性を試験するために、従来のインビトロ微生物学的方法は、実験室培養中および生体内感染中の細菌生理学の差と、宿主界面4,5の欠如による貧弱な代理である。しかし、生体内動物モデルは高価で時間がかかり、少数の複製を提供し、動物の福祉に関する懸念を提起することができます。

本稿では、急性および慢性感染症に対する様々な治療法の試験に使用できる角膜炎の、簡単で再現可能なorganotypic ex vivoブタモデルを示す。今回の実験では P.緑素吸い分を 用いていますが、他の細菌や角膜炎を引き起こす真菌や酵母などの生物ともうまく機能します。

Protocol

アルビノの実験室ウサギは、ホームオフィス承認のプロトコルの下で他の計画された実験作業のために実験室で犠牲にされました。これらの研究では、目は実験用に必要とされなかったため、このプロトコルに使用されました。 1. 殺菌 クリティカルステップ:蒸留水にディステルの5%(v/v)溶液に1時間浸漬し、ブラシで洗浄し、水道水で洗い流し、最低2時間185°Cの?…

Representative Results

ガラスの金型の設計は革新的で独創的なアイデアであり、その使用により、汚染に関する問題を最小限に抑えて一貫した方法でモデルを設定することができました。金型は、設計に基づいてシェフィールド大学のガラスブロワーによって製造されました(図1A)。実験のセットアップは角膜の凸形状を維持し、感染が起こる上皮の上に細菌を保持する(図1B)?…

Discussion

このケラティスモデルの開発の主な要因は、前臨床段階で抗菌効果をより正確に決定するために、代表的なin vitroモデルを新しい抗菌剤を開発する研究者に提供することです。これは、新しい抗菌薬の開発に関与する研究者に、前臨床段階での薬物設計と製剤をより詳細に制御し、臨床試験での成功を高め、標的研究を可能にすることによって動物の使用を減らし、新しい抗菌薬を診療所に?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者らは、チェスターフィールドのエリオット・アバトワールが豚の目を提供してくれたことに感謝したいと考えています。ガラスリングは、シェフィールド大学化学科のガラスブロワーダンジャクソンによって私たちのデザインに基づいて作られました。著者らは、医学研究評議会(MR/S004688/1)の資金調達に感謝したいと考えています。著者らはまた、角膜の準備に関する技術的な助けをしてくれたシャナリ・ディクウェラ夫人に感謝したいと考えています。著者たちは、写真の書式設定に協力してくれたジョナサン・エメリー氏に感謝したいと考えています。

Materials

50 mL Falcon tube SLS 352070
Amphotericin B Sigma A2942
Cellstar 12 well plate Greiner Bio-One 665180
Dextran Sigma 31425-100mg-F
Distel Fisher Scientific 12899357
DMEM + glutamax SLS D0819
Dual Oven Incubator SLS OVe1020 Sterilising oven
Epidermal growth factor SLS E5036-200UG
F12 HAM Sigma N4888
Foetal calf serum Labtech International CA-115/500
Forceps Fisher Scientific 15307805
Handheld homogeniser 220 Fisher Scientific 15575809 Homogeniser
Heracell VIOS 160i Thermo Scientific 15373212 Tissue culture incubator
Heraeus Megafuge 16R VWR 521-2242 Centrifuge
Insulin, recombinant Human SLS 91077C-1G
LB agar Sigma L2897
Multitron Infors Not appplicable Bacterial incubator
PBS SLS P4417
Penicillin-Streptomycin SLS P0781
Petri dish Fisher Scientific 12664785
Petri dish 35x10mm CytoOne Starlab CC7672-3340
Povidone iodine Weldricks pharmacy 2122828
Safe 2020 Fisher Scientific 1284804 Class II microbiology safety cabinet
Scalpel blade number 15 Fisher Scientific O305
Scalpel Swann Morton Fisher Scientific 11849002

References

  1. Vazirani, J., Wurity, S., Ali, M. H. Multidrug-Resistant Pseudomonas aeruginosa Keratitis Risk Factors, Clinical Characteristics, and Outcomes. Ophthalmology. 122 (10), 2110-2114 (2015).
  2. Sharma, S. Keratitis. Bioscience Reports. 21 (4), 419-444 (2001).
  3. Sharma, G., et al. Pseudomonas aeruginosa biofilm: Potential therapeutic targets. Biologicals. 42 (1), 1-7 (2014).
  4. Ersoy, S. C., et al. Correcting a Fundamental Flaw in the Paradigm for Antimicrobial Susceptibility Testing. EBioMedicine. 20, 173-181 (2017).
  5. Kubicek-Sutherland, J. Z., et al. Host-dependent Induction of Transient Antibiotic Resistance: A Prelude to Treatment Failure. EBioMedicine. 2 (9), 1169-1178 (2015).
  6. Pinnock, A., et al. Ex vivo rabbit and human corneas as models for bacterial and fungal keratitis. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 255 (2), 333-342 (2017).
  7. Harman, R. M., Bussche, L., Ledbetter, E. C., Van de Walle, G. R. Establishment and Characterization of an Air-Liquid Canine Corneal Organ Culture Model To Study Acute Herpes Keratitis. Journal of Virology. 88 (23), 13669-13677 (2014).
  8. Madhu, S. N., Jha, K. K., Karthyayani, A. P., Gajjar, D. U. Ex vivo Caprine Model to Study Virulence Factors in Keratitis. Journal of Ophthalmic & Vision Research. 13 (4), 383-391 (2018).
  9. Vermeltfoort, P. B. J., van Kooten, T. G., Bruinsma, G. M., Hooymans, A. M. M., vander Mei, H. C., Busscher, H. J. Bacterial transmission from contact lenses to porcine corneas: An ex vivo study. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (6), 2042-2046 (2005).
  10. Duggal, N., et al. Zinc oxide tetrapods inhibit herpes simplex virus infection of cultured corneas. Molecular Vision. 23, 26-38 (2017).
  11. Brothers, K., et al. Bacterial Impediment of Corneal Cell Migration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (7), (2015).
  12. Alekseev, O., Tran, A. H., Azizkhan-Clifford, J. Ex vivo Organotypic Corneal Model of Acute Epithelial Herpes Simplex Virus Type I Infection. Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).
  13. Sack, R. A., Nunes, I., Beaton, A., Morris, C. Host-Defense Mechanism of the Ocular Surfaces. Bioscience Reports. 21 (4), 463-480 (2001).
  14. Kunzmann, B. C., et al. Establishment of a porcine corneal endothelial organ culture model for research purposes. Cell and Tissue Banking. 19 (3), 269-276 (2018).
  15. Oh, J. Y., et al. Processing Porcine Cornea for Biomedical Applications. Tissue Engineering Part C-Methods. 15 (4), 635-645 (2009).
  16. Shi, W. Y., et al. Protectively Decellularized Porcine Cornea versus Human Donor Cornea for Lamellar Transplantation. Advanced Functional Materials. 29, 1902491-1902503 (2019).
  17. Menduni, F., Davies, L. N., Madrid-Costa, D., Fratini, A., Wolffsohn, J. S. Characterisation of the porcine eyeball as an in-vitro model for dry eye. Contact Lens & Anterior Eye. 41 (1), 13-17 (2018).
  18. Castro, N., Gillespie, S. R., Bernstein, A. M. Ex vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies. Journal of Visualized Experiments. (144), (2019).

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Okurowska, K., Roy, S., Thokala, P., Partridge, L., Garg, P., MacNeil, S., Monk, P. N., Karunakaran, E. Establishing a Porcine Ex Vivo Cornea Model for Studying Drug Treatments against Bacterial Keratitis. J. Vis. Exp. (159), e61156, doi:10.3791/61156 (2020).

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