Summary
פרוטוקול זה מתאר את הזיהוי של נדידת תאי גזע שלד periosteal בתיווך CCL5 בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופיה תוך-וינטלית חיה של בעלי חיים.
Abstract
תאי גזע שלד periosteal (P-SSCs) חיוניים לתחזוקה ותיקון עצם לכל החיים, מה שהופך אותם למוקד אידיאלי לפיתוח טיפולים כדי לשפר את ריפוי שבר. תאי periosteal במהירות נודדים לפציעה כדי לספק כונדרוציטים חדשים osteoblasts לריפוי שבר. באופן מסורתי, היעילות של ציטוקינים כדי לגרום לנדידת תאים נערכה רק במבחנה על ידי ביצוע transwell או שריטה. עם התקדמות במיקרוסקופיה תוך-וינטלית באמצעות עירור מולטי-פוטונים, לאחרונה התגלה כי 1) P-SSCs מבטאים את הגן הנודד CCR5 ו-2) טיפול בליגנד CCR5 המכונה CCL5 משפר את ריפוי השברים ואת ההעברה של מחשבי P-SSCs בתגובה ל- CCL5. תוצאות אלה נלכדו בזמן אמת. מתואר כאן פרוטוקול כדי לדמיין נדידת P-SSC מן נישה שלד תפר עגל (SSC) נישה כלפי פציעה לאחר טיפול עם CCL5. הפרוטוקול מפרט את בנייתו של ריסון עכבר והר הדמיה, הכנה כירורגית של קלבריה העכבר, אינדוקציה של פגם קלבריה, ורכישת הדמיה לשגות זמן.
Introduction
תיקון שבר הוא תהליך דינמי, רב תאי, השונה מהתפתחות השלד העוברי ושיפוץ. במהלך תהליך זה, אינדוקציה של אותות פגיעה מרקמה פגומה מלווה גיוס מהיר, התפשטות, ובידול לאחר מכן של תאי גזע שלד / אבות, אשר כולם קריטיים ליציבות הכוללת קיבוע של שברים1. בפרט, שלבים מוקדמים של ריפוי שבר דורשים היווצרות קדנציה רכה, המיוחסת בעיקר לתאים תושב periosteal2. כאשר העצמות נפגעות, תת-קבוצה של תאי פריוסטאלי מגיבים במהירות ותורמים לסחוסים מובחנים חדשים ומתווכים אוסטאובלסטים בתוך היבלת3, מה שמסבך את נוכחותה של אוכלוסיית תאי גזע שלד/אבות מובהקת בתוך periosteum. לכן, הזיהוי והאפיון התפקודי של תאי גזע השלד (SSCs) המקומיים פריוסטאום מהווים גישה טיפולית מבטיחה למחלות עצם ניווניות ופגמים בעצמות4.
SSCs נחשבים להתגורר במקומות רקמות מרובים, כולל מח העצם. בדומה מוח עצם, SSCs osteogenic / chondrogenic זוהו גם periosteum4,5,6. אלה pc periosteal (P-SSCs) ניתן לתייג עם סמני שושלת מזנכימלית מוקדמת (כלומר, Prx1-Cre5, Ctsk-Cre7, ו Axin2-CreER8) במהלך התפתחות עצם עובר4,7,8,9,10. מגבלה משמעותית של מודלים אלה של מעקב אחר שושלת גנטית אחת היא שיש הטרוגניות משמעותית באוכלוסיות תאים מסומנות. יתר על כן, הם לא יכולים להבחין SSCs מתויגים מן צאצאיהם ב vivo. כדי להתמודד עם מגבלה זו, פיתחנו לאחרונה עכבר כתב כפול (Mx1-Cre +Rosa26-Tomato+α SMA-GFP+) כדי לדמיין באופן ברור P-SSCs מ- SSCs מח עצם (BM-SSCs)11. עם דגם זה, נקבע כי P-SSCs מסומנים על ידי Mx1 + αSMA + תיוג כפול, בעוד תאים Mx1 + מובחנים יותר שוכנים במח העצם, משטחים אנדוסטאליים ופריוסטיליים, ועצמות קליפת המוח והטראבולר11,12.
ציטוקינים מרובים וגורמי גדילה ידועים לווסת שיפוץ ותיקון עצם נבדקו עבור שיפור של תיקון שלד פגמים מגזר קריטי1,13. עם זאת, בשל המורכבות התאית של מודלים פגיעה שנוצר באמצעות שיבוש המחסום הפיזי של תא העצם, ההשפעות הישירות של מולקולות אלה על נדידת P-SSC אנדוגני והפעלה במהלך הריפוי אינם ברורים. המאפיינים התפקודיים ודינמיקת הנדידה של SSCs מוערכים לעתים קרובות במבחנה על ידי ביצוע בדיקות טרנסוול או שריטה, בשילוב עם ציטוקינים או גורמי גדילה הידועים כמזינים הגירה באוכלוסיות תאים אחרות. לכן, פרשנות של תוצאות אלה ניסויים במבחנה ליישום במערכות vivo המקבילות שלהם הוא מאתגר. נכון לעכשיו, בהערכת vivo של נדידת גזע שלד / אבות לא נצפתה בדרך כלל בזמן אמת; במקום זאת, הוא נמדד בנקודות זמן קבועות לאחר שבר5,7,14,15,16.
מגבלה של שיטה זו היא שההעברה אינה מוערכת ברמה של תא בודד; במקום זאת, הוא נמדד באמצעות שינויים באוכלוסיות התאים. בשל ההתקדמות האחרונה במיקרוסקופיה תוך-וינטלית של בעלי חיים חיים ויצירת עכברי כתבים נוספים, מעקב ויוו אחר תאים בודדים אפשרי כעת. באמצעות מיקרוסקופיה תוך-ויאלית חיה של בעלי חיים, ראינו את הנדידה המובהקת של P-SSCs מנישת התפר קלבריה לפגיעה בעצמות בתוך 24-48 שעות לאחר פגיעה בעכברים Mx1/Tomato/αSMA-GFP.
CCL5/CCR5 זוהה לאחרונה כמנגנון רגולטורי המשפיע על גיוס והפעלה P-SSCs במהלך התגובה לפציעה מוקדמת. מעניין, לא היה זיהוי של הגירה P-SSC משמעותית בתגובה לפציעה בזמן אמת. עם זאת, טיפול בפציעה עם CCL5 מייצר הגירה חזקה ומובהקת לכיוון של P-SSCs, אשר ניתן ללכוד בזמן אמת. לכן, מטרת פרוטוקול זה היא לספק מתודולוגיה מפורטת להקלטת נדידת in vivo של P-SSCs בזמן אמת לאחר הטיפול עם CCL5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל העכברים נשמרו בתנאים נטולי פתוגנים, וכל ההליכים אושרו על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים של מכללת ביילור לרפואה (IACUC).
1. הכנת עכבר
- קרוס Mx1-Cre17 ו-Rosa26-loxP-stop-loxP-tdTomato (טום)18 עכברים (שנרכשו ממעבדת ג'קסון) עם עכברי αSMA-GFP (מסופקים כאן על ידי ד"ר איבו קלג'זיץ' והנרי קרוננברג) כדי ליצור עכברי Mx1-Cre+Rosa26-Tomato+α SMA-GFP+ (Mx1/Tomato/αSMA-GFP) עכברים (איור 2A).
- עבור אינדוקציה Mx1-Cre, להזריק עכברים עם 25 מ"ג/ק"ג pIpC כל יומיים במשך 10 ימים.
- עכברים הקרנה עם 9.5 Gy יום אחד לפני השתלה תוך ורידי של 1 x 106 תאים מונונוקלאריים של מח עצם שלם מעכברי C57BL/6 מסוג בר (WT-BMT)19.
- לאחר 6 עד 8 שבועות של התאוששות, עכברי נושא להדמיית in vivo של פרוטוקול העברת תאים periosteal המתואר להלן.
הערה: הקרנה ו- WT-BMT של עכברי Mx1-Cre נחוצים כדי לחסל תאים hematopoietic בשם Mx1 אנדוגני שעלולים להגיב לפציעה. שישה עד שמונה שבועות לאחר ההקרנה, ספירת התאים ההמטו-מואטיאטיים של המארח עומדת על <5% ולכן מוכנה להדמיה19.
2. ריסון עכבר והרכבה הדמיה
- צור ריסון עכבר באמצעות צינור חרוט 50 מ"ל (איור 1A).
- באמצעות מספריים מחודדים, לתקוע חור דרך החלק התחתון של החרוט. חותכים מהחור התחתון לחלק העליון של החרוט (הצד החתוך יהיה החלק העליון של האיפוק).
- בצעו חתך באורך של כ-4-5 ס"מ במקביל לחתך הקודם ובחצי הדרך למטה (כ-2 ס"מ) מראש האיפוק. הסר קטע זה של החרוט וחלק את הקצוות היו נחוצים.
- בנה הרכב הדמיה של צינור חרוט באמצעות צלחת זווית מתכווננת, עמוד אופטי בגודל 0.5 אינץ' ומהדק בזווית ישרה עבור עמוד בגודל 0.5 אינץ', "0.1875 Hex (איור 1B וטבלת חומרים).
- התאם את לוח הזווית לזווית של 35°. בצד שמאל של צלחת הזווית, בורג את ההודעה האופטית לתוך החור השני מהחלק האחורי של הצלחת.
- בצד ימין של הלוח המתכוונן, הכנס חורים 0.1875 אינץ' משושלים 0.25 אינץ' לחור השני מהחזית וחורים אחרונים על הצלחת. המהדק בזווית ישרה ישמש עם העמוד האופטי כדי לאבטח את ריסון העכבר החרוט במקום.
3. הליך כירורגי טרום ניתוחי
- הרדמה של עכבר
- לטיפול בכאב, הזריקו לעכבר באופן תת עורי בופרנורפין שחרור מתמשך (1 מ"ג/ק"ג ב"ג) 30-60 דקות לפני הניתוח.
- עכברי מורדמים באמצעות שילוב CCM מכרסם III (משולב III) הרדמה המכילה 37.5 מ"ג / מ"ל קטמין, 1.9 מ"ג / מ"ל קסילאסין, ו 0.37 מ"ג / מ"ל acepromazine. המינון המתאים לעכברים הוא 0.75-1.50 מ"ל לכל 1 ק"ג של משקל גוף. המינון יימשך 30-45 דקות.
- לאחר העכבר הוא מרדים, להחיל משחה עיניים על העיניים עם צמר גפן סטרילי כדי למנוע התייבשות העין.
- להדמיה ארוכת טווח (>45 דקות), יש לבצע הרדמה שוב כדי לשמור על עומק הרדמה תקין כדלקמן.
- הכן מזרק 1 מ"ל עם כמות מספקת של משולב III כדי לשמור על הרדמה למשך ההדמיה המתוכננת (0.75 מ"ל / קילוגרם BW לכל 30 דקות של סם נוסף). חברו 25 גרם עירוי מחט פרפר עם צינורות בגודל 12 אינץ' למזרק ודחוף חומר הרדמה דרך הצינורות והמחט.
- הכנס את מחט הפרפר תוך-איטרא-איטרהוני, ואז תדביק את המחט במקומה.
הערה: כך ינוהל המשולבת הנוספת III במהלך ההדמיה כך שאין צורך להזיז את החיה או לשבש את מישור הראייה.
- ספק תמיכה תרמית עם כרית חימום שנשמרה ב 37°C לאורך כל ההליך. להדמיה ממושכת (>1 שעות) יהיה צורך בתמיכה נוספת בנוזלים. נוזלים משלימים ניתן לספק I.P. עם Combo III נוסף במהלך הדמיה או 33 מ"ל / קילוגרם מלוחים (0.9 NaCl) תת עורית.
- ריסון העכבר והכנת האתר הכירורגי
- השתמש קוצץ כדי להסיר שיער רב ככל האפשר מהחלק העליון של הראש. יש למרוח קרם דפילטורי על האזור המגולח כדי להסיר את כל השיער שנותר באתר הניתוח.
- ודא שהעכבר הוא מרדים לחלוטין על ידי חוסר תגובה צביטות בוהן. לאחר 15 דקות, אם העכבר אינו מרדים לחלוטין, לנהל מנה קטנה שנייה של משולב III (<0.75 מ"ל / קילוגרם BW).
- מניחים את העכבר בזנב האיפוק תחילה, מחליקים אותו מספיק אחורה כך שהאף תלוי מעט על קצה החרוט.
- הדביק את כפות הרגליים הקדמיות לתחתית הצינור החרוט באמצעות סרט רפואי.
- הניחו צינור חרוט עם עכבר על הרכב הדמיה המוגדר בזווית של 35° ומאובטח באמצעות המהדק בזווית ישרה (איור 1C).
- ברגע שהעכבר מאובטח בהר ההדמיה, נקה את האתר הכירורגי 3x עם סקראבס לסירוגין של קרצוף בטדין ו-70% אלכוהול איזופרופיל. שוב, בדוק שהחיה מסוממת לחלוטין.
- הזז את העכבר למשטח סופג נקי והצב וילון מעל העכבר כדי ליצור שדה סטרילי גדול.
4. הליך כירורגי
- פתיחה של חתכים
- בעזרת מלקחיים עדינים, יש לאסוף את העור מיד לאוזן ימין. עם מספריים מיקרו-חיתול, לחתוך את העור מוחזק על ידי המלקחיים.
הערה: ייזום ההסתעפות בשיטה המתוארת לעיל יוצר עיגול מעוגל המתאים יותר לתפירה לאחר ההליך. - בצע חתך רוחבי החל מהחתירה הראשונית לכיוון האוזן השמאלית (<1 ס"מ). לעשות חתך נוסף, החל מהחתירה הראשונית, לכיוון האף של החיה (~ 2-3 מ"מ מעבר לעין ימין).
- להפריד את העור מן periosteum באמצעות מלקחיים ומספריים לחתוך בעדינות דרך רקמת החיבור המפרידה את העור מן calvaria periosteum.
- באמצעות ספוגית כותנה סטרילית, להחיל משחה עיניים על החלק העליון של דש העור. הרימו בעדינות את דש העור וקיפלו אותו מעל העין השמאלית. ההצטלבות של התפרים הקשתים והקורונה צריכה להיחשף בבירור (איור 1E).
הערה: משחת עיניים משמשת כדי לשמור על דש העור במקום. - לשטוף את המשטח הפתוח עם PBS סטרילי כדי לנקות את האזור של כל דם ושיער שיורית.
הערה: במידת הצורך, יש להשתמש במלקחיים עדינים כדי להסיר שערות שנותרו לאחר שטיפה, אך היזהרו שלא לפגוע בפריוסטיום.
- בעזרת מלקחיים עדינים, יש לאסוף את העור מיד לאוזן ימין. עם מספריים מיקרו-חיתול, לחתוך את העור מוחזק על ידי המלקחיים.
- שבירה זעירה
- כדי ליצור שברים זעירים על calvaria, להסיר את הבוכנה של מזרק אינסולין 29 גרם לחתוך את הקצה האחורי של המזרק, סביב 300-400 סימני uL.
הערה: שלב זה מקל על התמרון תחת טווח ניתוח בעת הפקת הפציעה. - הניחו את קצה שיפוע (רוחב מחט אחד עד שניים) לכיוון האף מתפר הקורונה ורוחב מחט אחד עד שניים מימין לתפר הקשת (איור 1E).
- סובבו בעדינות את המזרק בכיוון השעון, ואז נגד כיוון השעון מספר פעמים.
הערה: בעכברים צעירים, יש צורך בכמות קטנה מאוד של לחץ כלפי מטה כדי ליצור שבר מיקרו מעגלי. היזהר לא לתת המחט לחדור למוח, כמו זה יגרום לדימום ולהפריע הדמיה. - השתמש במחט 27 G כדי להרחיב את המיקרו-שבר לכ-0.4 מ"מ. אם שברי העצם נשארים בשבר הזעיר, שטפו את האזור עם PBS. אם שברי העצם עדיין נשארים בשבר הזעיר, השתמשו במחט 29 גרם כדי לגרוף אותם בעדינות.
- חזור על שלבים 4.2.1–4.2.4 כדי ליצור פציעה בצד שמאל של התפר הסגיטלי.
הערה: בשלב זה, ישנן שתי אפשרויות: 1) המשך מיד לטיפול CCL5 (סעיף 4.3) והדמיה (סעיף 5); או 2) לסגור את האתר הכירורגי בעקבות הניתוחים שלאחר הניתוח בסעיף 6. בשעה 24 שעות מאוחר יותר, להרדים את העכבר שוב, לפתוח מחדש את המראה הכירורגי, לטפל בפציעה עם CCL5 (סעיף 4.3), ולבצע הדמיה תוך-וינטלית (סעיף 5) וטיפול לאחר הניתוח (סעיף 6).
- כדי ליצור שברים זעירים על calvaria, להסיר את הבוכנה של מזרק אינסולין 29 גרם לחתוך את הקצה האחורי של המזרק, סביב 300-400 סימני uL.
- טיפול CCL5
- מתוך מלאי של RANTES (100 ננוגרם / מ"ל), להפוך פתרון של 10 ננוגרם / מ"ל באמצעות מטריצת קרום המרתף (טבלת חומרים). שמור את הפתרון הזה על קרח כדי לשמור על המטריצה בצורה נוזלית.
- לטפל בכל פציעה עם 2 μL של CCL5 (10 ng/ μL) באמצעות 2-20 μL pipette (קצה פיפטה זה יש קוטר גדול יותר, וזה יעיל יותר בעת שימוש בנוזל צמיג). אפשר למטריצה להתגבש.
- לאחר המטריצה התגבשה, לכסות בעדינות את הקלבריה עם דש העור כדי להבטיח את הרקמה לא להתייבש. דגירה במשך שעה אחת לפני ההדמיה.
5. הדמיה תוך-ויאלית
- הגדרות מיקרוסקופ
- הפעל את הלייזר המולטי-פוטוני (לייזר טיטניום-ספיר פמטו-שניות). הגדר את אורך הגל ל- 880 ננומטר והתאם את העוצמה להדמיית הדור ההרמוני השני (SHG) (440 ננומטר) של העצם.
- הפעל את לייזרי מצב מוצק 488 ננומטר ו 561 ננומטר עבור עירור של תאים GFP- ו tdTomato מבטאים, בהתאמה.
- הפעל גלאי PMT (פוטומוליפלייר) עבור הדור ההרמוני השני (זיהוי 405-455 ננומטר) ו- GFP (זיהוי 505-550 ננומטר). הפעל את גלאי HyD 3 לעגבניות (זיהוי 590-620 ננומטר).
- הרכבה
- לפני העברת העכבר לטווח, בדוק את המישור החזותי של הקלבריה על-ידי לחיצה עדינה על החלק האחורי של ראש העכבר. אם המישור אינו מאוזן, התאם את המיקום על-ידי סיבוב עדין של ריסון העכבר שמאלה או ימינה.
הערה: זהו צעד קריטי כדי להבטיח איכות תמונה מספקת. - יש למרוח סטרילי 2% מתיל צלולוז במים (w/v) כדי לכסות את כל הקלבריה ואת דש העור ולמנוע ייבוש של הרקמה.
- מקם את העכבר על שלב המיקרוסקופ הממונע בציר XYZ (איור 1G). באמצעות האור האפיפלואורסצנטי, יישר את העכבר כך 1) הוא פונה למיקרוסקופ ו -2) הצומת של התפרים קורונליים וזרעיים היא נקודת ההתייחסות המרכזית של הבמה.
- הניחו את כיסוי הזכוכית באזור ההדמיה ובדקו שוב את היישור (איור 1H).
- לפני העברת העכבר לטווח, בדוק את המישור החזותי של הקלבריה על-ידי לחיצה עדינה על החלק האחורי של ראש העכבר. אם המישור אינו מאוזן, התאם את המיקום על-ידי סיבוב עדין של ריסון העכבר שמאלה או ימינה.
- הדמיה לשגות זמן
- השתמש בעדשת הגדלה נמוכה (יעד טבילת מים 25x עם NA = 0.95) כדי לסרוק את הקלבריה. רכשו תמונת התייחסות של צומת התפר הקשת והקורונל.
- בעזרת אותות SHG ופלואורסצנטיים מהתאים, אתר כל מראה פציעה ותיעד את קואורדינטות XYZ, כמו גם את המרחקים מהתפרים הקשים והקורונליים (איור 2B).
- בחר מיקום על התפרים קורונליים או קשתיים להדמיה ארוכת טווח. קח תמונת Z-stack מפורטת של אזור זה מההפניה במהלך ההדמיה.
הערה: מכיוון התפרים מייצגים נישה ידועה P-SSC, זה המקום שבו התאים יהיו נודדים בתגובה לפציעת calvaria. - השתמש בהגדרות התוכנה של זמן לשגות כדי להקליט תמונה כל דקה אחת לפחות שעה. בזמן שבין תמונות, השווה את שדה התצוגה הנוכחי לשדה התצוגה ההתחלתי. אם הם שונים, השתמש בתמונת מחסנית Z כדי לקבוע לאיזה כיוון יש להתאים את שדה הראייה.
6. טיפול בבעלי חיים לאחר הניתוח
- לאחר הדמיה, לשטוף את calvaria חשוף עם PBS סטרילי כדי להסיר את methylcellulose.
- כדי לסגור את ההסתעפות, מניחים בעדינות את דש העור מעל הקלבריה. השתמש דגימות כותנה סטריליות כדי להסיר משחה עיניים שיורית ולייבש את אתר ההסתה.
- באמצעות ניילון monofilament 5-0 גודל תפרים שאינם ניתנים לעריבה עם מחט חיתוך הפוך C-1 מחובר, לסגור את האתר הכירורגי. השתמש ספוגית כותנה סטרילית כדי להחיל משחה אנטיביוטית משולשת על הסגירה.
הערה: הצלקות מופחתות עם טכניקות תפירה באיכות גבוהה ודימום מינימלי. - מניחים את העכבר בכלוב נקי על משטח חם ולבדוק כל 15 דקות עד recumbency החזה מושגת.
- לתת מנה שנייה של בופרנורפין שחרור מתמשך 72 שעות לאחר הניתוח.
- יש לנטר מדי יום התנהגות מצטופפת, פרווה וולאנים ו/או חוסר אמביציה עד להסרת תפרים (כשבוע אחד).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
אבות השלד הוצעו להיות בעלי פוטנציאל נודד או במחזור הדם20. לאחרונה, Mx1-Cre +Rosa26-עגבניות +α SMA-GFP+ (Mx1/עגבניות/αSMA-GFP) נוצרו עכברים כתב, שבו P-SSCs מסומנים על ידי Mx1 + α SMA + תיוג כפול (איור 2A, B). העברה משמעותית של Mx1+α SMA+ P-SSCs התרחשה מתוך mesenchyme תפר בתוך 24-48 שעות לאחר פציעה11. נבדק גם האפשרות של זיהוי בנדידת P-SSC בזמן אמת 24 שעות לאחר פגם קלבריה. מעט מאוד העברה של Mx1+ αSMA+ P-SSCs נצפתה בתוך שעה אחד של הדמיה (איור 2C).
Mx1+α SMA+ P-SSCs מבטאים באופן ייחודי את קולטן CCL5 המכונה CCR511. לפיכך, טיפול בפגם קלבריה 24 שעות לאחר פציעה עם CCL5 המושרה נדידה ברורה בכיוון הרחק מהתפר קורונלי ולקראת מראה הפציעה (איור 2D, E). בתוך שעה אחת מההדמיה, אחד מ-Mx1+αSMA+ P-SSCs העביר כ-50 מיקרומטר לכיוון הפציעה (איור 2E). Mx1+αSMA+ P-SSCs אחרים נצפו גם נודדים בתגובה לטיפול CCL5 אך במידה פחותה.
איור 1: ערכו הדמיה של קלבריה של עכברים. תמונות מייצגות של ריסון העכבר (A) והרכבה להדמיה (B) המשמשות במהלך הדמיה חיה. (ג) עכבר באיפוק ומאובטח להרכבה הדמיה. (ד) ייצוג סכמטי של מבנה קלבריה עכבר, זיהוי הקדמי (FS), קורונל (CS), קשת (SS) ותפרים lambdoid (LS). (ה) מיקום מייצג של פציעות שבר מיקרו קלבריה. (ו) מיקום תפר כירורגי לאחר הניתוח לריפוי אופטימלי והדמיה עתידית. תמונות מייצגות של מיקום הרכבה בשלב מיקרוסקופ (G) ומיקום כיסוי (H). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: הדמיית ויוו בזמן אמת של העברת Mx1+αSMA+ P-SSC. (א) סכמטי של Mx1/ עגבניה / αSMA-GFP הכנה עכברים כפולים כתב. עכברים הוזרקו תוך-איטרה-פריתוני עם 25 מ"ג/ק"ג pIpC כל יומיים במשך 10 ימים (1). עכברי Mx1/Tomato/αSMA-GFP הוקרנו באופן קטלני עם 9.5 ג'י (2) יום אחד לפני ההשתלה תוך ורידי של 1 x 106 תאים מונונוקלאריים מלאים של מח עצם מעכברים WT C57BL/6 (3). לאחר 6-8 שבועות של החלמה (כאשר התאים ההמטואיטיים של המארח היו פחות מ-5%), עכברים עברו ניסויים בפגיעה בעצמות. Mx1+ (עגבניות+), αSMA+ (GFP+), Mx1+α SMA+ (עגבניות+GFP+) ועצמות (כחול). (ב) הקרנת Z מקסימלית של פגיעה ייצוגית בקלבריה (עיגול לבן) ומיקומים הדמיה (ריבוע לבן) ביחס לתפרים קשתיים (SS) ו- coronal (CS) של עכבר Mx1/ עגבניה / αSMA-GFP. קווים מנוקדים מייצגים תפרי קלבריה. (ג) הדמיית ויוו של תגובת Mx1+α SMA+ P-SSCs 24 שעות לאחר הפציעה. סרגל קנה מידה = 25 מיקרומטר. (D) 24 שעות לאחר פציעה, CCL5 ניתן למראה הפציעה, ובהדמיית vivo בוצעה שעה מאוחר יותר ביחס לתבל קורונל (CS). ריבוע לבן מייצג מיקום של תמונות העברת תאים המוצגות ב- (E). סרגל קנה מידה = 75 מיקרומטר. (ה) העברה של Mx1 + α SMA + P-SSCs על פני השטח העצם (הכחול) לכיוון מראה הפציעה (מימין למעלה). סרגל קנה מידה = 25 מיקרומטר. ב- (C,D,E), המספרים מציינים את זמן ההדמיה. החץ הצהוב מציין את כיוון מיקום הפציעה. כוכבית מציינת את נתיב הנדידה של Mx1+α SMA+ P-SSC. התמונה מייצגת תוצאות משלושה עד חמישה עכברים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במהלך ריפוי העצם, תאי periosteal הם המקור העיקרי של כונדרוציטים מובחנים חדשים אוסטאובלסטים בתוך יבלת פציעה3. בדומה מוח עצם, SSCs osteogenic / chondrogenic זוהו גם periosteum4,5,6. הערכת מאפיינים פונקציונליים P-SSC אנדוגני הוא מאתגר מבחינה טכנית. לעתים קרובות, דינמיקה נודדת של SSCs מוערכים במבחנה, מה שהופך את הפרשנות של מערכות vivo המקבילות שלהם מאתגר. בשל ההתקדמות האחרונה במיקרוסקופיה תוך-וינטלית של בעלי חיים חיים ויצירת עכברי כתבים נוספים (Mx1/Tomato/αSMA-GFP), מעקב ויוו של תאים בודדים אפשרי כעת. לכן, שיטה זו מאפשרת הקלטה in vivo של העברת P-SSCs המושרה CCL5 בזמן אמת.
ישנם מספר אתגרים טכניים הקשורים לשיטה זו שיכולים להשפיע על עקביות ההדמיה. אתגר טכני מרכזי בשיטה זו הוא שמירה על מישור הראייה של ציר Z. סחיפה ציר Z (Z-סחיפה) היא בעיה נפוצה בהדמיה ארוכת טווח של דגימות קבועות וחיות, והיא מיוחסת במידה רבה לשינויי טמפרטורה בסביבת ההדמיה. למרות חפץ זה לא ניתן לנטרל לחלוטין, מכסה את הבמה, עדשות אובייקטיביות, ומבנים תומכים מסייע להפחית Z-drift21.
יתר על כן, קבלת סדרת Z-stack של מיקום ההדמיה לפני הדמיה בזמן-לשגות תקבע התייחסות של ציר Z שניתן להתייחס אליו בין רכישות תמונה (כלומר, תמונות נלקחות בדרך כלל כל 30-60 s, מה שמאפשר זמן להתאמות לציר Z, במידת הצורך). אתגר טכני נוסף הוא ביצוע שבר מיקרו עקבי באותו גודל, צורה ומרחק מתפרים קלבריה. המרחק מהתפרים קורונליים וסגיטלים הוא קריטי, כי התפרים קלבריה הם נישה עבור SSCs10 quiescent. השיטה הטובה ביותר להפחית את השונות של שבר מיקרו היא לתרגל טכניקה זו בעכברים שאינם כלולים בניתוח הסופי.
למרות המגבלות, שיטה זו מספקת מערכת ייחודית להערכת תגובה תאית פרטנית ב- vivo לפגיעה בעצמות. מאז תיקון שבר הוא תהליכים מורכבים מאוד מעורבים סוגי תאים מרובים, ישנם מספר היבטים שאינם מובנים במלואם. אחד מהם כולל את התגובה הנודדת המוקדמת של P-SSCs לפציעה. בעוד CCR5 / CCL5 הוא מנגנון ייחודי שבאמצעותו P-SSCs מגויסים לפציעה, ייתכן כי ציטוקינים וגורמי גדילה נוספים ממלאים תפקיד חשוב בריפוי שברים. בעבר, הטיפול בשברים עם ציטוקינים וגורמי גדילה שונים הביא לתוצאות משתנות מאוד בריפוי שבר הכולל22. שיטת הדמיה זו מספקת פלטפורמה ייחודית כדי לקבוע את ההשפעות הפיזיולוגיות של תרופות פוטנציאליות / ציטוקינים / גורם גדילה טיפולים על תגובות תאיות בודדות. לבסוף, הוא מספק נתונים מכאניסטיים ויואו שיכולים לתמוך בשיפור של טיפול ספציפי של ריפוי שבר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
L.C.O. ו- D.P. לחשוף פטנט תלוי ועומד שכותרתו "תאי גזע שלד Periosteal בתיקון עצם" (BAYM. P0264US. פ1). המחברים הנותרים מצהירים שאין אינטרסים מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית מחלות העצמות של פרס טקסס, פרס קרן החוק קרוליין וויז, ואת NIAMS של המכונים הלאומיים לבריאות תחת מספרי פרס R01 AR072018, R21 AG064345, R01 CA221946 ל- D.P. אנו מודים ל- M.E. Dickinson ות.ג'יי וודאקאן בהדמיה אופטית BCM וליבת מיקרוסקופיה חיונית וליבות הטכנולוגיה המתקדמת BCM במימון NIH (AI036211, CA125123 ו- DK056338).
.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ½” optical post | ThorLabs | TR2 | For imaging mount |
| 1 mL syringe | BD | 309659 | |
| 27G needle | BD PercisionGlide | 305111 | |
| 29G insulin syringe | McKesson | 102-SN05C905P | |
| 50 mL conicol tube | Falcon | 352098 | For mouse restraint |
| Adjustable angle plate | Renishaw | R-PCA-5023-50-20 | For imaging mount |
| Alcohol wipes | Coviden | 6818 | |
| betadine surgical scrub | Henry Schen | 67618-151-16 | |
| Buprenorphine SR-LAB | ZooPharm | 1mg/mL Sustained Release | |
| Combo III | Obtained from staff veterinarian | N/A | 37.6 mg/mL Ketamine; 1.9 mg/mL Xylazine; 0.37 mg/mL Acepronazine |
| Coverslip | Fisher | 12-545-87 | 24 x 40 premium superslip |
| Fine tip forcepts | FST | 11254-20 | |
| Ketamine | KetaVed | 50989-161-06 | 100 mg/mL |
| Leica TCS SP8MP with DM6000CFS | Leica Microsystems | N/A | |
| Matrigel | R & D Systems | 344500101 | |
| Medical tape | McKesson | 100199 | 3" x 10 yds (7.6 cm x 9.1 m) |
| Methocellulose | Electron Microscopy Sciences | 19560 | |
| Microdissection scissors | FST | 1456-12 | |
| Motorized stage | Anaheim automation | N/A | |
| Needle holder | FST | 12500-12 | |
| Nonabsorbable sutures | McKesson | S913BX | monofilament nylon 5-0 nonabsorbable sutures with attached C-1 reverse cutting needle |
| Opthalmic ointment | Rugby | 0536-1086-91 | |
| RANTES | Biolegend | 594202 | 10 µg/50 µL |
| Right-angle clamp for ½” post, 3/16” Hex | ThorLabs | RA90 | For imaging mount |
| Spring-loaded 3/16” Hex-locking ¼” thumbscrew | ThorLabs | TS25H | For imaging mount |
| Sterile cotton swabs | Henry Schen | 100-9249 | |
| Sterile DPBS (1x) | Corning | 21-030-CV | |
| Sterile drapes | McKessen | 25-517 | |
| Surgical gloves | McKessen | 3158VA | |
| Triple antibiotic ointment | Taro Pharmaceuticals U.s.a., Inc. | 51672-2120-2 | |
| Vacutainer blood collection set | BD | REF 367298 | 25G butterfly needle infusion set with 12" tubing |
References
- Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: mechanisms and interventions. Nature Reviews Rheumatology. 11 (1), 45-54 (2015).
- Murao, H., Yamamoto, K., Matsuda, S., Akiyama, H. Periosteal cells are a major source of soft callus in bone fracture. Journal of Bone and Mineral Metabolism. 31 (4), 390-398 (2013).
- Colnot, C. Skeletal cell fate decisions within periosteum and bone marrow during bone regeneration. Journal of Bone and Mineral Research. 24 (2), 274-282 (2009).
- Roberts, S. J., van Gastel, N., Carmeliet, G., Luyten, F. P. Uncovering the periosteum for skeletal regeneration: the stem cell that lies beneath. Bone. 70, 10-18 (2015).
- Duchamp de Lageneste, O., et al. Periosteum contains skeletal stem cells with high bone regenerative potential controlled by Periostin. Nature Communications. 9 (1), 773 (2018).
- Olivos-Meza, A., et al. Pretreatment of periosteum with TGF-beta1 in situ enhances the quality of osteochondral tissue regenerated from transplanted periosteal grafts in adult rabbits. Osteoarthritis Cartilage. 18 (9), 1183-1191 (2010).
- Debnath, S., et al. Discovery of a periosteal stem cell mediating intramembranous bone formation. Nature. 562 (7725), 133-139 (2018).
- Ransom, R. C., et al. Axin2-expressing cells execute regeneration after skeletal injury. Scientific Reports. 6, 36524 (2016).
- Ouyang, Z., et al. Prx1 and 3.2kb Col1a1 promoters target distinct bone cell populations in transgenic mice. Bone. 58, 136-145 (2013).
- Wilk, K., et al. Postnatal Calvarial Skeletal Stem Cells Expressing PRX1 Reside Exclusively in the Calvarial Sutures and Are Required for Bone Regeneration. Stem Cell Reports. 8 (4), 933-946 (2017).
- Ortinau, L. C., et al. Identification of Functionally Distinct Mx1+alphaSMA+ Periosteal Skeletal Stem Cells. Cell Stem Cell. 25 (6), 784-796 (2019).
- Deveza, L., Ortinau, L., Lei, K., Park, D. Comparative analysis of gene expression identifies distinct molecular signatures of bone marrow- and periosteal-skeletal stem/progenitor cells. PLoS One. 13 (1), 0190909 (2018).
- Schindeler, A., McDonald, M. M., Bokko, P., Little, D. G. Bone remodeling during fracture repair: The cellular picture. Seminars in Cell and Developmental Biology. 19 (5), 459-466 (2008).
- Shi, Y., et al. Gli1 identifies osteogenic progenitors for bone formation and fracture repair. Cell Stem Cell. 15 (2), 782-796 (2017).
- Zhou, B. O., Yue, R., Murphy, M. M., Peyer, J. G., Morrison, S. J. Leptin-receptor-expressing mesenchymal stromal cells represent the main source of bone formed by adult bone marrow. Cell Stem Cell. 15 (2), 154-168 (2014).
- Grcevic, D., et al. In vivo fate mapping identifies mesenchymal progenitor cells. Stem Cells. 30 (2), 187-196 (2012).
- Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K. Inducible gene targeting in mice. Science. 269 (5229), 1427-1429 (1995).
- Srinivas, S., et al. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Developmental Biology. 1, 4 (2001).
- Park, D., et al. Endogenous bone marrow MSCs are dynamic, fate-restricted participants in bone maintenance and regeneration. Cell Stem Cell. 10 (3), 259-272 (2012).
- Nitzsche, F., et al. Concise Review: MSC Adhesion Cascade-Insights into Homing and Transendothelial Migration. Stem Cells. 35 (6), 1446-1460 (2017).
- Adler, J., Pagakis, S. N. Reducing image distortions due to temperature-related microscope stage drift. Journal of Microscopy. 210, Pt 2 131-137 (2003).
- Roberts, S. J., Ke, H. Z. Anabolic Strategies to Augment Bone Fracture Healing. Current Osteoporosis Reports. 16 (3), 289-298 (2018).
