Summary
يصف هذا البروتوكول الكشف عن هجرة الخلايا الجذعية المحيطة بالهيكل العظمي المحيطي بوساطة CCL5 في الوقت الفعلي باستخدام المجهر الحيواني الحي داخل الحتمية.
Abstract
الخلايا الجذعية الهيكلية البيريوستية (P-SSCs) ضرورية لصيانة العظام وإصلاحها مدى الحياة، مما يجعلها محورا مثاليا لتطوير العلاجات لتعزيز شفاء الكسور. الخلايا البيريوستية تهاجر بسرعة إلى إصابة لتوريد chondrocytes جديدة والعظام للشفاء كسر. تقليديا، فعالية السيتوكين للحث على هجرة الخلايا قد أجريت فقط في المختبر عن طريق إجراء فحص ترانسويل أو الصفر. مع التقدم في المجهر داخلفيتال باستخدام الإثارة متعددة الفوتون، تم اكتشاف مؤخرا أن 1) P-SSCs التعبير عن الجين المهاجر CCR5 و 2) العلاج مع ccR5 ligand المعروفة باسم CCL5 يحسن شفاء الكسور وهجرة أجهزة الكمبيوتر الخاصة استجابة لCCL5. وقد تم التقاط هذه النتائج في الوقت الحقيقي. وصف هنا هو بروتوكول لتصور P-SSC الهجرة من الخلايا الجذعية الهيكل العظمي خياطة الجلجلة (SSC) المتخصصة نحو إصابة بعد العلاج مع CCL5. البروتوكول تفاصيل بناء ضبط النفس الماوس وتركيب التصوير، وإعداد الجراحية من كالفاريا الماوس، تحريض عيب calvaria، والحصول على التصوير الفاصل الزمني.
Introduction
إصلاح الكسور هو دينامية، عملية متعددة الخلايا التي تختلف عن نمو الهيكل العظمي الجنيني وإعادة عرض. خلال هذه العملية ، يتبع تحريض إشارات الإصابة من الأنسجة التالفة التوظيف السريع ، والانتشار ، والتمايز اللاحق للخلايا الجذعية / السلف الهيكلية ، والتي تعتبر كلها حاسمة للاستقرار العام لتثبيت الكسور1. على وجه الخصوص، المراحل المبكرة من شفاء الكسور تتطلب تشكيل كالوس لينة، والتي تعزى أساسا إلى الخلايا المقيمة في الخلايا الفرجية2. عندما تصاب العظام، تستجيب مجموعة فرعية من الخلايا المحيطة بالخلايا المحيطة بالخلايا بسرعة وتساهم في وسيطات الغضاريف وخلايا العظام المتباينة حديثا داخل callus3، مما يعني وجود مجموعة خلايا جذعية/ذرية متميزة داخل المحيط. لذلك، فإن تحديد وتوصيف وظيفي للخلايا الجذعية الهيكل العظمي المقيمين في المحيط (SSCs) تشكل نهجا علاجيا واعدا لأمراض العظام التنكسية وعيوب العظام4.
ويعتقد أن SSCs يقيمون في مواقع متعددة من الأنسجة، بما في ذلك نخاع العظام. وعلى غرار نخاع العظم، تم أيضا تحديد مركبات الكربون الهيدروفلورية/التشوندروجينية في الحضيض 4،5،6. يمكن تسمية هذه SSCs periosteal (P-SSCs) بعلامات النسب المتوسطة المبكرة (أي Prx1-Cre5 و Ctsk-Cre7 و Axin2-CreER8) أثناء نمو عظم الجنين 4،7،8،9،10. وهناك قيد كبير على هذه النماذج تتبع النسب الوراثي واحد هو أن هناك تغاير كبير داخل مجموعات الخلايا المسمى. وعلاوة على ذلك، فإنها لا تستطيع التمييز بين الشركات الخاصة السمية وذرتها في الجسم الحي. لمعالجة هذا القيد، قمنا مؤخرا بتطوير ماوس مراسل مزدوج (Mx1-Cre+Rosa26-Tomato+α SMA-GFP+) لتصور P-SSCs بوضوح من نخاع العظم SSCs (BM-SSCs)11. مع هذا النموذج، فقد تقرر أن P-SSCs تتميز Mx1 + αSMA + الوسم المزدوج، في حين أن أكثر تمايزا Mx1 + الخلايا الموجودة في نخاع العظام، والأسطح الداخلية والبريوستية، والعظام القشرية والترابية11،12.
ومن المعروف أن السيتوكينات المتعددة وعوامل النمو لتنظيم إعادة عرض العظام وإصلاحها، وقد تم اختبارها لتعزيز إصلاح الهيكل العظمي في عيوب الجزء الحرج1,13. ومع ذلك ، بسبب التعقيد الخلوي لنماذج الإصابات الناتجة عن تعطيل الحاجز المادي لمقصورة العظام ، فإن الآثار المباشرة لهذه الجزيئات على هجرة P-SSC الذاتية والتنشيط أثناء الشفاء غير واضحة. غالبا ما يتم تقييم الخصائص الوظيفية وديناميكيات الهجرة في مراكز دعم البرامج في المختبر من خلال إجراء فحص عبر أو خدش ، بالإضافة إلى السيتوكينات أو عوامل النمو المعروفة بالحث على الهجرة في مجموعات الخلايا الأخرى. وبالتالي، فإن تفسير نتائج هذه التجارب المختبرية لتطبيقها في نظمها الحية المقابلة له أمر صعب. وفي الوقت الراهن، لا يلاحظ عادة في الوقت الحقيقي في التقييم الحي لهجرة الخلايا الجذعية/السلف الهيكلية؛ بدلا من ذلك، يتم قياسه في النقاط الزمنية الثابتة بعد الكسر5،7،14،15،16.
والقيود المفروضة على هذه الطريقة هي أن الهجرة لا تقيم على مستوى خلية واحدة؛ بل إن الهجرة لا يمكن أن تكون كذلك. بدلا من ذلك، يتم قياسه عن طريق التغيرات في مجموعات الخلايا. بسبب التقدم الأخير في المجهر الحيواني الحي داخل الجسم وتوليد فئران مراسل إضافية ، أصبح تتبع الخلايا الفردية في الجسم الحي ممكنا الآن. باستخدام المجهر الحيواني الحي داخل الفيتية ، لاحظنا الهجرة المتميزة ل P-SSCs من مكان خياطة الجلفاريا إلى إصابة العظام في غضون 24-48 ساعة بعد الإصابة في فئران Mx1/Tomato/αSMA-GFP.
وقد تم مؤخرا تحديد CCL5/CCR5 كآلية تنظيمية تؤثر على التوظيف والتنشيط P-SSCs خلال الاستجابة المبكرة للإصابات. ومن المثير للاهتمام أنه لم يتم الكشف عن هجرة كبيرة من جانب لجنة الطوارئ الخاصة استجابة لإصابة في الوقت الحقيقي. ومع ذلك ، فإن علاج الإصابة مع CCL5 ينتج هجرة قوية ومتميزة اتجاهيا ل P-SSCs ، والتي يمكن التقاطها في الوقت الفعلي. ولذلك، فإن الهدف من هذا البروتوكول هو توفير منهجية مفصلة لتسجيل الهجرة في الجسم الحي من P-SSCs في الوقت الحقيقي بعد العلاج مع CCL5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم الحفاظ على جميع الفئران في ظروف خالية من مسببات الأمراض ، وتمت الموافقة على جميع الإجراءات من قبل لجنة الرعاية والاستخدام المؤسسية للحيوانات في كلية بايلور للطب (IACUC).
1. إعداد الماوس
- عبر Mx1-Cre17 وRosa26-loxP-stop-loxP-tdTomato (توم)18 الفئران (التي تم شراؤها من مختبر جاكسون) مع الفئران αSMA-GFP (المقدمة هنا من قبل Drs. إيفو Kalajzic وهنري كروننبرغ) لتوليد Mx1 - كري + Rosa26 - الطماطم + α SMA - GFP + (Mx1 / الطماطم / αSMA - GFP) مراسل الفئران (الشكل 2A).
- بالنسبة لتحريض Mx1-Cre ، قم بحقن الفئران ب 25 ملغم / كجم pIpC كل يومين لمدة 10 أيام.
- تشعيع الفئران مع 9.5 غي 1 قبل يوم من زرع الوريد من 1 × 106 خلايا نقي العظم كله أحادية نووية من الفئران البرية C57BL/6 (WT-BMT)19.
- بعد 6 إلى 8 أسابيع من التعافي ، تخضع الفئران للتصوير في الجسم الحي لبروتوكول هجرة الخلايا المحيطة بالخلايا الموصوفة أدناه.
ملاحظة: الإشعاع وWT-BMT من الفئران Mx1-Cre ضرورية للقضاء على خلايا الدم الذاتية Mx1 المسمى التي قد تستجيب لإصابة. بعد ستة إلى ثمانية أسابيع من التشعيع ، يبلغ عدد خلايا الورم الدموي للمضيف <5٪ وبالتالي فهو جاهز للتصوير19.
2. ضبط النفس الماوس وتركيب التصوير
- إنشاء ضبط النفس الماوس مع أنبوب مخروطي 50 مل (الشكل 1A).
- باستخدام مقص مدببة، كزة حفرة من خلال الجزء السفلي من مخروطية. قطع من الحفرة السفلية إلى أعلى مخروطية (الجانب قطع سيكون الجزء العلوي من ضبط النفس).
- جعل قطع ما يقرب من 4-5 سم موازية طويلة لقطع السابقة وفي منتصف الطريق إلى أسفل (~ 2 سم) من أعلى ضبط النفس. إزالة هذا القسم من مخروطية وسلسة حواف كانت ضرورية.
- بناء أنبوب مخروطي جبل التصوير باستخدام لوحة زاوية قابل للتعديل، وظيفة بصرية 0.5 بوصة، والمشبك الزاوية اليمنى ل0.5 "آخر، 0.1875" هيكس (الشكل 1B وجدول المواد).
- ضبط لوحة الزاوية إلى زاوية 35 درجة. على الجانب الأيسر من لوحة الزاوية، المسمار آخر البصرية في الحفرة الثانية من الجزء الخلفي من لوحة.
- على الجانب الأيمن من لوحة قابل للتعديل، إدراج الربيع محملة 0.1875 "هيكس قفل 0.25"الإبهام في الحفرة الثانية من الجبهة والثقوب الأخيرة على لوحة. سيتم استخدام المشبك الزاوية اليمنى مع آخر البصرية لتأمين ضبط النفس الماوس مخروطية في مكان.
3. إجراء العمليات الجراحية قبل الجراحة
- تخدير الفأر
- لإدارة الألم، حقن الماوس تحت الجلد مع البوبرينورفين الإفراج المستمر (1 ملغم / كغ BW) 30-60 دقيقة قبل الجراحة.
- تخدير الفئران باستخدام القوارض الثالث CCM الجمع (التحرير والسرد الثالث) التخدير التي تحتوي على 37.5 ملغ / مل الكيتامين, 1.9 ملغ / مل xylazine, و 0.37 ملغ / مل acepromazine. الجرعة المناسبة للفئران هي 0.75-1.50 مل لكل 1 كجم من وزن الجسم. الجرعة سوف تستمر 30-45 دقيقة.
- بمجرد تخدير الفأرة، ضعي مرهم العيون على العينين بمسحة قطنية معقمة لمنع جفاف العين.
- للتصوير على المدى الطويل (>45 دقيقة)، إدارة التخدير مرة أخرى للحفاظ على عمق مخدر السليم على النحو التالي.
- إعداد حقنة 1 مل مع كمية كافية من التحرير والسرد الثالث للحفاظ على التخدير لمدة التصوير المخطط لها (0.75 مل / كجم BW لكل 30 دقيقة من التخدير الإضافي). إرفاق ضخ إبرة فراشة 25 غرام مجموعة مع 12 "أنابيب إلى الحقنة ودفع مخدر من خلال الأنابيب والإبرة.
- أدخل إبرة الفراشة intraperitoneally، ثم الشريط الإبرة في مكان.
ملاحظة: هذه هي الطريقة التي سيتم بها إدارة التحرير والسرد الثالث الإضافي أثناء التصوير بحيث لا تكون هناك حاجة لنقل الحيوان أو تعطيل مستوى الرؤية.
- توفير الدعم الحراري مع وسادة التدفئة أبقى في 37 درجة مئوية طوال العملية. للتصوير المطول (>1ساعة) سيكون من الضروري دعم السوائل الإضافية. يمكن تزويد I.P. سوائل تكميلية مع كومبو III إضافية أثناء التصوير أو 33 مل/ كغ المالحة (0.9 NaCl) تحت الجلد.
- ضبط النفس الماوس وإعداد موقع الجراحة
- استخدام المقصات لإزالة الشعر قدر الإمكان من أعلى الرأس. ضعي كريم إزالة الشعر على منطقة الحلاقة لإزالة أي شعر متبقي في موقع الجراحة.
- تأكد من تخدير الماوس بالكامل بسبب عدم الاستجابة لقرصات إصبع القدم. بعد 15 دقيقة، إذا لم يتم تخدير الماوس بالكامل، يمكنك إعطاء جرعة ثانية أصغر من السرد III (<0.75 مل/كجم BW).
- ضع الماوس في ذيل ضبط النفس أولا ، وانزلاقه بعيدا بما فيه الكفاية إلى الوراء بحيث يتدلى الأنف قليلا على حافة المخروطية.
- الشريط الكفوف الأمامية إلى الجزء السفلي من أنبوب مخروطي باستخدام الشريط الطبي.
- ضع أنبوبا مخروطيا مع الماوس على حامل تصوير يتم ضبطه بزاوية 35 درجة وآمن باستخدام المشبك الزاوية اليمنى (الشكل 1C).
- مرة واحدة في الماوس هو آمن في جبل التصوير، وتنظيف موقع الجراحية 3X مع الدعك بالتناوب من فرك بيتادين والكحول isopropyl 70٪. مرة أخرى ، تأكد من أن الحيوان مخدر بالكامل.
- تحريك الماوس إلى لوحة ماصة نظيفة ووضع الستائر فوق الماوس لإنشاء حقل معقم كبير.
4. إجراء العمليات الجراحية
- فتح شق
- باستخدام ملقط ذو رؤوس ناعمة، التقط الجلد على الفور إلى الأذن اليمنى. مع مقص microdissection، وقطع الجلد الذي عقد من قبل ملقط.
ملاحظة: بدء الشق باستخدام الطريقة المذكورة أعلاه يخلق شق مستديرة التي هي أكثر ملاءمة لخياطة بعد الإجراء. - إجراء شق عرضي بدءا من الشق الأولي نحو الأذن اليسرى (<1 سم). إجراء شق آخر، بدءا من الشق الأولي، نحو أنف الحيوان (~ 2-3 ملم الماضي العين اليمنى).
- فصل الجلد من periosteum باستخدام ملقط ومقص لقطع بلطف من خلال النسيج الضام فصل الجلد من periosteum calvaria.
- باستخدام مسحة قطنية معقمة، ضعي بعض مرهم العيون على الجزء العلوي من رفرف الجلد. التقط رفرف الجلد برفق وأطوه على العين اليسرى. يجب أن يكون تقاطع الغرز القوسية والإكليلية مكشوفا بوضوح (الشكل 1E).
ملاحظة: يتم استخدام مرهم العيون للحفاظ على رفرف الجلد في مكانه. - قم بغسل السطح المفتوح باستخدام برنامج تلفزيوني معقم لتنظيف المنطقة من أي دم وشعر متبقي.
ملاحظة: إذا لزم الأمر، استخدم ملقط ذو رؤوس دقيقة لإزالة الشعر المتبقي بعد التنظيف، ولكن كن حذرا من إتلاف الغشاء المحيطي.
- باستخدام ملقط ذو رؤوس ناعمة، التقط الجلد على الفور إلى الأذن اليمنى. مع مقص microdissection، وقطع الجلد الذي عقد من قبل ملقط.
- الكسور الدقيقة
- لتوليد الكسور الدقيقة على الجلجلة، قم بإزالة المكبس من حقنة الأنسولين 29 G وقطع النهاية الخلفية للمحقنة، حول علامات 300-400 uL.
ملاحظة: هذه الخطوة يجعل من السهل على المناورة تحت نطاق تشريح عند إنتاج الإصابة. - ضع طرف شطبة (عرض إبرة إلى اثنين) نحو الأنف من الغرز التاجي وعرض إبرة واحدة إلى اثنتين إلى يمين خياطة القوس (الشكل 1E).
- تدوير بلطف حقنة في اتجاه عقارب الساعة، ثم عكس عقارب الساعة عدة مرات.
ملاحظة: في الفئران الصغيرة، هناك حاجة إلى كمية صغيرة جدا من الضغط النزولي لإنشاء microfracture دائرية. يجب الحرص على عدم السماح الإبرة اختراق الدماغ، لأن هذا سوف يسبب النزيف وتتداخل مع التصوير. - استخدم إبرة 27 G لتوسيع الكسور الدقيقة إلى ~0.4 مم. إذا بقيت شظايا العظام في الكسور الدقيقة، فامسح المنطقة باستخدام برنامج تلفزيوني. إذا كانت شظايا العظام لا تزال باقية في الكسور الدقيقة، فاستخدم إبرة 29 G لاستخراجها برفق.
- كرر الخطوات 4.2.1-4.2.4 لإنشاء إصابة على الجانب الأيسر من خياطة القوس.
ملاحظة: في هذه المرحلة، هناك خياران: 1) المتابعة الفورية لعلاج CCL5 (القسم 4.3) والتصوير (القسم 5)؛ أو 2) إغلاق موقع الجراحة بعد العمليات الجراحية في القسم 6. في 24 ساعة في وقت لاحق، تخدير الماوس مرة أخرى، وإعادة فتح البصر الجراحي، وعلاج الإصابة مع CCL5 (القسم 4.3)، وإجراء التصوير داخل الفيتية (القسم 5) والرعاية بعد الجراحة (القسم 6).
- لتوليد الكسور الدقيقة على الجلجلة، قم بإزالة المكبس من حقنة الأنسولين 29 G وقطع النهاية الخلفية للمحقنة، حول علامات 300-400 uL.
- علاج CCL5
- من مخزون RANTES (100 نانوغرام / مل) ، قم بحل 10 نانوغرام / مل باستخدام مصفوفة غشاء الطابق السفلي (جدول المواد). الحفاظ على هذا الحل على الجليد للحفاظ على مصفوفة في شكل سائل.
- علاج كل إصابة مع 2 ميكرولتر من CCL5 (10 نانوغرام / ميكرولتر) باستخدام ماصة 2-20 ميكرولتر (هذا الطرف ماصة له قطر أكبر، وهو أكثر فعالية عند استخدام سائل لزج). السماح للمصفوفة لترسيخ.
- بمجرد أن تتوطد المصفوفة ، قم بتغطية الجلجلة بلطف برفرف الجلد لضمان عدم جفاف الأنسجة. حضانة لمدة 1 ساعة قبل التصوير.
5. التصوير داخل الفيتال
- إعدادات المجهر
- تشغيل الليزر متعدد الفوتون (ليزر التيتانيوم والياقوت femtosecond). تعيين الطول الموجي إلى 880 نانومتر وضبط الطاقة للجيل التوافقي الثاني (SHG) التصوير (440 نانومتر) من العظام.
- بدوره على 488 نانومتر و 561 نانومتر ليزر الحالة الصلبة لإثارة GFP- و tdTomato التعبير عن الخلايا, على التوالي.
- قم بتشغيل كاشفات PMT (أنبوب فوتوموليلييه) للجيل التوافقي الثاني (الكشف عن 405-455 نانومتر) وإشارات GFP (الكشف عن 505-550 نانومتر). قم بتشغيل كاشف HyD 3 للإشارة إلى الطماطم (الكشف عن 590-620 نانومتر).
- تصاعد
- قبل تحريك الماوس إلى النطاق، تحقق من المستوى البصري للcalcalaria عن طريق الضغط بلطف على الجزء الخلفي من رأس الماوس. إذا لم يكن مستوى الطائرة، فاضبط الموضع بتدوير ضبط النفس بلطف على اليسار أو اليمين.
ملاحظة: هذه خطوة هامة لضمان جودة الصورة الكافية. - تطبيق معقمة 2٪ ميثيلسليلوز في الماء (ث / الخامس) لتغطية الكلفاريا كامل ورفرف الجلد ومنع تجفيف الأنسجة.
- ضع الماوس على مرحلة المجهر الآلية محور XYZ (الشكل 1G). باستخدام ضوء epifluorescent، محاذاة الماوس بحيث 1) أنها تواجه المجهر و 2) تقاطع الغرز التاجية ومترهل هو النقطة المرجعية مركزة من المرحلة.
- ضع الغطاء الزجاجي على منطقة التصوير وتحقق مرتين من المحاذاة (الشكل 1H).
- قبل تحريك الماوس إلى النطاق، تحقق من المستوى البصري للcalcalaria عن طريق الضغط بلطف على الجزء الخلفي من رأس الماوس. إذا لم يكن مستوى الطائرة، فاضبط الموضع بتدوير ضبط النفس بلطف على اليسار أو اليمين.
- التصوير الفاصل الزمني
- استخدام عدسة التكبير منخفضة (25x هدف الغمر المياه مع NA = 0.95) لمسح calvaria. الحصول على صورة مرجعية للتقاطع القوسي والتكشير التاجي.
- باستخدام إشارات SHG والفلورسنت من الخلايا، حدد موقع كل مشهد إصابة وسجل إحداثيات XYZ وكذلك المسافات من الغرز القوسية والإكليلية (الشكل 2B).
- اختر موقعا على الغرز الإكليلية أو القوسية للتصوير طويل الأمد. خذ صورة مفصلة Z-كومة من هذه المنطقة من المرجع أثناء التصوير.
ملاحظة: بما أن الغرز تمثل مكانة معروفة ل P-SSC ، فهذا هو المكان الذي ستهاجر منه الخلايا استجابة لإصابة الجلفاريا. - استخدم إعدادات برنامج الفاصل الزمني لتسجيل صورة كل دقيقة واحدة لمدة ساعة واحدة على الأقل. في الوقت بين اللقطات، قارن حقل العرض الحالي بحقل العرض الأولي. إذا كانت مختلفة، استخدم صورة Z-المكدس لتحديد الاتجاه الذي يجب تعديل حقل العرض.
6. رعاية الحيوانات بعد الجراحة
- بعد التصوير، شطف الجلجلة المكشوفة مع برنامج تلفزيوني عقيم لإزالة الميثيلسليلوز.
- لإغلاق الشق، ضع رفرف الجلد برفق فوق الجلفاريا. استخدام مسحات القطن المعقمة لإزالة مرهم العيون المتبقية وتجفيف موقع شق.
- باستخدام مونوفيليمنت نايلون 5-0 حجم الغرز غير قابلة للابتصاص مع إبرة قطع عكسي C-1 المرفقة، وإغلاق الموقع الجراحي. استخدم مسحة قطنية معقمة لوضع مرهم المضادات الحيوية الثلاثي على الشق المغلق.
ملاحظة: يتم تقليل تندب مع تقنيات خياطة عالية الجودة والحد الأدنى من النزيف. - ضع الماوس في قفص نظيف على سطح دافئ وتحقق كل 15 دقيقة حتى يتم تحقيق شغل المؤخرة.
- إعطاء جرعة ثانية من البوبرينورفين الإفراج المستمر 72 ح بعد الجراحة.
- رصد يوميا لسلوك التجمهر، الفراء تكدرت، و / أو عدم وجود التملق حتى تتم إزالة الغرز (~ 1 أسبوع).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وقد اقترح أن يكون لدى السلف الهيكلية إمكانات للهجرة أو الدورة الدموية 20. في الآونة الأخيرة ، تم إنشاء فئران مراسل Mx1-Cre +Rosa26-Tomato + α SMA-GFP + (Mx1 / Tomato / αSMA-GFP) ، والتي تم فيها تمييز P-SSCs ب Mx1 + α SMA + وضع العلامات المزدوجة (الشكل 2A ، B). حدثت هجرة كبيرة من Mx1 + α SMA + P-SSCs من mesenchyme خياطة داخل 24-48 ساعة بعد الاصابة11. كما تم اختبار إمكانية الكشف في الجسم الحي P-SSC الهجرة في الوقت الحقيقي 24 ساعة بعد عيب calvaria. ولوحظت هجرة ضئيلة أو معدومة ل Mx1+αSMA+ P-SSCs في غضون ساعة واحدة من التصوير (الشكل 2C).
Mx1 + α SMA + P - SSCs تعبر بشكل فريد عن مستقبلات CCL5 المعروفة باسم CCR511. وهكذا، فإن علاج عيب كالفاريا 24 ساعة بعد الإصابة مع CCL5 تسبب هجرة متميزة اتجاهيا بعيدا عن خياطة التاجية ونحو البصر إصابة (الشكل 2D، E). في غضون 1 ساعة من التصوير، هاجرت واحدة من Mx1 + αSMA + P-SSCs حوالي 50 ميكرومتر نحو الإصابة (الشكل 2E). ولوحظ أيضا أن Mx1+αSMA+ P-SSCs أخرى تهاجر استجابة لعلاج CCL5 ولكن بدرجة أقل.
الشكل 1: إعداد للتصوير الحي لجلفاريا الماوس. صور تمثيلية لضبط الماوس (A) وتركيب التصوير (B) المستخدمة أثناء التصوير الحي. (ج) الماوس في ضبط النفس وتأمينها على جبل التصوير. (D) التمثيل التخطيطي لهيكل كالفاريا الماوس، وتحديد الجبهي (FS)، التاجي (CS)، القوس (SS)، وخيوط لامدويد (LS). (ه) وضع ممثل لإصابات الكسور الدقيقة كالفاريا. (F) وضع خياطة جراحية بعد الجراحة للشفاء الأمثل والتصوير في المستقبل. صور تمثيلية لوضع التركيب على مرحلة المجهر (G) ووضع الغطاء (H). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: في الوقت الحقيقي في التصوير الحي للهجرة Mx1 + αSMA + P - SSC. (أ) التخطيطي من Mx1/الطماطم/αSMA-GFP إعداد الفئران مراسل مزدوج. تم حقن الفئران intraperitoneally مع 25 ملغم / كجم pIpC كل يومين لمدة 10 أيام (1). تم تشعيع فئران Mx1/Tomato/αSMA-GFP بشكل قاتل مع 9.5 Gy (2) قبل يوم واحد من زرع الوريد من 1 × 106 خلايا نووية أحادية نقي العظم الكاملة من فئران WT C57BL/6 (3). بعد 6-8 أسابيع من التعافي (عندما تبول خلايا الورم الدموي للمضيف أقل من 5٪) ، تعرضت الفئران لتجارب إصابة العظام. Mx1+ (طماطم+)، αSMA+ (GFP+)، Mx1+α SMA+ (طماطم+GFP+)، وعظم (أزرق). (ب) الحد الأقصى لإسقاط Z لإصابة كالفاريا تمثيلية (دائرة بيضاء) ومواقع التصوير (المربع الأبيض) فيما يتعلق بخيوط القوس (SS) والإكليلية (CS) من فأر Mx1/Tomato/αSMA-GFP. تمثل الخطوط المنقطة خياطات كالفاريا. (ج) في التصوير الحي لاستجابة Mx1+α SMA+ P-SSCs بعد 24 ساعة من الإصابة. شريط المقياس = 25 ميكرومتر. (د) 24 ساعة بعد الإصابة، تم إعطاء CCL5 عند رؤية الإصابة، وفي التصوير الحي تم إجراؤه بعد ساعة واحدة فيما يتعلق بالغرزة التاجية (CS). يمثل المربع الأبيض موقع صور ترحيل الخلايا المعروضة في (E). شريط المقياس = 75 ميكرومتر. (ه) هجرة Mx1+ α SMA + P-SSCs على سطح العظام (الأزرق) نحو مشهد الإصابة (أعلى اليمين). شريط المقياس = 25 ميكرومتر. في (C, D, E), تشير الأرقام إلى وقت التصوير. يشير السهم الأصفر إلى اتجاه موقع الإصابة. تشير النجمة إلى مسار الهجرة من Mx1+α SMA+ P-SSC. الصورة هي ممثلة لنتائج ثلاثة إلى خمسة فئران. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
أثناء شفاء العظام، الخلايا المحيطة بالخلايا هي المصدر الرئيسي للخلايا الشوندروسيتية والعظام المتمايزة حديثا داخل كالوس3 الإصابة. وعلى غرار نخاع العظم، تم أيضا تحديد مركبات الكربون الهيدروفلورية/التشوندروجينية في الحضيض 4،5،6. تقييم الخصائص الوظيفية P-SSC الذاتية أمر صعب من الناحية الفنية. وفي كثير من الأحيان، تقيم ديناميات الهجرة في البلدان النامية غير المفلورة في المختبر، مما يجعل تفسير ما يقابلها في النظم الحية أمرا صعبا. بسبب التقدم الأخير في المجهر الحيواني الحي داخل الجسم وتوليد فئران المراسل الإضافية (Mx1/Tomato/αSMA-GFP) ، أصبح من الممكن الآن تتبع الخلايا الفردية في الجسم الحي. وهكذا، يسمح هذا الأسلوب في تسجيل في الجسم الحي من CCL5 المستحث P-SSCs الهجرة في الوقت الحقيقي.
هناك العديد من التحديات التقنية المرتبطة بهذه الطريقة التي يمكن أن تؤثر على اتساق التصوير. ويتمثل أحد التحديات التقنية الرئيسية في هذه الطريقة في الحفاظ على مستوى الرؤية لمحور Z. ز محور الانجراف (Z - الانجراف) هي قضية شائعة في التصوير على المدى الطويل من العينات الثابتة والحية ، ويعزى ذلك إلى حد كبير إلى التغيرات في درجة الحرارة في بيئة التصوير. على الرغم من أن هذه القطعة الأثرية لا يمكن مواجهتها تماما ، إلا أن تغطية المرحلة والعدسات الموضوعية والهياكل الداعمة تساعد على تقليل Z-drift21.
وعلاوة على ذلك، فإن الحصول على سلسلة Z-stack من موقع التصوير قبل التصوير الفاصل الزمني سينشئ مرجعا لمحور Z يمكن الإشارة إليه بين عمليات الحصول على الصور (أي أن الصور تؤخذ عادة كل 30-60 ثانية، مما يتيح الوقت لإجراء تعديلات على المحور Z، إذا لزم الأمر). وثمة تحد تقني آخر هو جعل microfracture متسقة التي هي نفس الحجم والشكل والمسافة من الغرز calvaria. المسافة من الغرز التاجية والدهل أمر بالغ الأهمية، لأن الغرز calvaria هي مكانة لSSCs10 هادئة. أفضل طريقة للحد من تقلب الكسور الدقيقة هي ممارسة هذه التقنية في الفئران التي لم يتم تضمينها في التحليل النهائي.
على الرغم من القيود، توفر هذه الطريقة نظاما فريدا لتقييم الاستجابة الخلوية الفردية في الجسم الحي لإصابة العظام. منذ إصلاح الكسور هي عمليات معقدة للغاية تنطوي على أنواع خلايا متعددة، وهناك العديد من الجوانب التي ليست مفهومة تماما. وتشمل إحدى هذه التدابير الاستجابة المبكرة للهجرة من جانب الشركات الخاصة في حالات الإصابة. في حين أن CCR5/CCL5 هي آلية فريدة يتم من خلالها توظيف P-SSCs لإصابة، فمن الممكن أن السيتوكينات الإضافية وعوامل النمو تلعب دورا هاما في شفاء الكسور. في السابق، أدى علاج الكسور مع مختلف السيتوكينات وعوامل النمو في نتائج متغيرة للغاية في الشفاء كسر الشامل22. توفر طريقة التصوير هذه منصة فريدة لتحديد الآثار الفسيولوجية للعلاجات المحتملة للدواء / السيتوكين / عامل النمو على الاستجابات الخلوية الفردية. وأخيرا، فإنه يوفر في الجسم الحي البيانات الميكانيكية التي يمكن أن تدعم تعزيز العلاج محددة من شفاء الكسور.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
L.C.O. وD.P. الكشف عن براءة اختراع معلقة بعنوان "الخلايا الجذعية الهيكل العظمي Periosteal في إصلاح العظام" (BAYM. P0264US. P1). ولا يعلن المؤلفون الباقون عن أي مصالح متنافسة.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من خلال جائزة برنامج أمراض العظام في تكساس ، وجائزة صندوق كارولين وز للقانون ، وNIAMS للمعاهد الوطنية للصحة تحت أرقام الجوائز R01 AR072018 ، R21 AG064345 ، R01 CA221946 إلى D.P. نشكر M.E. Dickinson و T.J. Vadakkan في التصوير البصري BCM وCore المجهر الحيوي ونوى التكنولوجيا المتقدمة BCM بتمويل من المعاهد القومية للصحة (AI036211 وCA125123 وDK056338).
.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ½” optical post | ThorLabs | TR2 | For imaging mount |
| 1 mL syringe | BD | 309659 | |
| 27G needle | BD PercisionGlide | 305111 | |
| 29G insulin syringe | McKesson | 102-SN05C905P | |
| 50 mL conicol tube | Falcon | 352098 | For mouse restraint |
| Adjustable angle plate | Renishaw | R-PCA-5023-50-20 | For imaging mount |
| Alcohol wipes | Coviden | 6818 | |
| betadine surgical scrub | Henry Schen | 67618-151-16 | |
| Buprenorphine SR-LAB | ZooPharm | 1mg/mL Sustained Release | |
| Combo III | Obtained from staff veterinarian | N/A | 37.6 mg/mL Ketamine; 1.9 mg/mL Xylazine; 0.37 mg/mL Acepronazine |
| Coverslip | Fisher | 12-545-87 | 24 x 40 premium superslip |
| Fine tip forcepts | FST | 11254-20 | |
| Ketamine | KetaVed | 50989-161-06 | 100 mg/mL |
| Leica TCS SP8MP with DM6000CFS | Leica Microsystems | N/A | |
| Matrigel | R & D Systems | 344500101 | |
| Medical tape | McKesson | 100199 | 3" x 10 yds (7.6 cm x 9.1 m) |
| Methocellulose | Electron Microscopy Sciences | 19560 | |
| Microdissection scissors | FST | 1456-12 | |
| Motorized stage | Anaheim automation | N/A | |
| Needle holder | FST | 12500-12 | |
| Nonabsorbable sutures | McKesson | S913BX | monofilament nylon 5-0 nonabsorbable sutures with attached C-1 reverse cutting needle |
| Opthalmic ointment | Rugby | 0536-1086-91 | |
| RANTES | Biolegend | 594202 | 10 µg/50 µL |
| Right-angle clamp for ½” post, 3/16” Hex | ThorLabs | RA90 | For imaging mount |
| Spring-loaded 3/16” Hex-locking ¼” thumbscrew | ThorLabs | TS25H | For imaging mount |
| Sterile cotton swabs | Henry Schen | 100-9249 | |
| Sterile DPBS (1x) | Corning | 21-030-CV | |
| Sterile drapes | McKessen | 25-517 | |
| Surgical gloves | McKessen | 3158VA | |
| Triple antibiotic ointment | Taro Pharmaceuticals U.s.a., Inc. | 51672-2120-2 | |
| Vacutainer blood collection set | BD | REF 367298 | 25G butterfly needle infusion set with 12" tubing |
References
- Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: mechanisms and interventions. Nature Reviews Rheumatology. 11 (1), 45-54 (2015).
- Murao, H., Yamamoto, K., Matsuda, S., Akiyama, H. Periosteal cells are a major source of soft callus in bone fracture. Journal of Bone and Mineral Metabolism. 31 (4), 390-398 (2013).
- Colnot, C. Skeletal cell fate decisions within periosteum and bone marrow during bone regeneration. Journal of Bone and Mineral Research. 24 (2), 274-282 (2009).
- Roberts, S. J., van Gastel, N., Carmeliet, G., Luyten, F. P. Uncovering the periosteum for skeletal regeneration: the stem cell that lies beneath. Bone. 70, 10-18 (2015).
- Duchamp de Lageneste, O., et al. Periosteum contains skeletal stem cells with high bone regenerative potential controlled by Periostin. Nature Communications. 9 (1), 773 (2018).
- Olivos-Meza, A., et al. Pretreatment of periosteum with TGF-beta1 in situ enhances the quality of osteochondral tissue regenerated from transplanted periosteal grafts in adult rabbits. Osteoarthritis Cartilage. 18 (9), 1183-1191 (2010).
- Debnath, S., et al. Discovery of a periosteal stem cell mediating intramembranous bone formation. Nature. 562 (7725), 133-139 (2018).
- Ransom, R. C., et al. Axin2-expressing cells execute regeneration after skeletal injury. Scientific Reports. 6, 36524 (2016).
- Ouyang, Z., et al. Prx1 and 3.2kb Col1a1 promoters target distinct bone cell populations in transgenic mice. Bone. 58, 136-145 (2013).
- Wilk, K., et al. Postnatal Calvarial Skeletal Stem Cells Expressing PRX1 Reside Exclusively in the Calvarial Sutures and Are Required for Bone Regeneration. Stem Cell Reports. 8 (4), 933-946 (2017).
- Ortinau, L. C., et al. Identification of Functionally Distinct Mx1+alphaSMA+ Periosteal Skeletal Stem Cells. Cell Stem Cell. 25 (6), 784-796 (2019).
- Deveza, L., Ortinau, L., Lei, K., Park, D. Comparative analysis of gene expression identifies distinct molecular signatures of bone marrow- and periosteal-skeletal stem/progenitor cells. PLoS One. 13 (1), 0190909 (2018).
- Schindeler, A., McDonald, M. M., Bokko, P., Little, D. G. Bone remodeling during fracture repair: The cellular picture. Seminars in Cell and Developmental Biology. 19 (5), 459-466 (2008).
- Shi, Y., et al. Gli1 identifies osteogenic progenitors for bone formation and fracture repair. Cell Stem Cell. 15 (2), 782-796 (2017).
- Zhou, B. O., Yue, R., Murphy, M. M., Peyer, J. G., Morrison, S. J. Leptin-receptor-expressing mesenchymal stromal cells represent the main source of bone formed by adult bone marrow. Cell Stem Cell. 15 (2), 154-168 (2014).
- Grcevic, D., et al. In vivo fate mapping identifies mesenchymal progenitor cells. Stem Cells. 30 (2), 187-196 (2012).
- Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K.
- Srinivas, S., et al. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Developmental Biology. 1, 4 (2001).
- Park, D., et al. Endogenous bone marrow MSCs are dynamic, fate-restricted participants in bone maintenance and regeneration. Cell Stem Cell. 10 (3), 259-272 (2012).
- Nitzsche, F., et al. Concise Review: MSC Adhesion Cascade-Insights into Homing and Transendothelial Migration. Stem Cells. 35 (6), 1446-1460 (2017).
- Adler, J., Pagakis, S. N. Reducing image distortions due to temperature-related microscope stage drift. Journal of Microscopy. 210, Pt 2 131-137 (2003).
- Roberts, S. J., Ke, H. Z. Anabolic Strategies to Augment Bone Fracture Healing. Current Osteoporosis Reports. 16 (3), 289-298 (2018).
