Imagerie en temps réel de la migration induite par CCL5 de cellules souches squelettiques périostées chez la souris

Résumé

Ce protocole décrit la détection de la migration des cellules souches squelettiques périostées médiées par CCL5 en temps réel à l’aide de la microscopie intravitale d’animaux vivants.

Résumé

Les cellules souches squelettiques périostées (P-SSC) sont essentielles à l’entretien et à la réparation des os tout au long de leur vie, ce qui en fait un point de mire idéal pour le développement de thérapies visant à améliorer la guérison des fractures.  Les cellules périostées migrent rapidement vers une blessure pour fournir de nouveaux chondrocytes et ostéoblastes pour la guérison des fractures. Traditionnellement, l’efficacité d’une cytokine pour induire la migration cellulaire n’a été réalisée in vitro qu’en effectuant un test transwell ou scratch. Avec les progrès de la microscopie intravitale utilisant l’excitation multiphotonique, il a été récemment découvert que 1) les P-SSC expriment le gène migrateur CCR5 et 2) le traitement avec le ligand CCR5 connu sous le nom de CCL5 améliore la cicatrisation des fractures et la migration des P-SSC en réponse à CCL5. Ces résultats ont été saisis en temps réel. Décrit ici est un protocole pour visualiser la migration de la P-SSC de la niche des cellules souches squelettiques (SSC) de suture calvariaire vers une blessure après un traitement par CCL5. Le protocole détaille la construction d’une fixation de souris et d’un support d’imagerie, la préparation chirurgicale de la calvaire de la souris, l’induction d’un défaut de calvaire et l’acquisition de l’imagerie en accéléré.

Introduction

La réparation des fractures est un processus dynamique et multicellulaire qui se distingue du développement et du remodelage du squelette embryonnaire. Au cours de ce processus, l’induction de signaux de blessure provenant de tissus endommagés est suivie du recrutement, de la prolifération et de la différenciation subséquente des cellules souches/progénitrices squelettiques, qui sont toutes essentielles à la stabilité globale et à la fixation des ^fractures1. En particulier, les premiers stades de la guérison des fractures nécessitent la formation de callosités molles, qui est principalement attribuée aux cellules résiden....

Protocole

Toutes les souris ont été maintenues dans des conditions exemptes d’agents pathogènes et toutes les procédures ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) du Baylor College of Medicine.

1. Préparation de la souris

1. Croisez des souris ^Mx1-Cre17 et Rosa26-loxP-stop-loxP-tdTomato (Tom)¹⁸ (achetées au jackson Laboratory) avec des souris αSMA-GFP (fournies ici par les Drs Ivo Kalajzic et Henry Kronenberg) pour générer des souris rapporteures Mx1-Cre+Rosa26-Tomato⁺α ....

Résultats

Il a été proposé que les progéniteurs squelettiques aient un potentiel migratoire ou ^{circulatoire20}. Récemment, des souris rapporteures Mx1-Cre⁺Rosa26-Tomato⁺α SMA-GFP⁺ (Mx1/Tomato/αSMA-GFP) ont été générées, dans lesquelles les P-SSC sont marquées par un double marquage Mx1⁺α SMA⁺ (Figure 2A,B). Une migration importante des P-SSC .......

Discussion

Au cours de la cicatrisation osseuse, les cellules périostées sont la principale source de chondrocytes et d’ostéoblastes nouvellement différenciés dans un callosité ^{de blessure3}. À l’instar de la moelle osseuse, des SSC ostéogéniques/chondrogènes ont également été identifiés dans le périoste4,5,6. L’évaluation des caractéristiques fonctionnelles endogènes du P-SSC est techniquement difficile. Souvent, la.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
½ ; ” Tige optique	ThorLabs	TR2	Pour support d’imagerie
Seringue 1 mL	BD	309659
aiguille 27G	BD PercisionGlide	305111
seringue à insuline 29G	McKesson	102-SN05C905P
50 mL tube conicol	Falcon	352098	Pour la contention
Plaque d’angle réglable	Renishaw	R-PCA-5023-50-20	Pour support d’imagerie
Lingettes imbibées d’alcool	Coviden	6818
gommage chirurgical à la bétadine	Henry Schen	67618-151-16
Buprénorphine SR-LAB	ZooPharm		1mg/mL Sustained Release
Combo III	Obtenu du vétérinaire du personnel	N/A	37,6 mg/mL Kétamine ; 1,9 mg/mL Xylazine ; 0,37 mg/mL Acépronazine
Coverslip	Fisher	12-545-87	24 x 40 premium superslip
Forcepts à pointe fine	FST	11254-20
Kétamine	KetaVed	50989-161-06	100 mg/mL
Leica TCS SP8MP avec DM6000CFS	Leica Microsystems	N/A
Matrigel	R & D Systems	344500101
Ruban médical	McKesson	100199	7,6 cm x 9,1 m (3 po x 10 vg)
Méthocellulose	Microscopie électronique Sciences	19560
Ciseaux de microdissection	FST	1456-12
Platine motorisée	Anaheim automation	N/A
Porte-aiguille	FST	12500-12
Sutures non résorbables	McKesson	S913BX	monofilament nylon 5-0 sutures non résorbables avec aiguille coupante inversée C-1 attachée
Pommade ophtalmique	Rugby	0536-1086-91
RANTES	Biolegend	594202	10 µ ; g/50 et micro ; L
Pince à angle droit pour ½ ; ” poteau, 3/16" Hex	ThorLabs	RA90	Pour monture d’imagerie
Chargement par ressort 3/16" Verrouillage hexagonal ¼ ; ” vis à oreilles	ThorLabs	TS25H	Pour monture d’imagerie
Cotons-tiges stériles	Henry Schen	100-9249
DPBS stériles (1x)	Corning	21-030-CV
Champs stériles	McKessen	25-517
Gants chirurgicaux	McKessen	3158VA
Pommade antibiotique triple	Taro Pharmaceuticals U.s.a., Inc.	51672-2120-2
Kit de prélèvement sanguin Vacutainer	BD	REF 367298	25G Set de perfusion à aiguille papillon avec tube de 12"

de la souris