Questo protocollo descrive il rilevamento della migrazione delle cellule staminali scheletriche periosteali mediate da CCL5 in tempo reale utilizzando la microscopia intravitale animale vivo.
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Articolo metodologico
Imaging in tempo reale della migrazione indotta da CCL5 di cellule staminali scheletriche periosteali nei topi
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le cellule staminali scheletriche periosteali (P-SSC) sono essenziali per il mantenimento e la riparazione ossea per tutta la vita, rendendole un punto focale ideale per lo sviluppo di terapie per migliorare la guarigione delle fratture. Le cellule periosteali migrano rapidamente verso una lesione per fornire nuovi condrociti e osteoblasti per la guarigione delle fratture. Tradizionalmente, l'efficacia di una citochina per indurre la migrazione cellulare è stata condotta solo in vitro eseguendo un test transwell o scratch. Con i progressi nella microscopia intravitale utilizzando l'eccitazione multifotonica, è stato recentemente scoperto che 1) le P-SSC esprimono il gene migratore CCR5 e 2) il trattamento con il ligando CCR5 noto come CCL5 migliora la guarigione delle fratture e la migrazione delle P-SSC in risposta a CCL5. Questi risultati sono stati acquisiti in tempo reale. Qui è descritto un protocollo per visualizzare la migrazione P-SSC dalla nicchia delle cellule staminali scheletriche di sutura calvariale (SSC) verso una lesione dopo il trattamento con CCL5. Il protocollo descrive in dettaglio la costruzione di un sistema di ritenuta per topo e di un supporto per l'imaging, la preparazione chirurgica della calvaria del topo, l'induzione di un difetto di calvaria e l'acquisizione dell'imaging time-lapse.
Introduzione
La riparazione delle fratture è un processo dinamico e multicellulare che si distingue dallo sviluppo scheletrico embrionale e dal rimodellamento. Durante questo processo, l'induzione di segnali di lesione dal tessuto danneggiato è seguita dal rapido reclutamento, proliferazione e successiva differenziazione delle cellule staminali /progenitrici scheletriche, che sono tutte fondamentali per la stabilità generale e la fissazione delle fratture1. In particolare, le prime fasi della guarigione delle fratture richiedono la formazione di callo molle, che è principalmente attribuita alle cellule residenti periosteali2. Quando ....
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Protocollo
Tutti i topi sono stati mantenuti in condizioni prive di agenti patogeni e tutte le procedure sono state approvate dal Baylor College of Medicine's Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Preparazione del mouse
- Incrociare i mouse Mx1-Cre17 e Rosa26-loxP-stop-loxP-tdTomato (Tom)18 (acquistati dal Jackson Laboratory) con mouse αSMA-GFP (forniti qui dai dottori Ivo Kalajzic e Henry Kronenberg) per generare mouse reporter Mx1-Cre+Rosa26-Tomato+α SMA-GFP+ (Mx1/Tomato/αSMA-GFP) (....
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Risultati
È stato proposto che i progenitori scheletrici abbiano un potenziale migratorio o circolatorio20. Recentemente, sono stati generati mouse reporter Mx1-Cre+Rosa26-Tomato+α SMA-GFP+ (Mx1/Tomato/αSMA-GFP), in cui i P-SSC sono contrassegnati dalla doppia etichettatura Mx1+α SMA+ (Figura 2A,B). La migrazione sostanziale di Mx1.......
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Discussione
Durante la guarigione ossea, le cellule periosteali sono la principale fonte di condrociti e osteoblasti recentemente differenziati all'interno di un callo di lesione3. Analogamente al midollo osseo, anche nel perostio sono state identificate SSC osteogeniche/condrogene4,5,6. Valutare le caratteristiche funzionali endogene di P-SSC è tecnicamente impegnativo. Spesso, le dinamiche migratorie delle SSC sono.......
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Dichiarazioni
L.C.O. e D.P. divulgano un brevetto in sospeso intitolato "Periosteal Skeletal Stem Cells in Bone Repair" (BAYM. P0264US. P1). Gli altri autori non dichiarano interessi concorrenti.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dal Bone Disease Program of Texas Award, dal Caroline Wiess Law Fund Award e dal NIAMS del National Institutes of Health con i numeri di premio R01 AR072018, R21 AG064345, R01 CA221946 a D.P. Ringraziamo M.E. Dickinson e T.J. Vadakkan nel BCM Optical Imaging and Vital Microscopy Core e nel BCM Advanced Technology Cores con finanziamenti da NIH (AI036211, CA125123 e DK056338).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| ½ ” perno ottico | ThorLabs | TR2 | Per supporto imaging |
| Siringa da 1 mL | 309659 | ||
| ago da 27 G | BD PercisionGlide | 305111 | |
| Siringa da insulina da 29 G | McKesson | 102-SN05C905P | |
| tubo conico da 50 mL | Falcon | 352098 | Per la contenzione del mouse |
| Piastra angolare regolabile | Renishaw | R-PCA-5023-50-20 | Per montaggio imaging |
| Salviette imbevute di alcol | Coviden | 6818 | |
| Scrub chirurgico betadine | Henry Schen | 67618-151-16 | |
| Buprenorfina SR-LAB | ZooPharm | 1mg/mL Combo a rilascio prolungato | |
| III | Ottenuto dal veterinario del personale | N/A | 37,6 mg/mL Ketamina; 1,9 mg/mL Xilazina; 0,37 mg/mL Acepronazina |
| Vetrino coprioggetti | Fisher | 12-545-87 | 24 x 40 premium superslip |
| Punte fini forcepts | FST | 11254-20 | |
| Ketamina | KetaVed | 50989-161-06 | 100 mg/mL |
| Leica TCS SP8MP con DM6000CFS | Leica Microsystems | N/A | |
| Matrigel | R & D Systems | 344500101 | |
| Nastro medico | McKesson | 100199 | 3" x 10 yds (7,6 cm x 9,1 m) |
| Microscopia elettronica | metocellulosa | Scienze 19560 | |
| Forbici per microdissezione | FST | 1456-12 | |
| Tavolino motorizzato | Anaheim automation | N/A | |
| Porta aghi | FST | 12500-12 | |
| Suture non assorbibili | McKesson | S913BX | monofilamento di nylon 5-0 suture non assorbibili con attaccato C-1 ago da taglio inverso |
| Unguento oftalmico | Rugby | 0536-1086-91 | |
| RANTES | Biolegend | 594202 | 10 &; g/50 µ L |
| Morsetto ad angolo retto per ½ ” palo, 3/16" Hex | ThorLabs | RA90 | Per montatura a |
| molla 3/16" Bloccaggio esagonale ¼ ” vite a testa zigrinata | ThorLabs | TS25H | Per supporto imaging |
| Tamponi di cotone sterili | Henry Schen | 100-9249 | |
| DPBS sterile (1x) | Corning | 21-030-CV | |
| Teli sterili | McKessen | 25-517 | |
| Guanti chirurgici | McKessen | 3158VA | |
| Unguento antibiotico triplo | Taro Pharmaceuticals U.s.a., Inc. | 51672-2120-2 | |
| Set per la raccolta del sangue Vacutainer | BD | REF 367298 | Set per infusione con ago a farfalla da 25G con tubo da 12" |
Riferimenti
- Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: mechanisms and interventions. Nature Reviews Rheumatology. 11 (1), 45-54 (2015).
- Murao, H., Yamamoto, K., Matsuda, S., Akiyama, H. Periosteal cells are a major source of soft callus in bone fracture. ....
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Ristampe e permessi
