Summary
Bu makalede, bakteriyel keratitin ex vivo porcine modelini kurmak için adım adım bir protokol açıklanmaktadır. Pseudomonas aeruginosa prototipik bir organizma olarak kullanılır. Bu yenilikçi model in vivo enfeksiyonu taklit eder, çünkü bakteri çoğalması bakterinin kornea dokusuna zarar verme yeteneğine bağlıdır.
Abstract
Yeni antimikrobiyaller geliştirirken, hayvan deneylerinin başarısı in vitro testlerden in vivo hayvan enfeksiyonlarına kadar antimikrobiyal etkinliğin doğru bir şekilde tahmin edilmesine bağlıdır. Mevcut in vitro testler tipik olarak antimikrobiyal etkinliği abartır, çünkü bir difüzyon bariyeri olarak konak dokusunun varlığı hesaba katmaz. Bu darboğazın üstesinden gelmek için, prototipik bir organizma olarak Pseudomonas aeruginosa kullanarak bakteriyel keratitin ex vivo porcine kornea modelini geliştirdik. Bu makalede, porcine korneasının hazırlanması ve enfeksiyonun kurulması için protokol açıklanmaktadır. ısmarlama cam kalıplar, enfeksiyon çalışmaları için korneanın basit kurulumunu sağlar. Bakteriyel çoğalma kornea dokusuna zarar verme yeteneğine bağlı olduğu için model in vivo enfeksiyonu taklit eder. Enfeksiyonun kurulması, uygun plaka sayımları ile değerlendirilen koloni oluşturan birimlerin sayısında bir artış olarak doğrulanır. Sonuçlar, burada açıklanan yöntem kullanılarak ex vivo kornealarda enfeksiyonun oldukça tekrarlanabilir bir şekilde kurulabileceğini göstermektedir. Model gelecekte P. aeruginosadışındaki mikroorganizmaların neden olduğu keratitleri taklit etmek için genişletilebilir. Modelin nihai amacı, in vivo enfeksiyonları daha fazla temsil eden bir senaryoda antimikrobiyal kemoterapinin bakteriyel enfeksiyonun ilerlemesi üzerindeki etkisini araştırmaktır. Bunu yaparken, burada açıklanan model, hayvanların test için kullanımını azaltacak, klinik çalışmalarda başarı oranlarını artıracak ve sonuçta yeni antimikrobiyallerin kliniğe hızlı bir şekilde çevrilmesini sağlayacaktır.
Introduction
Kornea enfeksiyonları körlüğün önemli nedenleridir ve düşük ve orta gelirli ülkelerde salgın oranlarında ortaya çıkar. Hastalığın etiyolojisi bölgeden bölgeye değişmekle birlikte bakteriler bu vakaların büyük bir çoğunluğunu oluşturmektedir. Pseudomonas aeruginosa, hızla ilerleyen bir hastalığa neden olan önemli bir patojendir. Çoğu durumda, hastalar stromal skar, düzensiz astigmatizma ile bırakılır, nakil gerektirir veya en kötü senaryoda, bir göz kaybeder1,2.
P. aeruginosa'nın neden olduğu bakteriyel keratit, özellikle P. aeruginosa'nın antimikrobiyal dirençli suşlarının artan ortaya çıkması nedeniyle tedavisi zor birgöz enfeksiyonudur. Son on yıl içinde, genel olarak kornea enfeksiyonları ve pseudomonas sp.'nin neden olduğu testler ve yeni tedaviler geliştirmek, antibiyotik direncindeki mevcut eğilimle mücadele etmek için gerekli olduğu ortaya çıktı3.
Kornea enfeksiyonları için yeni tedavilerin etkinliğini test etmek için, geleneksel in vitro mikrobiyolojik yöntemler, laboratuvar kültürü sırasında ve in vivo enfeksiyonlar sırasında bakteriyel fizyolojinin farklılığı ve konak arayüzünün olmaması nedeniyle zayıf bir vekildir4,5. Bununla birlikte, in vivo hayvan modelleri pahalıdır, zaman alıcıdır, sadece az sayıda çoğaltma sağlayabilir ve hayvan refahı konusunda endişeleri artırabilir.
Bu yazıda, akut ve kronik enfeksiyonlar için çeşitli tedavileri test etmek için kullanılabilecek basit ve tekrarlanabilir bir organotipik ex vivo porcine keratit modeli göstermektedir. Bu deney için P. aeruginosa'yı kullandık, ancak model diğer bakteriler ve keratite neden olan mantar ve maya gibi organizmalarla da iyi çalışıyor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Albino laboratuvar tavşanları, ev ofisi onaylı protokoller altında planlanan diğer deneysel çalışmalar için laboratuvarda feda edildi. Bu çalışmalarda deneysel kullanım için gözler gerekli değildi, bu yüzden bu protokol için kullanıldılar.
1. Sterilizasyon
- KRİtİk ADIM: Distel'in %5 (v/v) çözeltisinde 1 saat boyunca damıtılarak tüm forsepsleri ve makasları dezenfekte edin, fırçayla temizleyin, musluk suyuyla durulayın ve 185 °C'de bir fırında minimum 2 saat sterilize edin.
- Diğer tüm cam eşyaları ve reaktifleri 121 °C'de 15 dakika otomatik olarak kapatarak sterilize edin veya üreticinin talimatlarına göre reaktifler hazırlayın. Sınıf II mikrobiyoloji güvenlik kabininde aşağıdaki prosedürleri uygulayın.
2. Örnek toplama
- Gözenekli gözlerin toplanması
- Büyük beyaz landrace ekimleri, Hampshire domuzu ile bir haç kullanıldı. Hayvanlar elektrik akımıyla sersemledi ve gözler 2 saat sonra abattoir'de enükle edildi.
- KRİtİk ADIM: Enükle edildikten sonra, gözleri kurumasını önlemek için steril fosfat tamponlu salin (PBS) çözeltisi içinde laboratuvara aktarın ve varışta hemen işleyin.
- Tavşan gözleri koleksiyonu
- Korneaları kesin ve steril PBS ile laboratuvara gönderin.
3. Korneoskleral düğmenin hazırlanması
- Göz küresini çevreleyen dokuyu tutmak ve bir Petri kabına aktarmak için steril tokmaklar kullanın. 15 numaralı neşter bıçağı ve tostips kullanarak bir Petri kabındaki göz küresinin etrafındaki konjonktiva ve kas dokusunu çıkarın.
- Optik siniri asalarla tutarken göz küresini hafifçe kaldırın ve steril PBS ile dolu 0,5 L'lik bir kavanoza aktarın.
- Tüm gözler çevre dokudan temizlendikten sonra, steril forseps kullanarak PBS'de% 3 (v / v) povidon iyot ile dolu başka bir 0.5 L kavanoza taşıyın ve 1 dakika bekletin.
- Gözleri steril PBS'li başka bir 0,5 L kavanoza aktarın.
- Gözü hala bir Petri kabında tutmak ve korneanın yakınında 10A numaralı neşter bıçağıyla bir kesim yapmak için önps kullanın.
- KRİtİk ADIM: Kesmenin kenarını tutun ve korneayı çevreleyen yaklaşık 3 mm sklera bırakarak korneayı çıkarmak için makas kullanın. Makasın keskin ucunun iris veya koroidal dokuyu delmediğinden ve supra-koroidal alanda olduğundan emin olun.
- Korneoskleral düğmeyi tokmaklarla tutun ve uveal dokuyu hafifçe ayırmak için başka bir çift sivri uçlu uzunlayıp kullanın.
- Korneoskleral düğmeyi kalan dünyadan kaldırın ve PBS'deki %1,5 (v/v) povidon iyot çözeltisinde 12 kuyu plakasında kısa bir süre durulayın.
- Korneoskleral düğmeyi steril PBS ile dolu başka bir 12 kuyu plakasına yerleştirin.
- Tüm gözleri işledikten sonra(bir partide önerilen maksimum 40 göz),her korneoskleral düğmeyi tek bir Petri kabına (34 mm çapında) epitel tarafına yerleştirin ve önceden 37 ° C'ye ısıtılmış 3 mL kültür ortamına dökün.
NOT: Kültür ortamının bileşimi aşağıdaki gibidir: Dulbecco'nun modifiye Eagle ortası (DMEM): Ham'ın [1:1] 5 μg⭐mL-1 insülin ve 10 ng⭐mL-1 epidermal büyüme faktörü (EGF), %10 (v/v) foetal baldır serumu (FCS), 100 Uφ•mL-1 penisilin ile desteklenmiştir. 100 Uφ mL-1 streptomisiin ve 2,5 μg•mL-1 amfoterisikin B. İsteğe bağlı bir adım olarak, ortam, daha sonraki kuluçka adımları sırasında eksizyon korneasının şişmesini önlemek için 50 g⭐L-1 dektran ile desteklenebilir. - Nemlendirilmiş doku kültürü inkübatöründe 37 °C'de kuluçkaya yatır.
4. Korneoskleral düğmelerin bakımı
- 24 saat sonra, medyayı çıkarmak ve antibiyotik içeren 3 mL taze önceden ısıtılmış kültür ortamı ile değiştirmek için aseptik teknik kullanın. Korneaları dezenfekte etmek için kornea düğmelerini 48 saat boyunca antibiyotiklerle medyada tutun. Nemlendirilmiş doku kültürü inkübatöründe 37 °C'de kuluçkaya yatır.
- KRİtİk ADIM: 48 saat sonra, ortamı çıkarın ve korneaları 2 mL PBS ile durulayın. Daha sonra korneoskleral düğmeleri, dokudaki artık antibiyotikleri çıkarmak için deneysel enfeksiyondan en az iki veya ideal olarak üç gün önce antibiyotiksiz ortamda tutun.
- Nemlendirilmiş doku kültürü inkübatöründe 37 °C'de kuluçkaya yatır. Bu üç gün içinde medyayı en az bir kez daha değiştirin. Antibiyotik içermeyen ortamda herhangi bir bulanıklık gelişirse korneaları atın.
5. Bir inoculum hazırlanması
- Köpük durduruculu 50 mL konik şişeye 10 mL LB et suyu dökün.
- P. aeruginosa suşu PAO1 kolonisini aktarın veya PA14'ü taze bir agar plakasından süzün ve bakteriler orta kütük fazında olana kadar 37 °C'de 3-4 saat kuluçkaya yatırın.
- Bakteri kültürünü 5 dakika boyunca 3.000 x g'da 50 mL tüp ve santrifüje aktarın. Süpernatant çıkarın ve PBS hücre peletini yeniden askıya alın.
- Hücreleri yıkamak için 5.3 adımını iki kez daha tekrarlayın. PBS'deki hücre peletini yeniden askıya alın ve steril PBS'yi boş olarak kullanarak 600 nm'deki optik yoğunluğu yaklaşık 0,6'ya ayarlayın.
6. Korneoskleral düğmenin enfekte olması
- Ortamı Petri kabından çıkarın ve korneaları 1 mL steril PBS ile iki kez durulayın.
- Korneayı arada tutarken hafifçe sıkın. Korneoskleral düğmenin orta bölümünde, epitel tabakasından alttaki stromaya kadar dört kesim yapmak için 10A neşter kullanın.
- Steril bir cam kalıbı geniş kısmı yukarı bakacak şekilde 6 kuyulu bir tabağa yerleştirin ve korneayı cam kalıbın ortasına, epitel tarafı aşağı bakacak şekilde yerleştirin. Kesmeyi cam kalıbın alt kısmının tam ortasında yapın.
- KRİtİk ADIM: Cam kalıbı tamamen kornea ile doldurmak için DMEM'de çözünmüş % 1 (w/v) düşük erime noktası agarının 1 mL'sini dökün.
- Agarın ayarlamasına izin verin ve ardından cam kalıbı ters çevirin, böylece kornea epitel yukarı bakacak şekilde.
- OD600nm = 0.6 ile bakteri kültürünün pipeti 15 μL (P. aeruginosa için bu, 15 μL'de yaklaşık 1 x10 7 koloni şekillendirme ünitesine (CFU) doğrudan bir kesim alanına eşittir ve daha sonra kornea epitelini nemli tutmak için üste 85 μL PBS ekleyin. İnoculum için koloni oluşturan birimleri saymak için kalan bakteri kültürünü ve plakasını agar üzerinde seyreltin.
- Cam kalıp ile her kuyunun dibine antibiyotiksiz 1 mL DMEM ekleyin. 6 kuyulu plakayı enfekte korneoskleral düğmelerle 37 °C'de nemlendirilmiş bir inkübatörde24 saate kadar% 5 CO 2 ile kuluçkaya yatırın.
- Her deneyin yanında enfekte olmayan kontrol korneası kurun. Enfekte olmayan kontrolü kurmak için, 6.6 adımındaki 15 μL bakteri kültürünü steril PBS ile değiştirin.
7. Bakterileri hasat etmek için korneanın homojenizasyonu
- DMEM ortamını 6 kuyu plakasının altından atın ve kuyunun altını durulamak için 1 mL steril PBS ekleyin.
- Korneoskleral düğmenin orta kısmına dokunmadan pipetleme yaparak PBS'yi yavaşça çıkarın. Cam halkayı steril asalar kullanarak çıkarın ve% 5 Distel'e yerleştirin.
- Korneoskleral düğmenin üst kısmını 1 mL PBS ile iki kez [isteğe bağlı] hafifçe durulayın.
- Korneoskleral düğmenin kenarını ince uçlu asalarla tutun ve altındaki agardan ayırın.
- Korneayı buz gibi soğuk 1-2 mL PBS ile dolu 50 mL'lik bir tüpe aktarın.
- Enfekte korneanın üst kısmını saf hale getirmek için ince bir uç homojenizatörü kullanın. Dokunun tamamen tasfiye edilmesi gerekmez. Homojenizatör bakterileri kornea epitelinden ve kesim bölgesinden ayırmaya yardımcı olur.
- İçeriği karıştırmak için korneayı PBS'de birkaç saniye boyunca girdaplayın.
- 180 μL PBS'ye 20 μL homojen ekleyin ve 96 kuyu plakasında seri seyreltmeler gerçekleştirin.
- Süspansiyonu seri olarak 10-4 ve 10-5 seyreltme ve pipet 10 μL seyreltilmiş homojenatı bakterilerle bir kan agar plakasına seyreltin. Plakayı 8 saat kuluçkaya yatırın ve CFU sayısını sayın. Antimikrobiyallerin etkisini test ederken, uygun seyreltme faktörü deneysel olarak gelmelidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Cam kalıpların tasarımı, kullanımı modeli kontaminasyonla ilgili minimum / hiç sorun olmadan tutarlı bir şekilde kurmamızı sağlayan yenilikçi ve orijinal bir fikirdir. Kalıplar Sheffield Üniversitesi'nde bir cam üfleyici tarafından bir tasarıma dayanarak hazırlanmıştır (Şekil 1A). Deneysel kurulum korneanın dışbükey şeklini korur ve enfeksiyonun gerçekleştiği epitelin üstünde bakteri tutar (Şekil 1B).
Porcine korneaları genellikle orta birkaç gün sonra şişer. Bu normaldir ve korneanın şişmesini önlemek için genellikle eklenen dektran ile ve eklenmeden kornealar arasında önemli bir fark olmadığını gördük (Şekil 1H). Kornealar tipik olarak bakterilerin epitellere nüfuz etmesine yardımcı olmak için yaralanır. Yaralı (kesik) ve çözülmemiş (kesilmemiş) kornealar arasındaki enfeksiyonun ilerlemesinde önemli bir fark olmamasına rağmen, kesilmemiş kornealardaki çoğalımlar arasında daha fazla varyasyon fark ettik (Şekil 1C). Korneaları PBS ile iki kez yıkamak epitellere bağlanmayan fazla bakterileri temizler. 24 saat boyunca P. aeruginosa PAO1 ile enfekte olmuş yıkanmış ve yıkanmamış porcine korneaları arasında CFU'da önemli bir fark vardı(Şekil 1D). PA14 ve PAO1 ile enfekte olan porcine ve tavşan korneaları arasında CFU sayılarında anlamlı bir fark yoktu(Şekil 1E,1F). Her iki model için de sonuçlar tekrarlanabilirdi. 24 saat sonra, Pseudomonas suşu ile enfekte olan kornea her zaman opaklık geliştirir ve kesilen alan enfekte olmayan korneaya kıyasla daha görünür ve açık hale gelir (Şekil 1G).
Şekil 1: Pseudomonas aeruginosaile enfekte ex vivo kornea . (A) Korneanın şeklini korumak ve bakteri ve tedavilerin girişini kolaylaştırmak için kullanılan bir cam kalıbın şematik resmi. Cam kalıpların kalınlığı 1,5 mm'dir ve borosilikat camdan yapılan test tüplerinin kalınlığı ile aynıdır. (B) Deneysel kurulumun şematik resmi. (C) Homojenizasyondan sonra yaranın son CFU sayısı üzerindeki etkisinin test edilmesi. Kesilmemiş (n = 16) ve kesilmiş (n = 28) kornealara 24 saat boyunca P. aeruginosa PAO1 ve P. aeruginosa PA14 bulaştı. Kornealar homojenizasyondan önce 1 mL PBS ile yıkandı. Hata çubukları standart sapmayı gösterir. (D)Korneaların 2 x 1 mL PBS (n = 6) ile yıkanması ve yıkanmaması (n = 6) P. aeruginosa PAO1 enfeksiyonundan sonraki son CFU sayısı üzerindeki etkisinin 24 saat boyunca test edilmektedir. Hata çubukları standart sapmayı gösterir. (E) P. aeruginosa PAO1 ve P. aeruginosa PA14 ile enfekte olan porcine kornealarında 24 saat boyunca son CFU sayısı (n = 10). Kornealar yıkandı ve kesildi. Hata çubukları standart sapmayı gösterir. (F) P. aeruginosa PAO1 ve P. aeruginosa PA14 ile enfekte tavşan kornealarında 24 saat boyunca son CFU sayısı (n = 6). Kornealar yıkandı ve kesildi. Hata çubukları standart sapmayı gösterir. (G) 24 saat boyunca P. aeruginosa PAO1 ile enfekte olan ex vivo porcine kornealarının resimleri. Kontrol yaralıydı ama bakteri eklenmedi. Enfekte kornealar yaralandı ve kesilen tarafa 107 CFU eklendi. Kontrol korneasından CFU bulunamadı. (H) Son CFU, dektran (n = 2) ile tedavi edilen kornealardan P. aeruginosa PAO1 ve dektransızlardan (n = 9) 24 saat süren enfeksiyondan sonra iyileşti. Kornealar yıkandı ve kesildi. Hata çubukları standart sapmayı gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ex vivo porcine kornea kullanılarak bu keratit modelinin geliştirilmesinin arkasındaki ana sürücü, preklinik aşamalarda antimikrobiyal etkinliği daha doğru bir şekilde belirlemek için yeni antimikrobiyaller geliştiren araştırmacılara temsili bir in vitro model sağlamaktır. Bu, yeni antimikrobiyallerin klinik öncesi aşamalarda ilaç tasarımı ve formülasyonu üzerinde daha fazla kontrol geliştirmesine, klinik çalışmalarda başarıyı artırmasına, hedeflenen çalışmalara olanak sağlayarak hayvanların kullanımını azaltmasına ve yeni antimikrobiyallerin kliniğe daha hızlı çevrilmesine neden olacaktır.
Bir dizi çalışma, enfeksiyonların aşağıdaki gibi çeşitli hayvanlardan ex vivo kornealar üzerindeki etkisini araştırmıştır: tavşan6, köpek7, keçi8 ve domuzlar9,10,11. Bu çalışmaların çoğu6 kurmanın ve bir enfeksiyonu görselleştirmenin yollarına odaklanmaktadır9, ancak şimdiye kadar ilaç testine ve bakterilerin doğru nicelemesine odaklanan sadece birkaç yayın olmuştur 6,7,8,12.
Modelimizin birincil avantajı, besin zincirinin bir parçası olarak porcine kornealarının mevcudiyetidir. Bu nedenle ex vivo porcine kornealarının kullanımı, konak arayüzünün temsili bir modelini sağlarken, araştırmada hayvanların kullanımını değiştirmek, iyileştirmek ve azaltmak olan 3R prensibi ile uyumludur. Protokole harfiyen uyulduğı takdirde kornea eksplantlarının kirlenmesiyle ilgili herhangi bir sorun gözlemlemedik. Cam kalıplar, özel ekipmanlar için herhangi bir gereksinim olmadan kullanımı çok kolay, hızlı ve kolaydır. Üstteki dar halka, az miktarda test edilmiş bir ilacın (100 μL) veya bakterinin eklenmesini kolaylaştırır. Cam kalıbın halkası, bakteri içeren PBS'nin veya bir ilaç çözeltisinin korneanın orta kısmında tutulmasını sağlar ve bakterilerin korneanın altına girmesini önler. Halkanın temizlenmesi ve sterilize etmesi kolaydır ve enfeksiyon sırasında korneanın üstünde meydana gelen değişikliklerin gözlemlenmesine izin verir. Floresan etiketli bakteri suşları, floresan konfokal mikroskopi kullanarak enfeksiyonu görselleştirmek veya dokudaki enfeksiyonun yayılmasını ölçmek için kullanılabilir. Tüm kornealar histoloji veya elektron mikroskopisi görüntüleme için daha fazla işlenebilir.
Kritik adımlar protokolde işaretlenir. Başarılı bir enfeksiyon sağlamak için protokolü gerçekleştirirken bu adımlara ekstra dikkat edilmelidir. Protokoldeki en kritik adımlar, korneaların hazırlık sırasında enfeksiyonu önlemek için yeterli antibiyotikle tedavi edilmesini ve daha sonra enfektif organizmanın piyasaya sürülmesinden önce antibiyotiklerin yeterince ortadan kaldırılmasını sağlamaktır, bu durumda P. aeruginosa. Bu protokolü kullanarak deneyleri kurarken, bazı durumlarda, antibiyotik içermeyen ortamda inkübasyon sırasında bulanıklık gelişti. Bu bulanıklık, antibiyotik içermeyen ortamdaki mikroorganizmaların büyümesinin göstergesiydi. Bunun nedeni, antibiyotikler kullanılarak korneanın eksik tedavisi veya elleçleme sırasındaki kontaminasyon olabilir. Bu kornealar daha fazla deney için ileri götürülmedi ve atıldı. Korneaları antibiyotiksiz ortamda kuluçkaya yatırırken bulanıklık gelişimi, inkübatörde sık sterilizasyon çalışmaları kullanılarak, filtreli tek kullanımlık pipet uçları kullanılarak ve korneanın porcine gözlerinden çıkarılmasında kullanılan aletleri sterilize ederken yeterli özen göstererek önlenmiştir. Bir diğer kritik adım, korneaların enfeksiyondan önce cam kalıba yerleştirilmesidir. Cam kalıp, korneanın dışbükey şeklini korumasını sağlar. Korneanın dışbükeyliği, kornea yüzeyindeki enfektif dozun veya terapötik maddenin tutulması için bir zorluktur. Bu nedenle, kornea ve cam kalıp arasında yeterli contanın bulunmasını sağlamak önemlidir. Kornea ve cam kalıp arasında yeterli conta olduğunda, kalıbın üzerindeki halka yapısı, enfektif dozu veya terapötik maddeyi korumak için bir rezervuar oluşturur. Cam kalıbın geniş bölümünü ağzına kadar DMEM agar ile tamamen doldurarak yeterli bir sızdırmazlık sağlanır.
Herhangi bir modelde olduğu gibi, açıklanan ex vivo porcine kornea modeli ile ilişkili sınırlamalar vardır. Burada açıklanan model, kornea boyunca gözyaşı filminin bileşimini, akışını ve ikmalini taklit etmez. Yanıp sönme ile sağlanan mekanik etki de modele dahil değildir. Literatürde film kompozisyonunu ve dinamiklerini yırttığı ve yanıp sönmenin yabancı parçacıkları ve mikroorganizmaları gözlerden uzaklaştıran önemli savunma mekanizmaları olduğu konusunda anlaşmavardır 13. Gerçekten de, model ayrıca enfeksiyon in vivo sırasında tetiklenen bir bağışıklık yanıtına sahip değildir. Bu savunma mekanizmalarının varlığında enfeksiyon in vivo ilerlemesinin, burada açıklanan ex vivo modelinde gözlemlenenden farklı olması muhtemeldir. Bu sınırlamalara rağmen, ex vivo porcine kornea modeli mevcut ve gelişmekte olan antimikrobiyallerin etkinliğini iki ana nedenden dolayı test etmek için geçerlidir: 1) ex vivo modeldeki bakterilerin fizyolojisi, bakteri çoğalması kornea dokusuna zarar verme yeteneklerine bağlı olduğu için in vivo koşulları taklit eder, ve 2) model, üç boyutlu dokuyu in vivo durumda olduğu gibi terapötikler için bir difüzyon bariyeri olarak içerir. Bu nedenle, ex vivo modeli antimikrobiyal duyarlılık testi için geleneksel tekniklere göre avantajlıdır.
Burada açıklanan ex vivo porcine kornea modeli, keratite neden olan farklı bakteri, mantar ve maya türlerini incelemek için de kullanılabilir. Bu ex vivo kornea modeli tekrarlanabilir ve in vivo modellerden farklı olarak kısa bir süre içinde çoğaltmalar üretmesine izin verir. PBS yerine, canlı senaryoyu taklit etmek için teorik olarak yapay yırtıklar veya konak bağışıklık savunma hücreleri eklenebilir. Kornealar aynı domuz ırkından ve kesildiğinde yaklaşık 21-23 haftalıktan elde edilir. Bu nedenle, insan kadavralarından elde edilenlere kıyasla çoğaltmalar arasında daha az değişkenlik vardır. Biyomedikal uygulamalar için porcine ex vivo kornea modeli kullanma kavramı, bu modelin karşılaştırılmasını kolaylaştıran insan gözüne biyolojik benzerliği nedeniyle son birkaç yıl içinde daha fazla popülerlik kazanmıştır14. Porcine kornealarının transplantasyoniçin 15 , 16veya kuru göz17 veya yara iyileşmesi için bir model olarak kullanılmasına olan ilgi artmaktadır18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Yazarlar Chesterfield'daki Elliot Abattoir'e gözenekli gözler sağladığı için teşekkür etmek istiyor. Cam halkalar, Sheffield Üniversitesi Kimya Bölümü'nden cam üfleyici Dan Jackson tarafından tasarımımıza dayanarak yapıldı. Yazarlar, tıbbi araştırma konseyine (MR/S004688/1) finansman için teşekkür eder. Yazarlar ayrıca Kornea hazırlamada teknik yardım için Bayan Shanali Dikwella'ya teşekkür etmek istiyor. Yazarlar, resimleri biçimlendirme konusunda yardımcı olduğu için Bay Jonathan Emery'ye teşekkür etmek istiyor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL Falcon tube | SLS | 352070 | |
| Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
| Cellstar 12 well plate | Greiner Bio-One | 665180 | |
| Dextran | Sigma | 31425-100mg-F | |
| Distel | Fisher Scientific | 12899357 | |
| DMEM + glutamax | SLS | D0819 | |
| Dual Oven Incubator | SLS | OVe1020 | Sterilising oven |
| Epidermal growth factor | SLS | E5036-200UG | |
| F12 HAM | Sigma | N4888 | |
| Foetal calf serum | Labtech International | CA-115/500 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 15307805 | |
| Handheld homogeniser 220 | Fisher Scientific | 15575809 | Homogeniser |
| Heracell VIOS 160i | Thermo Scientific | 15373212 | Tissue culture incubator |
| Heraeus Megafuge 16R | VWR | 521-2242 | Centrifuge |
| Insulin, recombinant Human | SLS | 91077C-1G | |
| LB agar | Sigma | L2897 | |
| Multitron | Infors | Not appplicable | Bacterial incubator |
| PBS | SLS | P4417 | |
| Penicillin-Streptomycin | SLS | P0781 | |
| Petri dish | Fisher Scientific | 12664785 | |
| Petri dish 35x10mm CytoOne | Starlab | CC7672-3340 | |
| Povidone iodine | Weldricks pharmacy | 2122828 | |
| Safe 2020 | Fisher Scientific | 1284804 | Class II microbiology safety cabinet |
| Scalpel blade number 15 | Fisher Scientific | O305 | |
| Scalpel Swann Morton | Fisher Scientific | 11849002 |
References
- Vazirani, J., Wurity, S., Ali, M. H. Multidrug-Resistant Pseudomonas aeruginosa Keratitis Risk Factors, Clinical Characteristics, and Outcomes. Ophthalmology. 122 (10), 2110-2114 (2015).
- Sharma, S. Keratitis. Bioscience Reports. 21 (4), 419-444 (2001).
- Sharma, G., et al. Pseudomonas aeruginosa biofilm: Potential therapeutic targets. Biologicals. 42 (1), 1-7 (2014).
- Ersoy, S. C., et al. Correcting a Fundamental Flaw in the Paradigm for Antimicrobial Susceptibility Testing. EBioMedicine. 20, 173-181 (2017).
- Kubicek-Sutherland, J. Z., et al. Host-dependent Induction of Transient Antibiotic Resistance: A Prelude to Treatment Failure. EBioMedicine. 2 (9), 1169-1178 (2015).
- Pinnock, A., et al. Ex vivo rabbit and human corneas as models for bacterial and fungal keratitis. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 255 (2), 333-342 (2017).
- Harman, R. M., Bussche, L., Ledbetter, E. C., Van de Walle, G. R. Establishment and Characterization of an Air-Liquid Canine Corneal Organ Culture Model To Study Acute Herpes Keratitis. Journal of Virology. 88 (23), 13669-13677 (2014).
- Madhu, S. N., Jha, K. K., Karthyayani, A. P., Gajjar, D. U. Ex vivo Caprine Model to Study Virulence Factors in Keratitis. Journal of Ophthalmic & Vision Research. 13 (4), 383-391 (2018).
- Vermeltfoort, P. B. J., van Kooten, T. G., Bruinsma, G. M., Hooymans, A. M. M., vander Mei, H. C., Busscher, H. J. Bacterial transmission from contact lenses to porcine corneas: An ex vivo study. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (6), 2042-2046 (2005).
- Duggal, N., et al. Zinc oxide tetrapods inhibit herpes simplex virus infection of cultured corneas. Molecular Vision. 23, 26-38 (2017).
- Brothers, K., et al. Bacterial Impediment of Corneal Cell Migration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (7), (2015).
- Alekseev, O., Tran, A. H., Azizkhan-Clifford, J. Ex vivo Organotypic Corneal Model of Acute Epithelial Herpes Simplex Virus Type I Infection. Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).
- Sack, R. A., Nunes, I., Beaton, A., Morris, C. Host-Defense Mechanism of the Ocular Surfaces. Bioscience Reports. 21 (4), 463-480 (2001).
- Kunzmann, B. C., et al. Establishment of a porcine corneal endothelial organ culture model for research purposes. Cell and Tissue Banking. 19 (3), 269-276 (2018).
- Oh, J. Y., et al. Processing Porcine Cornea for Biomedical Applications. Tissue Engineering Part C-Methods. 15 (4), 635-645 (2009).
- Shi, W. Y., et al. Protectively Decellularized Porcine Cornea versus Human Donor Cornea for Lamellar Transplantation. Advanced Functional Materials. 29, 1902491-1902503 (2019).
- Menduni, F., Davies, L. N., Madrid-Costa, D., Fratini, A., Wolffsohn, J. S. Characterisation of the porcine eyeball as an in-vitro model for dry eye. Contact Lens & Anterior Eye. 41 (1), 13-17 (2018).
- Castro, N., Gillespie, S. R., Bernstein, A. M. Ex vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies. Journal of Visualized Experiments. (144), (2019).
