Summary
Den här artikeln beskriver ett steg-för-steg-protokoll för att ställa in en ex vivo svin modell av bakteriell keratitis. Pseudomonas aeruginosa används som prototypisk organism. Denna innovativa modell efterliknar in vivo-infektion eftersom bakteriell spridning är beroende av bakteriens förmåga att skada hornhinnans vävnad.
Abstract
Vid utveckling av nya antimikrobiella medel är framgången för djurförsök beroende av korrekt extrapolering av antimikrobiell effekt från in vitro-tester till djurinfektioner in vivo. De befintliga in vitro-testerna överskattar vanligtvis antimikrobiell effekt eftersom förekomsten av värdvävnad som diffusionsbarriär inte redovisas. För att övervinna denna flaskhals har vi utvecklat en ex vivo svin hornhinnans modell av bakteriell keratitis med Pseudomonas aeruginosa som en prototypisk organism. Denna artikel beskriver beredningen av svin hornhinnan och protokollet för upprättande av infektionen. Skräddarsydda glasformar möjliggör enkel inställning av hornhinnan för infektionsstudier. Modellen efterliknar in vivo-infektion eftersom bakteriell spridning är beroende av bakteriens förmåga att skada hornhinnans vävnad. Etablering av infektion verifieras som en ökning av antalet kolonibildande enheter som bedöms via livskraftiga plåträkningar. Resultaten visar att infektion kan fastställas på ett mycket reproducerbart sätt i ex vivo hornhinnorna med hjälp av den metod som beskrivs här. Modellen kan i framtiden utvidgas till att efterlikna keratit orsakad av andra mikroorganismer än P. aeruginosa. Det slutliga syftet med modellen är att undersöka effekten av antimikrobiell kemoterapi på utvecklingen av bakteriell infektion i ett scenario som är mer representativt för in vivo-infektioner. På så sätt kommer den modell som beskrivs här att minska användningen av djur för testning, förbättra framgångsgraden i kliniska prövningar och i slutändan möjliggöra snabb översättning av nya antimikrobiella medel till kliniken.
Introduction
Hornhinnans infektioner är viktiga orsaker till blindhet och förekommer i epidemiska proportioner i låg- och medelinkomstländer. Sjukdomens etiologi varierar från region till region men bakterier står för en stor majoritet av dessa fall. Pseudomonas aeruginosa är en viktig patogen som orsakar en snabbt progressiv sjukdom. I många fall lämnas patienter med stromal ärrbildning, oregelbunden astigmatism, kräver transplantation eller i värsta fall förlorar ett öga1,2.
Bakteriell keratit orsakad av P. aeruginosa är en svår ögoninfektion att behandla särskilt på grund av den ökande uppkomsten av antimikrobiella resistenta stammar av P. aeruginosa. Under det senaste decenniet har det blivit uppenbart att testning och utveckling av nya behandlingar för hornhinnainfektioner i allmänhet och de som orsakas av Pseudomonas sp., i synnerhet, är avgörande för att bekämpa den nuvarande trenden för antibiotikaresistens3.
För att testa effekten av nya behandlingar för hornhinnainfektioner är konventionella mikrobiologiska metoder in vitro en dålig surrogat på grund av skillnaden i bakteriefysiologi under laboratoriekulturen och under infektioner in vivo samt på grund av bristen påvärdgränssnittet 4,5. In vivo-djurmodeller är dock dyra, tidskrävande, kan bara leverera ett litet antal replikat och väcka oro för djurens välbefinnande.
I den här artikeln visar vi en enkel och reproducerbar organotypisk ex vivo svin modell av keratitis som kan användas för att testa olika behandlingar för akuta och kroniska infektioner. Vi har använt P. aeruginosa för detta experiment men modellen fungerar också bra med andra bakterier, och organismer som svampar och jäst som orsakar keratit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Albino laboratoriekaniner offrades i laboratoriet för annat planerat experimentellt arbete under hemmakontoret godkända protokoll. Ögonen krävdes inte för experimentell användning i dessa studier så de användes för detta protokoll.
1. Sterilisering
- KRITISKT STEG: Desinficera alla tångar och saxar genom att blötlägga i 1 timme i 5% (v/v) lösning av Distel i destillerat vatten, rengör med en borste, skölj med kranvatten och sterilisera i en ugn vid 185 °C i minst 2 timmar.
- Sterilisera alla andra glas och reagenser genom autoklavering vid 121 °C i 15 minuter eller förbered reagenser enligt tillverkarens instruktioner. Utför följande procedurer i ett mikrobiologiskt säkerhetsskåp av klass II.
2. Provtagning
- Insamling av svinögon
- Stora vita landrace suggor, ett kors med en Hampshire vildsvin användes. Djuren bedövades med en elektrisk ström och ögonen var enucleated 2 h senare i slakteriet.
- KRITISKT STEG: När du är uppringd, överför ögonen till labbet i en steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS) för att förhindra att de torkar ut och bearbetar dem omedelbart vid ankomsten.
- Samling av kaninögon
- Ta bort hornhinnorna och skicka till labbet i steril PBS.
3. Förberedelse av hornhinnanscleral knapp
- Använd sterila tångar för att hålla vävnaden som omger ögongloben och överför den till en petriskål. Ta bort bindhinnan och muskelvävnaden runt ögongloben på en petriskål med skalpellblad nr 15 och tång.
- Lyft försiktigt ögongloben medan du håller synnerven med tång och överför till en 0,5 L burk fylld med steril PBS.
- När alla ögon har rensats från omgivande vävnad, flytta dem med sterila tångar till en annan 0,5 L burk fylld med 3% (v/v) povidone jod i PBS och lämna i 1 min.
- Överför ögonglober till en annan 0,5 L burk med steril PBS.
- Använd tång för att hålla ögat stilla på en petriskål och gör ett snitt nära hornhinnan med ett skalpellblad nr 10A.
- KRITISKT STEG: Håll kanten på snittet och använd saxen för att ta bort hornhinnan och lämna ca 3 mm sklera runt hornhinnan. Se till att den skarpa änden av saxen inte genomtränger iris eller choroidalvävnaden och är i det supra-choroidala utrymmet.
- Håll corneoscleral-knappen med tång och använd ett annat par spetsiga ändtångar för att försiktigt separera uvealvävnaden.
- Lyft corneoscleral-knappen från återstående jordglob och skölj den kort i 1,5% (v/v) povidone jodlösning i PBS i en 12 brunnsplatta.
- Placera hornhinnanscleralknapp i ytterligare 12 brunnsplatta fylld med steril PBS.
- Efter bearbetning av alla ögon(rekommenderad maximalt 40 ögon i ett parti),placera varje hornhinnaknapp på en individuell petriskål (34 mm diameter) epitelsida upp och häll i 3 ml odlingsmedium förvärmt till 37 °C.
OBS: Sammansättningen av odlingsmediet är följande: Dulbeccos modifierade Eagle's medium (DMEM): Hams [1:1] kompletterad med 5 μg▼mL-1 insulin och 10 ng▼mL-1 epidermal tillväxtfaktor (EGF), 10% (v/v) fostrets kalvserum (FCS), 100 U▼mL-1 penicillin, 100 U▼mL-1 streptomycin och 2,5 μg▼mL-1 amphotericin B. Som ett valfritt steg kan mediet kompletteras med 50 g▼L-1 dextran för att förhindra svullnad av den strukna hornhinnan under de ytterligare inkubationsstegen. - Inkubera vid 37 °C i en fuktad vävnadskulturinkubator.
4. Underhåll av hornhinnans knappar
- Efter 24 timmar, använd aseptisk teknik för att ta bort media och ersätta med 3 ml färska förvärmda odlingsmedier som innehåller antibiotika. Förvara hornhinneknapparna i media med antibiotika i 48 timmar för att desinficera hornhinnorna. Inkubera vid 37 °C i en fuktad vävnadskulturinkubator.
- KRITISKT STEG: Efter 48 timmar, ta bort mediet och skölj hornhinnorna med 2 ml PBS. Håll sedan hornhinnorna i antibiotikafria medier i minst två eller helst tre dagar före experimentell infektion, för att ta bort återstående antibiotika från vävnaden.
- Inkubera vid 37 °C i en fuktad vävnadskulturinkubator. Byt media minst en gång till inom dessa tre dagar. Kassera hornhinnorna om någon grumlighet utvecklas i det antibiotikafria mediet.
5. Beredning av ett inokulat
- Häll 10 ml LB-buljong i en 50 ml konisk kolv med skumpropp.
- Överför en koloni av P. aeruginosa stam PAO1 eller stam PA14 från en färsk agarplatta och inkubera vid 37 °C i 3-4 h tills bakterierna är i mitten av stockfasen.
- Överför bakteriekulturen till ett 50 ml-rör och centrifug vid 3 000 x g i 5 minuter. Ta bort supernaten och sätt tillbaka cellpelleten i PBS.
- Upprepa steg 5.3 två gånger till för att tvätta cellerna. Suspendera cellpelleten i PBS igen och justera den optiska densiteten vid 600 nm till cirka 0,6 med steril PBS som blankvatten.
6. Infektera corneoscleral-knappen
- Ta bort media från petriskålen och skölj hornhinnorna två gånger med 1 ml steril PBS.
- Pressa försiktigt tången medan du håller hornhinnan däremellan. Använd en 10A-skalpell för att göra fyra snitt – två vertikala, två horisontella – i den centrala delen av hornhinnans knapp genom epitelskiktet till den underliggande stromen.
- Placera en steril glasform i en 6-brunnsplatta med den breda delen upp och placera hornhinnan i mitten av glasformen, epitelsidan vänd nedåt. Gör snittet rätt i mitten av den nedre delen av glasformen.
- KRITISKT STEG: Häll 1 ml 1% (w/v) låg smältpunkt agar upplöst i DMEM för att fylla glasformen med hornhinna helt.
- Låt agaren ställa in och vänd sedan glasformen så att hornhinnans epitel är vänd uppåt.
- Pipett 15 μL av bakteriekulturen med OD600nm = 0,6 (för P. aeruginosa motsvarar detta cirka 1 x 107 kolonibildande enheter (CFU) i 15 μL) direkt i ett klippt område och tillsätt sedan 85 μL PBS till toppen för att hålla hornhinnans epitel fuktig. Späd ut den återstående bakteriekulturen och plattan på agar för att räkna kolonibildande enheter för inokulat.
- Tillsätt 1 ml DMEM utan antibiotika till botten av varje brunn med glasformen. Inkubera 6-brunnsplattan med de infekterade hornhinnorna i en fuktad inkubator vid 37 °C med 5% CO2 i upp till 24 timmar.
- Sätt upp oinfekterad kontroll hornhinna vid sidan av varje experiment. För att ställa in oinfekterad kontroll, byt ut bakteriekulturens 15 μL i steg 6.6 mot steril PBS.
7. Homogenisering av hornhinnan för att skörda bakterierna
- Kassera DMEM-mediet från botten av 6-brunnsplattan och tillsätt 1 ml steril PBS för att skölja brunnens botten.
- Ta försiktigt bort PBS genom att pipetting utan att röra den centrala delen av hornhinnanscleral knapp. Ta bort glasringen med sterila tångar och placera den i 5% Distel.
- Skölj försiktigt toppen av hornhinnanscleralknapp med 1 ml PBS två gånger [valfritt].
- Håll kanten på hornhinnanscleralknapp med fina spetstångar och lossa den från agaren under.
- Överför hornhinnan till ett 50 ml rör fyllt med iskallt 1-2 ml PBS.
- Använd en fin spets homogenisator för att hälla toppen av den infekterade hornhinnan. Vävnaden behöver inte vara helt likviderad. Homogenisatorn hjälper till att lossa bakterier från hornhinnans epitel och det skurna området.
- Virvel hornhinnan i PBS i några sekunder för att blanda innehållet.
- Tillsätt 20 μL homogenatet till 180 μL PBS och utför seriella utspädningar i en 96 brunnsplatta.
- Späd suspensionen seriellt till10-4 och 10-5 utspädning och pipett 10 μL av det utspädda homogenatet med bakterier på en blodagarplatta. Inkubera plattan i 8 timmar och räkna antalet CFU. Vid testning av effekten av antimikrobiella medel skall lämplig utspädningsfaktor ankomas experimentellt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Utformningen av glasformarna är en innovativ och originell idé, vars användning gjorde det möjligt för oss att ställa in modellen på ett konsekvent sätt med minimala / inga problem med förorening. Formarna förbereddes av en glasblåsare vid University of Sheffield baserat på en design (Figur 1A). Den experimentella inställningen bibehåller hornhinnans konvexa form och håller bakterier på toppen av epitelet där infektion äger rum (Figur 1B).
Svin hornhinnorna sväller vanligtvis efter några dagar i medium. Detta är normalt och vi fann att det inte fanns någon signifikant skillnad mellan hornhinnor med och utan tillsats av dextran, som vanligtvis tillsätts för att förhindra svullnad av hornhinnan (Figur 1H). Hornhinnorna skadas vanligtvis för att hjälpa bakterierna att tränga in i epitelet. Även om det inte fanns någon signifikant skillnad i infektionsförloppet mellan sårade (skurna) och oanvända (oklippta) hornhinner, märkte vi fler variationer mellan replikat i oklippta hornhinnor (Figur 1C). Att tvätta hornhinnorna två gånger med PBS tar bort överflödiga bakterier som inte fästs på epitelet. Det fanns en signifikant skillnad i CFU mellan tvättade och otvättade svin hornhinnorna infekterade med P. aeruginosa PAO1 i 24 timmar (Figur 1D). Det fanns ingen signifikant skillnad i CFU-räkningar mellan svin och kaninmajonhinnorna infekterade med PA14 och PAO1 (figur 1E,1F). Resultaten för båda modellerna var reproducerbara. Efter 24 timmar utvecklar hornhinnan infekterad med antingen Pseudomonas stam alltid opacitet och skärområdet blir mer synligt och öppet i jämförelse med den oinfekterade hornhinnan (Figur 1G).
Figur 1: Ex vivo hornhinna infekterad med Pseudomonas aeruginosa. A)Schematisk bild av en glasform som används för att bibehålla hornhinnans form och underlätta införandet av bakterier och behandlingar. Tjockleken på glasformarna är 1,5 mm och är densamma som tjockleken på provrör gjorda av borosilikatglas. B)Schematisk bild av den experimentella uppsättningen. C)Testa effekten av sårning på det slutliga CFU-antalet efter homogenisering. Uncut (n = 16) och cut (n = 28) hornhinnorna var infekterade med P. aeruginosa PAO1 och P. aeruginosa PA14 i 24 timmar. Hornhinnorna tvättades med 1 ml PBS före homogenisering. Felstaplar anger standardavvikelse. (D) Testa effekten av att tvätta hornhinnorna med 2 x 1 ml PBS (n = 6) och inte tvätta (n = 6) på det slutliga CFU-antalet efter infektion med P. aeruginosa PAO1 i 24 timmar. Felstaplar anger standardavvikelse. (E) Slutlig CFU-räkning i svinmajsar infekterade med P. aeruginosa PAO1 och P. aeruginosa PA14 i 24 timmar (n = 10). Hornhinnorna tvättades och skars. Felstaplar anger standardavvikelse. F)Slutlig CFU-räkning i kaninmakar som är infekterade med P. aeruginosa PAO1 och P. aeruginosa PA14 i 24 timmar (n = 6). Hornhinnorna tvättades och skars. Felstaplar anger standardavvikelse. (G) Bilder av ex vivo svin hornhinnorna infekterade med P. aeruginosa PAO1 i 24 timmar. Kontrollen skadades men inga bakterier tillsattes. De infekterade hornhinnorna skadades och 107 CFU lades till den skurna sidan. Ingen CFU återfanns från kontroll hornhinnan. (H) Slutlig CFU återhämtade sig efter 24 timmars infektion med P. aeruginosa PAO1 från hornhinnorna behandlade med dextran (n = 2) och de utan dextran (n = 9). Hornhinnorna tvättades och skars. Felstaplar anger standardavvikelse. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den främsta drivkraften bakom utvecklingen av denna keratitmodell med ex vivo-svin hornhinnan är att ge forskare som utvecklar nya antimikrobiella medel en representativ in vitro-modell för att mer exakt bestämma antimikrobiell effekt i prekliniska stadier. Detta kommer att ge forskare som är involverade i att utveckla nya antimikrobiella medel större kontroll över läkemedelsdesign och formulering i de prekliniska stadierna, öka framgången vid kliniska prövningar, minska användningen av djur genom att möjliggöra riktade studier och resultera i snabbare översättning av nya antimikrobiella medel till kliniken.
Ett antal studier har undersökt effekten av infektioner på ex vivo hornhinnor från olika djur som:kanin 6,hund7,get8 och grisar9,10,11. De flesta av dessa studier fokuserar på sätt attetablera 6 och visualisera eninfektion 9 men hittills har det bara varit några publikationer med fokus på läkemedelstestning och noggrann kvantifiering av bakterier6,7,8,12.
Den främsta fördelen med vår modell är tillgången på svin hornhinnorna som en del av livsmedelskedjan. Användningen av ex vivo-hornhinnorna överensstämmer därför med principen om 3R, som är att ersätta, förfina och minska användningen av djur i forskning, samtidigt som man tillhandahåller en representativ modell av värdgränssnittet. Vi har inte observerat några problem med kontaminering av hornhinnans explanter om protokollet följs strikt. Glasformarna är mycket enkla, snabba och enkla att använda utan krav på specialiserad utrustning. Den smala ringen på toppen gör tillsatsen av en liten mängd av ett testat läkemedel (100 μL) eller bakterier bekvämt. Glasformens ring tillåter PBS med bakterier eller en läkemedelslösning att behållas i den centrala delen av hornhinnan och förhindrar att bakterierna kommer under hornhinnan. Ringen är lätt att rengöra och sterilisera och gör det möjligt att observera de förändringar som uppstår på toppen av hornhinnan under infektion. Stammar av fluorescerande märkta bakterier kan användas för att visualisera infektion eller kvantifiera smittspridningen i vävnaden med fluorescerande konfokal mikroskopi. Hela hornhinnorna kan bearbetas ytterligare för histologi eller elektronmikroskopiavbildning.
De kritiska stegen markeras i protokollet. Extra uppmärksamhet måste ägnas åt dessa steg när protokollet utförs för att säkerställa framgångsrik infektion. De mest kritiska stegen inom protokollet är att se till att hornhinnorna behandlas med tillräckliga antibiotika för att förhindra infektion under beredningen och sedan att antibiotikan elimineras tillräckligt före införandet av den smittsamma organismen, i detta fall P. aeruginosa. När man ställer in experimenten med hjälp av detta protokoll, i vissa fall, grumlighet utvecklats under inkubation i det antibiotikafria mediet. Denna grumlighet var vägledande för tillväxten av mikroorganismer i det antibiotikafria mediet. Detta kan bero på ofullständig behandling av hornhinnan med antibiotika eller på grund av förorening under hanteringen. Dessa hornhinnor togs inte framåt för ytterligare experiment och kasserades. Utveckling av grumlighet vid inkubation av hornhinnorna i antibiotikafritt medium undveks genom att använda frekventa steriliseringskörningar i inkubatorn, använda engångspipettspetsar med ett filter och ta tillräcklig försiktighet vid sterilisering av de verktyg som används för att excisera hornhinnan från svinögonen. Ett annat kritiskt steg är när hornhinnorna placeras i glasformen före infektion. Glasformen gör det möjligt att behålla hornhinnans konvexa form. Hornhinnans konvexitet är en utmaning för retention av antingen den smittsamma dosen eller det terapeutiska medlet på hornhinnans yta. Därför är det viktigt att säkerställa närvaron av tillräcklig tätning mellan hornhinnan och glasformen. När det finns tillräcklig tätning mellan hornhinnan och glasformen skapar ringstrukturen ovanför formen en reservoar för att behålla antingen infektionsdosen eller det terapeutiska medlet. En tillräcklig tätning säkerställs genom att helt fylla den breda delen av glasformen med DMEM-agar upp till brädden.
Som är fallet med alla modeller finns det begränsningar förknippade med ex vivo svin hornhinnan modell beskrivs. Modellen som beskrivs häri efterliknar inte sammansättningen, flödet och påfyllningen av tårfilmen över hornhinnan. Den mekaniska verkan som tillhandahålls genom blinkning ingår inte heller i modellen. Det finns en överenskommelse i litteraturen att riva filmkomposition och dynamik, och blinkande är viktiga försvarsmekanismer som tar bort främmande partiklar och mikroorganismer från ögat13. Faktum är att modellen också saknar ett immunsvar som utlöses under infektion in vivo. Det är troligt att progressionen av infektion in vivo i närvaro av dessa försvarsmekanismer skiljer sig från den som observerats i ex vivo-modellen som beskrivs här. Trots dessa begränsningar är ex vivo-gris hornhinnans modell relevant för att testa effektiviteten hos befintliga och framväxande antimikrobiella medel av två huvudsakliga skäl: 1) bakteriernas fysiologi i ex vivo-modellen efterliknar in vivo-tillstånden eftersom bakteriell spridning är beroende av deras förmåga att skada hornhinnans vävnad, och 2) modellen innehåller den tredimensionella vävnaden som en diffusionsbarriär för terapeutiska liknande i in vivo-situationen. Därför är ex vivo-modellen fördelaktig jämfört med konventionella tekniker för antimikrobiell känslighetstestning.
Ex vivo-svin hornhinnans modell som beskrivs här kan också användas för att studera olika stammar av bakterier, svampar och jäst som orsakar keratit. Denna ex vivo hornhinnans modell är reproducerbar och gör det möjligt att generera replikat inom en kort tid till skillnad från in vivo-modeller. Istället för PBS kan konstgjorda tårar eller värd immunförsvarsceller teoretiskt läggas till för att efterlikna det levande scenariot. Hornhinnorna erhålls från samma ras av grisar och är ca 21-23 veckor gamla när de slaktas. Därför finns det mindre variation mellan replikat jämfört med de som erhålls från mänskliga kadaver. Konceptet att använda en svin ex vivo hornhinnans modell för biomedicinska applikationer har fått mer popularitet under de senaste åren på grund av dess biologiska likhet med det mänskliga ögat vilket gör denna modell lättare att jämföra14. Det finns ökat intresse för att använda svin hornhinnorna för transplantation15,16 eller som modell för torra ögon17 eller sårläkning18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Elliot Abattoir i Chesterfield för att ha gett svinögon. Glasringarna tillverkades baserat på vår design av glasblåsaren Dan Jackson från Kemiska institutionen vid University of Sheffield. Författarna vill tacka Medicinska forskningsrådet (MR/S004688/1) för finansieringen. Författarna vill också tacka Shanali Dikwella för teknisk hjälp med hornhinneberedningen. Författarna vill tacka Jonathan Emery för hjälp med att formatera bilder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL Falcon tube | SLS | 352070 | |
| Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
| Cellstar 12 well plate | Greiner Bio-One | 665180 | |
| Dextran | Sigma | 31425-100mg-F | |
| Distel | Fisher Scientific | 12899357 | |
| DMEM + glutamax | SLS | D0819 | |
| Dual Oven Incubator | SLS | OVe1020 | Sterilising oven |
| Epidermal growth factor | SLS | E5036-200UG | |
| F12 HAM | Sigma | N4888 | |
| Foetal calf serum | Labtech International | CA-115/500 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 15307805 | |
| Handheld homogeniser 220 | Fisher Scientific | 15575809 | Homogeniser |
| Heracell VIOS 160i | Thermo Scientific | 15373212 | Tissue culture incubator |
| Heraeus Megafuge 16R | VWR | 521-2242 | Centrifuge |
| Insulin, recombinant Human | SLS | 91077C-1G | |
| LB agar | Sigma | L2897 | |
| Multitron | Infors | Not appplicable | Bacterial incubator |
| PBS | SLS | P4417 | |
| Penicillin-Streptomycin | SLS | P0781 | |
| Petri dish | Fisher Scientific | 12664785 | |
| Petri dish 35x10mm CytoOne | Starlab | CC7672-3340 | |
| Povidone iodine | Weldricks pharmacy | 2122828 | |
| Safe 2020 | Fisher Scientific | 1284804 | Class II microbiology safety cabinet |
| Scalpel blade number 15 | Fisher Scientific | O305 | |
| Scalpel Swann Morton | Fisher Scientific | 11849002 |
References
- Vazirani, J., Wurity, S., Ali, M. H. Multidrug-Resistant Pseudomonas aeruginosa Keratitis Risk Factors, Clinical Characteristics, and Outcomes. Ophthalmology. 122 (10), 2110-2114 (2015).
- Sharma, S.
- Sharma, G., et al. Pseudomonas aeruginosa biofilm: Potential therapeutic targets. Biologicals. 42 (1), 1-7 (2014).
- Ersoy, S. C., et al. Correcting a Fundamental Flaw in the Paradigm for Antimicrobial Susceptibility Testing. EBioMedicine. 20, 173-181 (2017).
- Kubicek-Sutherland, J. Z., et al. Host-dependent Induction of Transient Antibiotic Resistance: A Prelude to Treatment Failure. EBioMedicine. 2 (9), 1169-1178 (2015).
- Pinnock, A., et al. Ex vivo rabbit and human corneas as models for bacterial and fungal keratitis. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 255 (2), 333-342 (2017).
- Harman, R. M., Bussche, L., Ledbetter, E. C., Van de Walle, G. R. Establishment and Characterization of an Air-Liquid Canine Corneal Organ Culture Model To Study Acute Herpes Keratitis. Journal of Virology. 88 (23), 13669-13677 (2014).
- Madhu, S. N., Jha, K. K., Karthyayani, A. P., Gajjar, D. U. Ex vivo Caprine Model to Study Virulence Factors in Keratitis. Journal of Ophthalmic & Vision Research. 13 (4), 383-391 (2018).
- Vermeltfoort, P. B. J., van Kooten, T. G., Bruinsma, G. M., Hooymans, A. M. M., vander Mei, H. C., Busscher, H. J. Bacterial transmission from contact lenses to porcine corneas: An ex vivo study. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (6), 2042-2046 (2005).
- Duggal, N., et al. Zinc oxide tetrapods inhibit herpes simplex virus infection of cultured corneas. Molecular Vision. 23, 26-38 (2017).
- Brothers, K., et al. Bacterial Impediment of Corneal Cell Migration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (7), (2015).
- Alekseev, O., Tran, A. H., Azizkhan-Clifford, J. Ex vivo Organotypic Corneal Model of Acute Epithelial Herpes Simplex Virus Type I Infection. Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).
- Sack, R. A., Nunes, I., Beaton, A., Morris, C.
- Kunzmann, B. C., et al. Establishment of a porcine corneal endothelial organ culture model for research purposes. Cell and Tissue Banking. 19 (3), 269-276 (2018).
- Oh, J. Y., et al. Processing Porcine Cornea for Biomedical Applications. Tissue Engineering Part C-Methods. 15 (4), 635-645 (2009).
- Shi, W. Y., et al. Protectively Decellularized Porcine Cornea versus Human Donor Cornea for Lamellar Transplantation. Advanced Functional Materials. 29, 1902491-1902503 (2019).
- Menduni, F., Davies, L. N., Madrid-Costa, D., Fratini, A., Wolffsohn, J. S. Characterisation of the porcine eyeball as an in-vitro model for dry eye. Contact Lens & Anterior Eye. 41 (1), 13-17 (2018).
- Castro, N., Gillespie, S. R., Bernstein, A. M. Ex vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies. Journal of Visualized Experiments. (144), (2019).
