Summary
توضح هذه المقالة بروتوكول خطوة بخطوة لإعداد نموذج مُنَقَر vivo السابقين من التهاب القرنية البكتيري. يستخدم Pseudomonas aeruginosa ككائن اضروبي. هذا النموذج المبتكر يحاكي في العدوى الجسمية كما تكاثر البكتيريا يعتمد على قدرة البكتيريا على تلف أنسجة القرنية.
Abstract
عند تطوير مضادات الميكروبات الجديدة ، يعتمد نجاح التجارب الحيوانية على استقراء دقيق لنجاعة مضادات الميكروبات من الاختبارات المختبرية إلى العدوى الحيوانية في الجسم الحي. وعادة ما تبالغ الاختبارات المختبرية الموجودة في تقدير فعالية مضادات الميكروبات لأن وجود الأنسجة المضيفة كحاجز للنشر لا يُحَدَّد. للتغلب على هذا عنق الزجاجة، قمنا بتطوير نموذج القرنية السابق vivo porecine من التهاب القرنية البكتيري باستخدام Pseudomonas aeruginosa ككائن حي نموذجي. توضح هذه المقالة إعداد القرنية بورسين والبروتوكول لإنشاء العدوى. قوالب الزجاج مفصل تمكين الإعداد مباشرة من القرنية لدراسات العدوى. نموذج يحاكي في العدوى الجسمية كما تكاثر البكتيريا يعتمد على قدرة البكتيريا على تلف أنسجة القرنية. يتم التحقق من إنشاء العدوى كزدّة في عدد وحدات تشكيل المستعمرة التي تم تقييمها عبر عد الصفائح القابلة للتطبيق. النتائج تثبت أنه يمكن أن تنشأ العدوى بطريقة استنساخها للغاية في القرنيات السابقين vivo باستخدام الطريقة الموصوفة هنا. ويمكن توسيع النموذج في المستقبل لتقليد التهاب القرنية الناجم عن الكائنات الحية الدقيقة غير P. aeruginosa. الهدف النهائي من هذا النموذج هو التحقيق في تأثير العلاج الكيميائي المضاد للميكروبات على تقدم العدوى البكتيرية في سيناريو أكثر تمثيلاً في العدوى الجسمية. وبذلك، فإن النموذج الموصوف هنا سيقلل من استخدام الحيوانات للاختبار، ويحسن معدلات النجاح في التجارب السريرية، وفي نهاية المطاف سيمكن من الترجمة السريعة لمضادات الميكروبات الجديدة إلى العيادة.
Introduction
31 - تعد عدوى القرنية من الأسباب الهامة للعمى، وتحدث بنسب وبائية في البلدان المنخفضة الدخل والبلدان المتوسطة الدخل. وتختلف مسببات المرض من منطقة إلى أخرى ولكن البكتيريا تمثل أغلبية كبيرة من هذه الحالات. Pseudomonas aeruginosa هو الممرض المهم الذي يسبب مرض تقدمية بسرعة. في كثير من الحالات، ويترك المرضى مع تندب stromal، الاستجماتيزم غير النظامية، تتطلب زرع أو في أسوأ سيناريو، تفقد العين1،2.
التهاب القرنية البكتيرية الناجمة عن P. aeruginosa هو عدوى العين صعبة لعلاج خاصة بسبب الظهور المتزايد لسلالات مقاومة مضادات الميكروبات من P. aeruginosa. خلال العقد الماضي، أصبح من الواضح أن اختبار وتطوير علاجات جديدة لالتهابات القرنية، بشكل عام، وتلك التي تسببها Pseudomonas sp.، على وجه الخصوص، ضرورية لمكافحة الاتجاه الحالي في مقاومة المضادات الحيوية3.
لاختبار فعالية العلاجات الجديدة لالتهابات القرنية ، والأساليب التقليدية في المختبرات الميكروبيولوجية هي بديل الفقراء بسبب الفرق في علم وظائف الأعضاء البكتيرية خلال الثقافة المختبرية ، وخلال الالتهابات في الجسم الحي وكذلك بسبب عدم وجود واجهة المضيف4،5. في نماذج الحيوانات الحية، ومع ذلك، هي مكلفة، تستغرق وقتا طويلا، لا يمكن إلا أن تقديم عدد قليل من النسخ المتماثلة وإثارة المخاوف بشأن رعاية الحيوان.
في هذه المقالة، ونحن نبرهن على بسيطة وقابلة للاستنساخ organotypic السابقين vivo porcine نموذج من التهاب القرنية التي يمكن استخدامها لاختبار العلاجات المختلفة للعدوى الحادة والمزمنة. لقد استخدمنا P. aeruginosa لهذه التجربة ولكن النموذج يعمل أيضا بشكل جيد مع البكتيريا الأخرى، والكائنات الحية مثل الفطريات والخميرة التي تسبب التهاب القرنية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم التضحية بالأرانب مختبر ألبينو في المختبر من أجل غيرها من الأعمال التجريبية المخطط لها في إطار بروتوكولات وزارة الداخلية المعتمدة. لم تكن العيون مطلوبة للاستخدام التجريبي في تلك الدراسات لذلك تم استخدامها لهذا البروتوكول.
1- التعقيم
- الخطوة الحرجة: تطهير جميع ملقط ومقص عن طريق نقع لمدة 1 ساعة في 5٪ (الخامس / الخامس) حل من Distel في الماء المقطر، وتنظيف مع فرشاة، وشطف مع ماء الصنبور وتعقيم في فرن في 185 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 2 ساعة.
- تعقيم جميع الأواني الزجاجية والكواشف الأخرى عن طريق autoclaving في 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة أو إعداد الكواشف وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. تنفيذ الإجراءات التالية في مجلس الوزراء سلامة الميكروبيولوجيا من الدرجة الثانية.
2. عينة جمع
- جمع عيون بورسين
- بذرات لاندراس بيضاء كبيرة، تم استخدام صليب مع خنزير هامبشاير. وقد ذهلت الحيوانات مع تيار كهربائي وكانت العينين enucleated 2 ساعة في وقت لاحق في المسلخ.
- الخطوة الحرجة: مرة واحدة enucleated، نقل العينين إلى المختبر في محلول الفوسفات المعقم المخزنة (PBS) لمنعهم من الجفاف ومعالجتها على الفور عند الوصول.
- جمع عيون الأرانب
- اُخراج القرنيات وإرسالها إلى المختبر في برنامج تلفزيوني معقمة.
3. إعداد زر الكورنيا
- استخدام ملقط العقيمة لعقد الأنسجة المحيطة مقلة العين ونقلها إلى طبق بيتري. إزالة الملتحمة والأنسجة العضلية حول مقلة العين على طبق بيتري باستخدام شفرة مشرط رقم 15 والملذات.
- رفع بلطف مقلة العين في حين عقد العصب البصري مع ملقط ونقلها إلى جرة 0.5 لتر مليئة برنامج تلفزيوني عقيم.
- مرة واحدة يتم مسح جميع العيون من الأنسجة المحيطة بها، ونقلها باستخدام ملقط العقيمة إلى آخر 0.5 لتر جرة مليئة 3٪ (الخامس / الخامس) بودينيد في برنامج تلفزيوني وترك لمدة 1 دقيقة.
- نقل مقل العيون إلى آخر 0.5 لتر جرة مع برنامج تلفزيوني عقيمة.
- استخدام ملقط لعقد العين لا يزال على طبق بيتري وجعل قطع بالقرب من القرنية مع شفرة مشرط لا 10A.
- الخطوة الحرجة: عقد حافة قطع واستخدام مقص لاستخراج القرنية ترك حوالي 3 مم من صلب المحيطة القرنية. ضمان نهاية حادة من مقص لا تخترق القزحية أو الأنسجة المشيمية، وهو في الفضاء فوق المشيمية.
- عقد زر corneoscleral مع ملقط واستخدام زوج آخر من ملقط نهاية مدببة لفصل بلطف أنسجة أوفيال.
- رفع زر corneoscleral من الكرة الأرضية المتبقية وشطف لفترة وجيزة في 1.5٪ (الخامس / الخامس) محلول اليود povidone في برنامج تلفزيوني في لوحة 12 جيدا.
- ضع الزر الكورني في لوحة أخرى 12 بئر مليئة PBS العقيمة.
- بعد تجهيز جميع العيون(أوصت الحد الأقصى 40 عيون في دفعة واحدة)،ضع كل زر القرنية إلى طبق بيتري الفردية (34 مم قطر) الجانب الظهارية حتى وتصب في 3 مل من المتوسطة الثقافة قبل warmed إلى 37 درجة مئوية.
ملاحظة: تكوين الوسط الثقافة هو على النحو التالي: متوسط النسر Dulbecco المعدلة (DMEM): لحم الخنزير [1:1] تكملها 5 ميكروغرام •مل-1 الأنسولين و 10 نانوغرام •مل-1 عامل نمو البشرة (EGF)، 10٪ (v/v) مصل عجل الجنين (FCS)، 100 U∙mL-1 البنسلين 100 U∙ مل-1 ستريبتوميسين و 2.5 μg∙ mL-1 أمفوترريسين B. وكخطوة اختيارية، يمكن استكمال الوسيلة بـ 50جرامًا من دكستران -1 ل- لمنع تورم القرنية المُخترة أثناء خطوات الحضانة الإضافية. - احتضان في 37 درجة مئوية في حاضنة استزراع الأنسجة المرطبة.
4. صيانة أزرار الكورنيا
- بعد 24 ساعة، استخدم تقنية معقمة لإزالة الوسائط واستبدالها بـ 3 مل من وسائل الإعلام الطازجة التي تحتوي على المضادات الحيوية قبل تسخينها. الحفاظ على أزرار القرنية في وسائل الإعلام مع المضادات الحيوية لمدة 48 ساعة لتطهير القرنيات. احتضان في 37 درجة مئوية في حاضنة استزراع الأنسجة المرطبة.
- الخطوة الحرجة: بعد 48 ساعة، وإزالة وسائل الإعلام وشطف القرنيات مع 2 مل من برنامج تلفزيوني. ثم الحفاظ على أزرار القرنية في وسائل الإعلام خالية من المضادات الحيوية لمدة لا تقل عن يومين أو مثالي ثلاثة أيام قبل العدوى التجريبية، لإزالة المضادات الحيوية المتبقية من الأنسجة.
- احتضان في 37 درجة مئوية في حاضنة استزراع الأنسجة المرطبة. تغيير الوسائط مرة واحدة على الأقل خلال هذه الأيام الثلاثة. تخلص من القرنيات إذا تطور أي عكر في الوسط الخالي من المضادات الحيوية.
5- إعداد التلقيح
- صب 10 مل من مرق LB في قارورة مخروطية 50 مل مع سدادة رغوة.
- نقل مستعمرة من P. aeruginosa سلالة PAO1 أو سلالة PA14 من لوحة أجار الطازجة واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 3-4 ح حتى البكتيريا في منتصف مرحلة السجل.
- نقل ثقافة البكتيريا إلى أنبوب 50 مل والطرد المركزي في 3000 س ز لمدة 5 دقائق. إزالة فائقة وإعادة تعليق بيليه الخلية في برنامج تلفزيوني.
- كرر الخطوة 5.3 مرتين أكثر لغسل الخلايا. إعادة تعليق بيليه الخلية في برنامج تلفزيوني وضبط الكثافة البصرية في 600 نانومتر إلى حوالي 0.6 باستخدام برنامج تلفزيوني عقيمة كفراغ.
6. إصابة زر corneoscleral
- إزالة وسائل الإعلام من طبق بيتري وشطف القرنيات مرتين مع 1 مل من برنامج تلفزيوني عقيم.
- ضغط بلطف ملقط في حين عقد القرنية في ما بين. استخدام مشرط 10A لجعل أربعة تخفيضات - اثنين عمودي، اثنين أفقيا - في القسم المركزي من زر الكورنيا من خلال طبقة الظهارية إلى ستروما الأساسية.
- وضع قالب زجاجي معقمة في لوحة 6-جيدا مع جزء واسع حتى ووضع القرنية في منتصف القالب الزجاجي، الجانب ظهارة تواجه إلى أسفل. جعل خفض الحق في وسط الجزء السفلي من القالب الزجاجي.
- الخطوة الحرجة: صب 1 مل من 1٪ (ث / الخامس) انخفاض نقطة ذوبان أجار حل في DMEM لملء القالب الزجاجي مع القرنية تماما.
- السماح لأجار لتعيين ثم عكس القالب الزجاجي بحيث ظهارة القرنية تواجه صعودا.
- Pipette 15 ميكرولتر من الثقافة البكتيرية مع600nm OD = 0.6 (لP. aeruginosa وهذا يعادل ما يقرب من 1 × 107 وحدات تشكيل مستعمرة (CFU) في 15 ميكرولتر) مباشرة في منطقة قطع ومن ثم إضافة 85 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني إلى الأعلى للحفاظ على ظهارة القرنية رطبة. تمييع الثقافة البكتيرية المتبقية وطبق على أجار لحساب وحدات تشكيل مستعمرة ل inoculum.
- إضافة 1 مل من DMEM دون المضادات الحيوية إلى الجزء السفلي من كل بئر مع القالب الزجاجي. احتضان لوحة 6-جيدا مع أزرار الكورنيا كلية المصابة في حاضنة مرطب في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 لمدة تصل إلى 24 ساعة.
- إعداد القرنية السيطرة غير المصابة جنبا إلى جنب مع كل تجربة. لإعداد التحكم غير المصاب، استبدل 15 ميكرولتر من الثقافة البكتيرية في الخطوة 6.6 مع برنامج تلفزيوني عقيم.
7. التجانس للقرنية لحصاد البكتيريا
- تجاهل المتوسط DMEM من الجزء السفلي من لوحة 6 جيدا وإضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني عقيم لشطف الجزء السفلي من البئر.
- إزالة برنامج تلفزيوني بلطف عن طريق pipetting دون لمس الجزء المركزي من زر corneoscleral. إزالة حلقة الزجاج باستخدام ملقط العقيمة ووضعها في Distel 5٪ .
- شطف بلطف الجزء العلوي من زر corneoscleral مع 1 مل من برنامج تلفزيوني مرتين [اختياري].
- اضغط على حافة زر corneoscleral مع ملقط تلميح ناعم وفصله عن أجار تحت.
- نقل القرنية إلى أنبوب 50 مل مليئة الجليد الباردة 1-2 مل من برنامج تلفزيوني.
- استخدام التجانس تلميح غرامة لمجرد الجزء العلوي من القرنية المصابة. لا يجب أن يتم االنسيج بشكل كامل. يساعد المُجنّز على فصل البكتيريا عن ظهارة القرنية ومنطقة القطع.
- دوامة القرنية في برنامج تلفزيوني لبضع ثوان لخلط المحتويات.
- إضافة 20 ميكرولتر من التجانس إلى 180 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني وتنفيذ التخفيفات التسلسلية في لوحة 96 جيدا.
- تخفيف التعليق بشكل متسلسل إلى10-4 و 10-5 تخفيف والماصة 10 ميكرولتر من التجانس المخفف مع البكتيريا على صفيحة أجار الدم. احتضان لوحة لمدة 8 ساعات ، وعدد من CFU. عند اختبار تأثير مضادات الميكروبات، يجب التوصل إلى عامل التخفيف المناسب في تجريبيا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تصميم القوالب الزجاجية هي فكرة مبتكرة ومبتكرة، واستخدام التي سمحت لنا لاقامة نموذج بطريقة متسقة مع الحد الأدنى / لا قضايا التلوث. تم إعداد قوالب من قبل منفاخ الزجاج في جامعة شيفيلد على أساس تصميم (الشكل 1A). الإعداد التجريبي يحافظ على شكل محدب للقرنية ويحمل البكتيريا على الجزء العلوي من ظهارة حيث تحدث العدوى (الشكل 1B).
عادة ما تنتفخ القرنيات بورسين بعد أيام قليلة في المتوسط. هذا أمر طبيعي ووجدنا أنه لم يكن هناك فرق كبير بين القرنيات مع وبدون إضافة ديكستران ، والذي عادة ما يضاف لمنع تورم القرنية (الشكل 1H). وعادة ما تجرح القرنيات لمساعدة البكتيريا على اختراق الظهارة. على الرغم من عدم وجود فرق كبير في تقدم العدوى بين الجرحى (قطع) والقرنيات غير (غير المصقول)، لاحظنا المزيد من الاختلافات بين التكرارات في القرنيات غير المصقولة (الشكل 1C). غسل القرنيات مرتين مع برنامج تلفزيوني يزيل البكتيريا الزائدة التي لم تعلق على ظهارة. كان هناك فرق كبير في CFU بين القرنيات porcine غسلها وغير مغسولة المصابة P. aeruginosa PAO1 لمدة 24 ساعة(الشكل 1D). لم يكن هناك فرق كبير في التهم CFU بين القرنيات البورcine والأرانب المصابة PA14 و PAO1 (الشكل 1E, 1F). وكانت النتائج لكلا النموذجين قابلة للتكرار. بعد 24 ساعة، والقرنية المصابة مع أي سلالة Pseudomonas دائما تطوير التعتيم ومنطقة قطع يصبح أكثر وضوحا ومفتوحة بالمقارنة مع القرنية غير المصابة (الشكل 1G).
الشكل 1: القرنية السابق vivo المصابة بـ Pseudomonas aeruginosa. ( أ) صورة تخطيطية لقالب زجاجي يستخدم للحفاظ على شكل القرنية وتسهيل إدخال البكتيريا والعلاجات. سمك القوالب الزجاجية هو 1.5 ملم وهو نفس سمك أنابيب الاختبار المصنوعة من زجاج البورسليكات. (B) صورة تخطيطية من مجموعة التجريبية. (C) اختبار تأثير الجرح على العد CFU النهائي بعد التجانس. غير المصقول (ن = 16) وقطع (ن = 28) أصيب القرنيات مع P. aeruginosa PAO1 وP. aeruginosa PA14 لمدة 24 ساعة. تم غسل القرنيات مع 1 مل من برنامج تلفزيوني قبل التجانس. تشير أشرطة الخطأ إلى الانحراف المعياري. (D) اختبار تأثير غسل القرنيات مع 2 × 1 مل من برنامج تلفزيوني (ن = 6) وليس غسل (ن = 6) على العد CFU النهائي بعد العدوى مع P. aeruginosa PAO1 لمدة 24 ساعة. تشير أشرطة الخطأ إلى الانحراف المعياري. (E) العد النهائي CFU في القرنيات بورسين المصابة P. aeruginosa PAO1 وP. aeruginosa PA14 لمدة 24 ساعة (ن = 10). القرنيات تم غسلها وقطعها. تشير أشرطة الخطأ إلى الانحراف المعياري. (F) العد النهائي CFU في قرنيات الأرانب المصابة P. aeruginosa PAO1 وP. aeruginosa PA14 لمدة 24 ساعة (ن = 6). القرنيات تم غسلها وقطعها. تشير أشرطة الخطأ إلى الانحراف المعياري. (G) صور من القرنيات البيرسيني السابق المصابة P. aeruginosa PAO1 لمدة 24 ساعة. وقد اصيبت السيطرة ولكن لم يتم اضافة اى بكتيريا . وقد جرحت القرنيات المصابة وأضيف 107 CFU إلى الجانب قطع. لم يتم استرداد أي CFU من القرنية التحكم. (ح) تم استرداد 15000000000000000 (1) النهائي CFU بعد 24 ساعة من العدوى مع P. aeruginosa PAO1 من القرنيات تعامل مع dextran (ن = 2) وتلك التي لا دكستران (ن = 9). القرنيات تم غسلها وقطعها. تشير أشرطة الخطأ إلى الانحراف المعياري. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
المحرك الرئيسي وراء تطوير هذا النموذج التهاب القرنية باستخدام القرنية السابقين vivo porcine هو تزويد الباحثين النامية مضادات الميكروبات الجديدة مع نموذج تمثيلي في المختبر لتحديد فعالية مضادات الميكروبات بدقة أكبر في المراحل قبل الظهر. وهذا سيوفر للباحثين المشاركين في تطوير مضادات الميكروبات الجديدة سيطرة أكبر على تصميم الدواء وصياغته في المراحل السابقة السريرية، وزيادة النجاح في التجارب السريرية، والحد من استخدام الحيوانات من خلال تمكين الدراسات المستهدفة، والنتيجة في الترجمة الأسرع لمضادات الميكروبات الجديدة إلى العيادة.
وقد تم بحث عدد من الدراسات تأثير العدوى على القرنيات السابقين vivo من مختلف الحيوانات مثل: أرنب6,7, الماعز8 والخنازير9,10,11. معظم هذه الدراسات تركز على طرق تأسيس6 وتصور العدوى9 ولكن حتى الآن لم يكن هناك سوى عدد قليل من المنشورات التي تركز على اختبار المخدرات ودقيقة كمية من البكتيريا6,7,8,12.
الميزة الأساسية لنموذجنا هي توافر القرنيات البوسيني كجزء من السلسلة الغذائية. ولذلك فإن استخدام القرنيات البور محافز السابقة يتماشى مع مبدأ 3Rs ، وهو استبدال وصقل وتقليل استخدام الحيوانات في الأبحاث ، مع توفير نموذج تمثيلي للواجهة المضيفة. لم نلاحظ أي مشاكل في تلوث الاكراميات القرنية إذا تم اتباع البروتوكول بدقة. القوالب الزجاجية سهلة جدا وسريعة ومباشرة للاستخدام دون أي شرط للمعدات المتخصصة. الحلقة الضيقة في الجزء العلوي يجعل إضافة كمية صغيرة من المخدرات اختبار (100 ميكرولتر) أو البكتيريا مريحة. حلقة من القالب الزجاجي يسمح برنامج تلفزيوني مع البكتيريا أو محلول المخدرات التي يمكن الاحتفاظ بها في الجزء المركزي من القرنية ويمنع البكتيريا من الحصول على تحت القرنية. الحلقة سهلة التنظيف و التعقيم، وتسمح بمراقبة التغيرات التي تحدث في الجزء العلوي من القرنية أثناء الإصابة. يمكن استخدام سلالات البكتيريا الموسومة بالفلورسنت لتصور العدوى أو تحديد انتشار العدوى في الأنسجة باستخدام المجهر الفلوري confocal. يمكن معالجة القرنيات بأكملها لمزيد من المعالجة لتصوير الأنسجة أو المجهر الإلكتروني.
يتم وضع علامة على الخطوات الهامة في البروتوكول. ويجب إيلاء اهتمام إضافي لهذه الخطوات عند تنفيذ البروتوكول لضمان نجاح العدوى. الخطوات الأكثر أهمية في البروتوكول هي ضمان أن يتم علاج القرنيات مع المضادات الحيوية الكافية لمنع العدوى أثناء الإعداد ومن ثم أن يتم القضاء على المضادات الحيوية بشكل كاف قبل إدخال الكائن المعدية، في هذه الحالة P. aeruginosa. عند إعداد التجارب باستخدام هذا البروتوكول ، في بعض الحالات ، تطورت التعكر أثناء الحضانة في الوسط الخالي من المضادات الحيوية. وكان هذا التعكر مؤشرا على نمو الكائنات الدقيقة في الوسط الخالي من المضادات الحيوية. قد يكون هذا بسبب عدم اكتمال علاج القرنية باستخدام المضادات الحيوية أو بسبب التلوث أثناء المناولة. ولم تؤخذ هذه القرنيات إلى الأمام لإجراء المزيد من التجارب وتم التخلص منها. تم تجنب تطوير العكرة عند احتضان القرنيات في وسيط خال من المضادات الحيوية عن طريق توظيف عمليات التعقيم المتكررة في الحاضنة ، وذلك باستخدام نصائح ماصة يمكن التخلص منها مع مرشح وأخذ الرعاية الكافية عند تعقيم الأدوات المستخدمة لاستئصال القرنية من عيون porcine. خطوة أخرى حاسمة عندما يتم وضع القرنيات في القالب الزجاجي قبل الإصابة. القالب الزجاجي يمكّن المرء من الحفاظ على الشكل المحدّب للقرنية. محدبة القرنية هو تحد للاحتفاظ إما الجرعة المعدية أو العامل العلاجي على سطح القرنية. لذلك ، من الضروري ضمان وجود ختم مناسب بين القرنية والعفن الزجاجي. عندما يكون هناك ختم كاف بين القرنية والعفن الزجاجي، وهيكل حلقة فوق القالب يخلق خزان للاحتفاظ إما الجرعة المعدية أو العامل العلاجي. يتم ضمان الختم الكافي عن طريق ملء الجزء الواسع من القالب الزجاجي بالكامل مع DMEM agar حتى الحافة.
كما هو الحال مع أي نموذج، هناك قيود مرتبطة مع نموذج القرنية السابق vivo porcine الموصوفة. النموذج الموصوف هنا لا يحاكي تكوين وتدفق وتجديد الفيلم المسيل للدموع عبر القرنية. كما أن الإجراء الميكانيكي الذي يوفره الوميض لا يتم دمجه في النموذج. هناك اتفاق في الأدب على أن تكوين الفيلم المسيل للدموع وديناميات، وميض هي آليات الدفاع الهامة التي تزيل الجسيمات والكائنات الدقيقة الأجنبية من العين13. في الواقع, النموذج يفتقر أيضا إلى استجابة مناعية التي يتم تشغيلها أثناء العدوى في الجسم الحي. ومن المرجح أن تطور العدوى في الجسم الحي في وجود هذه الآليات الدفاع يختلف عن تلك التي لوحظت في نموذج فيفو السابق وصفها هنا. على الرغم من هذه القيود، نموذج القرنية السابق vivo porcine له صلة لاختبار فعالية مضادات الميكروبات الحالية والناشئة لسببين رئيسيين: 1) علم وظائف الأعضاء من البكتيريا في نموذج vivo السابق يحاكي في الظروف الحية والانتشار البكتيري يعتمد على قدرتها على تلف الأنسجة القرنية، و 2) النموذج يتضمن الأنسجة ثلاثية الأبعاد كحاجز انتشار للعلاجات كثيرا مثل في الوضع في الجسم الحي. ولذلك، فإن نموذج فيفو السابق مفيد على التقنيات التقليدية لاختبار القابلية لقابلية الميكروبات.
ويمكن أيضا أن تستخدم السابقين vivo porcine القرنية نموذج المذكورة هنا لدراسة سلالات مختلفة من البكتيريا والفطريات والخميرة التي تسبب التهاب القرنية. هذا النموذج السابق vivo القرنية هو استنساخ ويسمح للمرء لتوليد يكرر في غضون فترة زمنية قصيرة على عكس في نماذج الجسم الحي. بدلا من برنامج تلفزيوني، الدموع الاصطناعية أو خلايا الدفاع المناعي المضيف يمكن نظريا أن تضاف لمحاكاة السيناريو الحية. يتم الحصول على القرنيات من نفس سلالة الخنازير وحوالي 21-23 أسابيع من العمر عند ذبحها. ولذلك، هناك أقل تقلب بين النسخ المتماثلة مقارنة بتلك التي تم الحصول عليها من الجثث البشرية. وقد اكتسب مفهوم استخدام نموذج القرنية السابقين vivo porcine لتطبيقات الطب الحيوي أكثر شعبية خلال السنوات القليلة الماضية بسبب تشابهها البيولوجي مع العين البشرية مما يجعل هذا النموذج أسهل للمقارنة بين14. هناك اهتمام متزايد في استخدام القرنيات بورسين لزراعة15،16 أو كنموذج لجفاف العين17 أو التئام الجروح18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
الكتاب يود أن أشكر إليوت Abattoir في تشيسترفيلد لتوفير عيون porcine. تم صنع الخواتم الزجاجية بناء على تصميمنا من قبل منفاخ الزجاج دان جاكسون من قسم الكيمياء في جامعة شيفيلد. ويود المؤلفون أن يشكروا مجلس البحوث الطبية (MR/S004688/1) على التمويل. كما يود أصحاب البلاغ أن يشكروا السيدة شانالي ديكويلا على مساعدتها التقنية في إعداد القرنية. الكتاب يود أن أشكر السيد جوناثان إيمري للمساعدة في تنسيق الصور.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL Falcon tube | SLS | 352070 | |
| Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
| Cellstar 12 well plate | Greiner Bio-One | 665180 | |
| Dextran | Sigma | 31425-100mg-F | |
| Distel | Fisher Scientific | 12899357 | |
| DMEM + glutamax | SLS | D0819 | |
| Dual Oven Incubator | SLS | OVe1020 | Sterilising oven |
| Epidermal growth factor | SLS | E5036-200UG | |
| F12 HAM | Sigma | N4888 | |
| Foetal calf serum | Labtech International | CA-115/500 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 15307805 | |
| Handheld homogeniser 220 | Fisher Scientific | 15575809 | Homogeniser |
| Heracell VIOS 160i | Thermo Scientific | 15373212 | Tissue culture incubator |
| Heraeus Megafuge 16R | VWR | 521-2242 | Centrifuge |
| Insulin, recombinant Human | SLS | 91077C-1G | |
| LB agar | Sigma | L2897 | |
| Multitron | Infors | Not appplicable | Bacterial incubator |
| PBS | SLS | P4417 | |
| Penicillin-Streptomycin | SLS | P0781 | |
| Petri dish | Fisher Scientific | 12664785 | |
| Petri dish 35x10mm CytoOne | Starlab | CC7672-3340 | |
| Povidone iodine | Weldricks pharmacy | 2122828 | |
| Safe 2020 | Fisher Scientific | 1284804 | Class II microbiology safety cabinet |
| Scalpel blade number 15 | Fisher Scientific | O305 | |
| Scalpel Swann Morton | Fisher Scientific | 11849002 |
References
- Vazirani, J., Wurity, S., Ali, M. H. Multidrug-Resistant Pseudomonas aeruginosa Keratitis Risk Factors, Clinical Characteristics, and Outcomes. Ophthalmology. 122 (10), 2110-2114 (2015).
- Sharma, S. Keratitis. Bioscience Reports. 21 (4), 419-444 (2001).
- Sharma, G., et al. Pseudomonas aeruginosa biofilm: Potential therapeutic targets. Biologicals. 42 (1), 1-7 (2014).
- Ersoy, S. C., et al. Correcting a Fundamental Flaw in the Paradigm for Antimicrobial Susceptibility Testing. EBioMedicine. 20, 173-181 (2017).
- Kubicek-Sutherland, J. Z., et al. Host-dependent Induction of Transient Antibiotic Resistance: A Prelude to Treatment Failure. EBioMedicine. 2 (9), 1169-1178 (2015).
- Pinnock, A., et al. Ex vivo rabbit and human corneas as models for bacterial and fungal keratitis. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 255 (2), 333-342 (2017).
- Harman, R. M., Bussche, L., Ledbetter, E. C., Van de Walle, G. R. Establishment and Characterization of an Air-Liquid Canine Corneal Organ Culture Model To Study Acute Herpes Keratitis. Journal of Virology. 88 (23), 13669-13677 (2014).
- Madhu, S. N., Jha, K. K., Karthyayani, A. P., Gajjar, D. U. Ex vivo Caprine Model to Study Virulence Factors in Keratitis. Journal of Ophthalmic & Vision Research. 13 (4), 383-391 (2018).
- Vermeltfoort, P. B. J., van Kooten, T. G., Bruinsma, G. M., Hooymans, A. M. M., vander Mei, H. C., Busscher, H. J. Bacterial transmission from contact lenses to porcine corneas: An ex vivo study. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (6), 2042-2046 (2005).
- Duggal, N., et al. Zinc oxide tetrapods inhibit herpes simplex virus infection of cultured corneas. Molecular Vision. 23, 26-38 (2017).
- Brothers, K., et al. Bacterial Impediment of Corneal Cell Migration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (7), (2015).
- Alekseev, O., Tran, A. H., Azizkhan-Clifford, J. Ex vivo Organotypic Corneal Model of Acute Epithelial Herpes Simplex Virus Type I Infection. Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).
- Sack, R. A., Nunes, I., Beaton, A., Morris, C. Host-Defense Mechanism of the Ocular Surfaces. Bioscience Reports. 21 (4), 463-480 (2001).
- Kunzmann, B. C., et al. Establishment of a porcine corneal endothelial organ culture model for research purposes. Cell and Tissue Banking. 19 (3), 269-276 (2018).
- Oh, J. Y., et al. Processing Porcine Cornea for Biomedical Applications. Tissue Engineering Part C-Methods. 15 (4), 635-645 (2009).
- Shi, W. Y., et al. Protectively Decellularized Porcine Cornea versus Human Donor Cornea for Lamellar Transplantation. Advanced Functional Materials. 29, 1902491-1902503 (2019).
- Menduni, F., Davies, L. N., Madrid-Costa, D., Fratini, A., Wolffsohn, J. S. Characterisation of the porcine eyeball as an in-vitro model for dry eye. Contact Lens & Anterior Eye. 41 (1), 13-17 (2018).
- Castro, N., Gillespie, S. R., Bernstein, A. M. Ex vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies. Journal of Visualized Experiments. (144), (2019).
