Summary
Bu protokol, canlı hayvan intravital mikroskopisi kullanılarak CCL5 aracılı periosteal iskelet kök hücre göçünün gerçek zamanlı olarak saptanmasıdır.
Abstract
Periosteal iskelet kök hücreleri (P-SSC' ler) ömür boyu kemik bakımı ve onarımı için gereklidir, bu da onları kırık iyileşmesini artırmak için tedavilerin geliştirilmesi için ideal bir odak noktası haline getirir. Periosteal hücreler, kırık iyileşmesi için yeni kondrositler ve osteoblastlar sağlamak için hızla bir yaralanmaya göç eder. Geleneksel olarak, bir sitokinin hücre göçünü teşvik etme etkinliği sadece transwell veya scratch tahlil yapılarak in vitro olarak gerçeklenmiştir. Multifotoni ekscitasyonu kullanılarak intravital mikroskopideki gelişmelerle, yakın zamanda 1) P-SSC'lerin göçmen geni CCR5 ve 2) CCL5 olarak bilinen CCR5 ligand ile tedavinin kırık iyileşmesini ve CCL5'e yanıt olarak P-SSC'lerin göçini iyileştirdiği keşfedilmiştir. Bu sonuçlar gerçek zamanlı olarak yakalandı. Burada açıklanan, CCL5 ile tedavi edildikten sonra kalvarial dikiş iskelet kök hücresi (SSC) nişinden yaralanmaya doğru P-SSC geçişini görselleştirmek için bir protokoldür. Protokol, bir fare kısıtlaması ve görüntüleme montajının yapımını, fare kalvarisinin cerrahi olarak hazırlanmasını, bir calvaria kusurunun indüksiyonunu ve zaman atlamalı görüntülemenin kazanılmasını detaylandırıyor.
Introduction
Kırık onarımı embriyonik iskelet gelişimi ve tadilattan farklı dinamik, çok hücreli bir süreçtir. Bu süreçte, hasarlı dokudan gelen yaralanma sinyallerinin indüksiyonunu, kırıkların genel stabilitesi ve sabitlenmesi için kritik öneme sahip olan iskelet sapı/progenitör hücrelerinin hızlı bir şekilde işe alınması, çoğalması ve daha sonra farklılaşması takip eder1. Özellikle, kırık iyileşmesinin erken aşamaları, esas olarak periosteal yerleşik hücrelere atfedilen yumuşak nasır oluşumunu gerektirir2. Kemikler yaralandığında, periosteal hücrelerin bir alt kümesi hızla yanıt verir ve callus3 içindeki yeni farklılaşan kıkırdak aralarına ve osteoblastlara katkıda bulunur ve periosteum içinde belirgin bir iskelet sapı / progenitör hücre popülasyonunun varlığını bu işe bular. Bu nedenle periosteumda yerleşik iskelet kök hücrelerinin (SSC) tanımlanması ve fonksiyonel karakterizasyonu dejeneratif kemik hastalıkları ve kemik defektleri için umut verici bir terapötik yaklaşım oluşturmaktadır4.
SSC'lerin kemik iliği de dahil olmak üzere birden fazla doku bölgesinde bulunduğu düşünülmektedir. Kemik iliğine benzer şekilde periosteum4,5,6'da osteojenik/kondrojenik SSC'ler de tanımlanmıştır. Bu periosteal SSC'ler (P-SSC'ler) fetal kemik gelişimi sırasında erken mezenkimal soy belirteçleri (örneğin Prx1-Cre5, Ctsk-Cre7 ve Axin2-CreER8) ile etiketlenebilir4,7,8,9,10. Bu tek genetik soy izleme modellerinin önemli bir sınırlaması, etiketli hücre popülasyonlarında önemli bir heterojenlik olmasıdır. Ayrıca, etiketli SSC'leri progeny in vivo'larından ayırt edemezler. Bu sınırlamayı gidermek için, yakın zamanda kemik iliği SSC'lerinden (BM-SSC'ler)11'den P-SSC'leri belirgin bir şekilde görselleştirmek için çift muhabir fare (Mx1-Cre +Rosa26-Tomato+α SMA-GFP+) geliştirdik. Bu model ile P-SSC'lerin Mx1+αSMA+ çift etiketleme ile işaretlendiği, daha farklılaştırılmış Mx1+ hücrelerinin ise kemik iliği, endosteal ve periosteal yüzeyler ile kortikal ve trabeküler kemiklerde bulunduğu tespit edilmiştir11,12.
Çoklu sitokinler ve büyüme faktörlerinin kemik tadilatını ve onarımını düzenlediği bilinmektedir ve kritik segment kusurlarında iskelet onarımının arttırıcısı için test edilmiştir1,13. Bununla birlikte, kemik bölmesinin fiziksel bariyerinin bozulmasıyla ortaya çıkan yaralanma modellerinin hücresel karmaşıklığı nedeniyle, bu moleküllerin endojen P-SSC göçü ve iyileşme sırasında aktivasyon üzerindeki doğrudan etkileri belirsizdir. SSC'lerin fonksiyonel özellikleri ve göçmen dinamikleri genellikle diğer hücre popülasyonlarında göçü teşvik ettiği bilinen sitokinler veya büyüme faktörleri ile birlikte bir transwell veya scratch tahlil yapılarak in vitro olarak değerlendirilir. Bu nedenle, bu in vitro deneylerden elde edilen sonuçların ilgili in vivo sistemlerinde uygulanması için yorumlanması zordur. Şu anda, iskelet sapı / progenitör hücre göçünün in vivo değerlendirmesi tipik olarak gerçek zamanlı olarak gözlenmez; aksine, kırık sonrası sabit zaman noktalarında ölçülür5,7,14,15,16.
Bu yöntemin bir sınırlaması, geçişin tek hücre düzeyinde değerlendirilmemesidir; bunun yerine, hücre popülasyonlarındaki değişikliklerle ölçülür. Canlı hayvan intravital mikroskopislerindeki son gelişmeler ve ek muhabir farelerin üretimi nedeniyle, bireysel hücrelerin in vivo takibi artık mümkündür. Canlı hayvan intravital mikroskopisi kullanarak, Mx1/Tomato/αSMA-GFP farelerinde 24-48 saat yaralanma sonrası kemik hasarında P-SSC'lerin kalvaria dikiş nişinden kemik yaralanmasına belirgin göçünü gözlemledik.
CCL5/CCR5 yakın zamanda erken yaralanma yanıtı sırasında işe alım ve aktivasyon P-SSC'lerini etkileyen düzenleyici bir mekanizma olarak tanımlandı. İlginçtir ki, gerçek zamanlı olarak bir yaralanmaya yanıt olarak önemli bir P-SSC göçü tespit edilmemiştir. Bununla birlikte, CCL5 ile bir yaralanmanın tedavisi, gerçek zamanlı olarak yakalanabilen sağlam, yönlü olarak farklı bir P-SSC göçü üretir. Bu nedenle, bu protokolün amacı, CCL5 ile tedaviden sonra P-SSC'lerin in vivo geçişini gerçek zamanlı olarak kaydetmek için ayrıntılı bir metodoloji sağlamaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm fareler patojen içermeyen koşullarda muhafaza edildi ve tüm prosedürler Baylor College of Medicine'ın Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı.
1. Fare hazırlığı
- Cross Mx1-Cre17 ve Rosa26-loxP-stop-loxP-tdTomato (Tom)18 fare (Jackson Laboratuvarı'ndan satın alındı) αSMA-GFP fareleri ile (burada Drs tarafından sağlanmıştır). Ivo Kalajzic ve Henry Kronenberg) Mx1-Cre+Rosa26-Tomato+α SMA-GFP+ (Mx1/Tomato/αSMA-GFP) muhabir fareleri üretmek için (Şekil 2A).
- Mx1-Cre indüksiyonu için, farelere 10 gün boyunca her gün 25 mg / kg pIpC enjekte edin.
- Vahşi tip C57BL/6 farelerden (WT-BMT)19'dan 1 x 106 bütün kemik iliği mononükleer hücrelerinin intravenöz naklinden 1 gün önce 9,5 Gy ile fareleri ışınlayın.
- 6 ila 8 haftalık iyileşmeden sonra, fareleri aşağıda açıklanan periosteal hücre göç protokolünün in vivo görüntülemesine tabi edin.
NOT: Mx1-Cre farelerinin ışınlanması ve WT-BMT, bir yaralanmaya yanıt verebilen endojen Mx1 etiketli hematopoetik hücreleri ortadan kaldırmak için gereklidir. Işınlama sonrası altı ila sekiz hafta, konağın hematopoetik hücre sayısı% <5'tedir ve böylece görüntülemeye hazırdır19.
2. Fare tutma ve görüntüleme montajı
- 50 mL konik tüp ile bir fare kısıtlaması oluşturun (Şekil 1A).
- Sivri makas kullanarak konikin dibinden bir delik açın. Alt delikten konilerin üstüne kesin (kesilen taraf kısıtlamanın üst kısmı olacaktır).
- Önceki kesime paralel olarak yaklaşık 4-5 cm uzunluğunda ve kısıtlamanın üstünden yarıya kadar (~2 cm) bir kesim yapın. Konik bu bölümü çıkarın ve kenarları pürüzsüzleştirin gerekliydi.
- Ayarlanabilir bir açı plakası, 0,5" optik direk ve 0,5" post, 0,1875" Hex (Şekil 1B ve Malzeme Masası) için dik açılı bir kelepçe kullanarak konik bir tüp görüntüleme montajı oluşturun.
- Açı plakasını 35° açıya ayarlayın. Açı plakasının sol tarafında, optik direği plakanın arkasından ikinci deliğe vidalayın.
- Ayarlanabilir plakanın sağ tarafına, yaylı 0,1875" Hex kilitlemeli 0,25" başparmak vidasını önden ikinci deliğe ve plakadaki son deliklere yerleştirin. Dik açılı kelepçe, konik fare kısıtlamasını yerinde sabitlemek için optik direkle birlikte kullanılacaktır.
3. Ameliyat öncesi cerrahi prosedür
- Fare anestezisi
- Ağrı yönetimi için, deri altından fareye ameliyattan 30-60 dakika önce sürekli salınımlı buprenorfin (1 mg / kg BW) enjekte edin.
- 37.5 mg/mL ketamin, 1.9 mg/mL ksil ile 0.37 mg/mL asepromazin içeren kemirgen III CCM kombinasyonu (combo III) anestezi kullanarak fareleri uyuşturmak. Fareler için uygun dozaj, 1 kg vücut ağırlığı başına 0,75-1,50 mL'dir. Doz 30-45 dakika sürecektir.
- Fare uyuşturuldıktan sonra, göz dehidrasyonunu önlemek için steril bir pamuklu çubukla gözlere oftalmik merhem uygulayın.
- Uzun süreli görüntüleme için (>45 dk), uygun anestezi derinliğini korumak için anesteziyi tekrar uygulayarak aşağıdaki gibi uygulayabilirsiniz.
- Planlanan görüntüleme süresi boyunca anesteziyi korumak için yeterli miktarda kombo III ile 1 mL şırıngın hazırlayın (30 dakikalık ek sedasyon başına 0,75 mL/kg BW). Şırıngaya 12" tüplü 25 G kelebek iğne infüzyon seti takın ve anesteziyi boru ve iğneden geçirin.
- Kelebek iğnesini intraperitoneally yerleştirin, sonra iğneyi yerine bantleyin.
NOT: Ek kombo III görüntüleme sırasında bu şekilde uygulanacaktır, böylece hayvanı hareket ettirmeye veya görüş düzlemini bozmaya gerek yoktur.
- İşlem boyunca 37°C'de tutulan bir ısıtma yastığı ile termal destek sağlayın. Uzun süreli görüntüleme için (>1 saat) ek sıvı desteği gerekecektir. Ek sıvılar I.P.'ye görüntüleme sırasında ek Combo III veya deri altından 33 mL/kg salin (0.9 NaCl) sağlanabilir.
- Fare kısıtlaması ve cerrahi bölgenin hazırlanması
- Başın üstünden mümkün olduğunca fazla saç çıkarmak için makas kullanın. Ameliyat bölgesinde kalan saçları çıkarmak için tıraş edilen bölgeye epilatör krem uygulayın.
- Farenin parmak sıkışmalarına yanıt vermeyerek tamamen uyuşturulmasını sağlayın. 15 dakika sonra, fare tam olarak uyuşturulmazsa, ikinci bir daha küçük kombo III dozu (<0.75 mL / kg BW) kullanın.
- Fareyi önce kısıtlama kuyruğuna yerleştirin, burnun konik kenarına hafifçe sarkacak şekilde yeterince geriye doğru kaydırarak yerleştirin.
- Tıbbi bant kullanarak ön pençeleri konik tüpün altına bantleyin.
- Konik tüpü fare ile 35° açıyla ayarlanmış ve dik açılı kelepçe kullanılarak sabit bir görüntüleme yuvasına yerleştirin (Şekil 1C).
- Fare görüntüleme yuvasında güvenli hale geldikten sonra, cerrahi bölgeyi betadin ovma ve% 70 izopropil alkolün alternatif önlükleriyle 3x temizleyin. Yine, hayvanın tamamen sakinleştirilerek uyuşturuldığını kontrol edin.
- Fareyi temiz bir emici ped için hareket ettirin ve büyük bir steril alan oluşturmak için farenin üzerine bir örtü yerleştirin.
4. Cerrahi prosedür
- Açma kesiği
- İnce uçlu tokmaklar kullanarak, cildi hemen sağ kulağa medial alın. Mikrodiseksiyon makası ile, kümesler tarafından tutulan cildi kesin.
NOT: Yukarıda açıklanan yöntem kullanılarak kesiğin başlatılması, işlemden sonra dikiş için daha uygun yuvarlak bir kesi oluşturur. - sol kulağa doğru ilk kesiden başlayarak enine bir kesi yapın (<1 cm). İlk kesiden başlayarak hayvanın burnuna doğru başka bir kesi yapın (sağ gözün yanından ~ 2-3 mm).
- Cildi periosteumdan ayıran bağ dokusunu nazikçe kesmek için önseçimleri ve makası kullanarak cildi periosteumdan ayırın.
- Steril bir pamuklu çubuk kullanarak, cilt kapağının üstüne biraz oftalmik merhem uygulayın. Deri kapağını yavaşça alın ve sol gözün üzerine katlayın. Sagittal ve koronal dikişlerin kesişimi açıkça ortaya açılmalıdır (Şekil 1E).
NOT: Oftalmik merhem cilt kapağını yerinde tutmak için kullanılır. - Herhangi bir kan ve artık saç alanını temizlemek için açık yüzeyi steril PBS ile yıkayın.
NOT: Gerekirse, kızardıktan sonra kalan tüyleri çıkarmak için ince uçlu tokalar kullanın, ancak periosteuma zarar vermemeye dikkat edin.
- İnce uçlu tokmaklar kullanarak, cildi hemen sağ kulağa medial alın. Mikrodiseksiyon makası ile, kümesler tarafından tutulan cildi kesin.
- Mikro çatlak
- Calvaria üzerinde mikro çatlaklar oluşturmak için, 29 G insülin şırıngasının pistonunun pistonunun çıkarılmasının ve şırınganın arka ucunun 300-400 uL işareti civarında kesilmesi.
NOT: Bu adım, yaralanmayı üretirken diseksiyon kapsamı altında manevra yapmayı kolaylaştırır. - Bir eğimin ucunu (bir ila iki iğne genişliği) koronal dikişten buruna doğru ve sagittal sütür sağ kısmına bir ila iki iğne genişliği yerleştirin (Şekil 1E).
- Şırıngarı saat yönünde hafifçe döndürün, sonra saat yönünün tersine birkaç kez döndürün.
NOT: Genç farelerde, dairesel bir mikro çatlak oluşturmak için çok az miktarda aşağı doğru basınca ihtiyaç vardır. Kanamaya neden olacağı ve görüntülemeye müdahale edeceği için iğnenin beyne nüfuz etmesine izin vermemeye dikkat edin. - Mikro çatlak ~0,4 mm'ye genişletmek için 27 G'lık bir iğne kullanın. Kemik parçaları mikro çatlakta kalırsa, bölgeyi PBS ile yıkayın. Kemik parçaları hala mikro çatlakta kalırsa, 29 G iğnesini kullanarak hafifçe dışarı çıkarabilirsiniz.
- Sagittal dikişin sol tarafında bir yaralanma oluşturmak için 4.2.1–4.2.4 adımlarını tekrarlayın.
NOT: Bu noktada iki seçenek vardır: 1) derhal CCL5 tedavisine (bölüm 4.3) ve görüntülemeye (bölüm 5) geçin; veya 2) bölüm 6'daki ameliyat sonrası işlemleri takiben cerrahi bölgeyi kapatın. 24 saat sonra fareyi tekrar uyuşturun, cerrahi görüşü yeniden açın, yaralanmayı CCL5 (bölüm 4.3) ile tedavi edin ve intravital görüntüleme (bölüm 5) ve ameliyat sonrası bakım (bölüm 6) gerçekleştirin.
- Calvaria üzerinde mikro çatlaklar oluşturmak için, 29 G insülin şırıngasının pistonunun pistonunun çıkarılmasının ve şırınganın arka ucunun 300-400 uL işareti civarında kesilmesi.
- CCL5 tedavisi
- RANTES (100 ng/mL) stoğundan, bodrum membran matrisi (Malzeme Masası) kullanarak 10 ng/mL'lik bir çözüm yapın. Matrisi sıvı halde tutmak için bu çözeltiyi buzda tutun.
- Her yaralanmayı 2-20 μL pipet kullanarak 2 μL CCL5 (10 ng/μL) ile tedavi edin (bu pipet ucu viskoz bir sıvı kullanırken daha etkili olan daha büyük bir çapa sahiptir). Matrisin katılaşmasına izin verin.
- Matris katılaştıktan sonra, dokunun susuz kalmamasını sağlamak için calvaria'yı deri kapağı ile hafifçe örtün. Görüntülemeden önce 1 saat kuluçkaya yatırın.
5. İntravital görüntüleme
- Mikroskop ayarları
- Çoktoğraf lazeri açın (femtosaniye titanyum-safir lazer). Dalga boyunun 880 nm olarak ayarlanması ve kemiğin ikinci harmonik nesil (SHG) görüntüleme (440 nm) için gücü ayarlayın.
- GFP ve tdTomato ifade hücrelerinin çıkarılması için sırasıyla 488 nm ve 561 nm katı hal lazerlerini açın.
- İkinci harmonik üretim (405–455 nm algılama) ve GFP (505–550 nm algılama) sinyalleri için PMT (fotomultiplier tüp) dedektörlerini açın. Domates (590–620 nm algılama) sinyali için HyD 3 dedektörünü açın.
- Montaj
- Fareyi dürbüne taşımadan önce, farenin başının arkasına hafifçe basarak calvaria'nın görsel düzlemini kontrol edin. Düzlem düzlem değilse, fare kısıtlamasını yavaşça sola veya sağa döndürerek konumu ayarlayın.
NOT: Bu, yeterli görüntü kalitesini sağlamak için kritik bir adımdır. - Tüm kalvaria ve cilt kapağını örtmek ve dokunun kurumasını önlemek için suya (w/v) steril% 2 metilselüloz uygulayın.
- Fareyi XYZ eksenli motorlu mikroskop aşamasına yerleştirin (Şekil 1G). Epifluoresan ışığı kullanarak, fareyi 1) mikroskop ve 2) koronal ve sagittal dikişlerin kesişimi sahnenin ortalanmış referans noktası olacak şekilde hizalayın.
- Cam kapağı görüntüleme alanına yerleştirin ve hizalamayı iki kez kontrol edin (Şekil 1H).
- Fareyi dürbüne taşımadan önce, farenin başının arkasına hafifçe basarak calvaria'nın görsel düzlemini kontrol edin. Düzlem düzlem değilse, fare kısıtlamasını yavaşça sola veya sağa döndürerek konumu ayarlayın.
- Hızlandırılmış görüntüleme
- Calvaria'yı taramak için düşük büyütme lensi (NA = 0,95 ile 25x su daldırma hedefi) kullanın. Sagittal ve koronal dikiş kesişiminin referans görüntüsünü alın.
- Hücrelerden gelen SHG ve floresan sinyallerini kullanarak, her yaralanma görüşünü bulun ve XYZ koordinatlarının yanı sıra sagittal ve koronal dikişlerden uzaklıkları kaydedin (Şekil 2B).
- Uzun süreli görüntüleme için koronal veya sagittal dikişlerde bir konum seçin. Görüntüleme sırasında referanstan bu alanın ayrıntılı bir Z yığını görüntüsünü alın.
NOT: Dikişler bilinen bir P-SSC nişini temsil ettiği için, hücrelerin calvaria yaralanmasına yanıt olarak göç edeceği yer burasıdır. - En az 1 saat boyunca her 1 dakikada bir görüntü kaydetmek için zaman atlamalı yazılım ayarlarını kullanın. Anlık görüntüler arasındaki süre içinde, geçerli görünüm alanını ilk görüş alanıyla karşılaştırın. Farklılarsa, görüş alanının hangi yönde ayarlanması gerektiğini belirlemek için Z yığını görüntüsünü kullanın.
6. Ameliyat sonrası hayvan bakımı
- Görüntülemeden sonra, metilselülozu çıkarmak için maruz kalan calvaria'yı steril PBS ile durulayın.
- Kesiği kapatmak için, cilt kapağını calvaria üzerine hafifçe yerleştirin. Artık oftalmik merhemleri çıkarmak ve kesi bölgesini kurutmak için steril pamuklu çubuklar kullanın.
- Bağlı bir C-1 ters kesme iğnesi ile monofilament naylon 5-0 boyutlu nonabsorbable dikişler kullanarak cerrahi bölgeyi kapatın. Kapalı kesiye üçlü antibiyotik merhem uygulamak için steril bir pamuklu çubuk kullanın.
NOT: Yüksek kaliteli dikiş teknikleri ve minimum kanama ile yara izi azalır. - Fareyi sıcak bir yüzeyde temiz bir kafese yerleştirin ve sternal reumbency elde edilene kadar her 15 dakikada bir kontrol edin.
- Ameliyat sonrası 72 saat sürekli salınımlı buprenorfin ikinci bir doz uygulamak.
- Dikişler çıkarılana kadar (~1 hafta) huddling davranışı, fırfırlı kürk ve/veya ambülasyon eksikliği için günlük olarak izleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
İskelet atalarının göçmen veya dolaşım potansiyeline sahip olduğu önerilmiştir20. Son zamanlarda, Mx1-Cre +Rosa26-Tomato+α SMA-GFP+ (Mx1/Tomato/αSMA-GFP) muhabir fareleri üretildi ve P-SSC'ler Mx1+α SMA+ çift etiketleme ile işaretlendi (Şekil 2A,B). Mx1+α SMA+ P-SSC'lerin önemli göçü 24-48 saat yaralanma sonrası 24-48 saat içinde dikiş mezenkiminin dışında meydana geldi11. Ayrıca bir calvaria kusuru sonra gerçek zamanlı 24 saat içinde in vivo P-SSC göç tespit olasılığı oldu. Görüntülemenin 1 saat içinde Mx1+αSMA+ P-SSC'lerin çok az veya hiç geçişi gözlendi (Şekil 2C).
Mx1+α SMA+ P-SSC'ler CCR511 olarak bilinen CCL5 reseptörü benzersiz bir şekilde ifade eder. Bu nedenle, bir calvaria defektinin tedavisi 24 saat sonra CCL5 indüklenen yönlü belirgin göç ile koronal dikişten uzaklaşıp yaralanma görüşüne doğru (Şekil 2D, E). Görüntülemeden 1 saat sonra, Mx1+αSMA+ P-SSC'lerden biri yaralanmaya doğru yaklaşık 50 μm göç etti (Şekil 2E). Diğer Mx1+αSMA+ P-SSC'lerin de CCL5 tedavisine yanıt olarak ancak daha az ölçüde göç ettiği gözlendi.
Şekil 1: Fare calvaria in vivo görüntüleme için kurulum. Canlı görüntüleme sırasında kullanılan fare kısıtlaması (A) ve görüntüleme yuvasının (B) temsili görüntüleri. (C) Fareyi emniyete alın ve görüntüleme yuvasına sabitlenin. (D) Fare calvaria yapısının şematik gösterimi, frontal (FS), koronal (CS), sagittal (SS) ve lambdoid (LS) dikişlerini tanımlar. (E) Calvaria mikro çatlak yaralanmalarının temsili yerleşimi. (F) Optimal iyileşme ve ileride görüntüleme için ameliyat sonrası cerrahi dikiş yerleşimi. Mikroskop aşamasında (G) ve coverlip yerleşiminde (H) montaj yerleşiminin temsili görüntüleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Mx1+αSMA+ P-SSC geçişinin gerçek zamanlı in vivo görüntülemesi. (A) Mx1/Tomato/αSMA-GFP çift muhabir farelerinin hazırlanması şeması. Farelere 10 gün boyunca her gün 25 mg/kg pIpC ile intraperitoneally enjekte edildi (1). Mx1/Tomato/αSMA-GFP fareleri, WT C57BL/6 farelerden 1 x 106 bütün kemik iliği mononükleer hücrelerinin intravenöz naklinden 1 gün önce 9,5 Gy (2) ile ölümcül bir şekilde ışınlandı (3). 6-8 haftalık iyileşmeden sonra (konağın hematopoetik hücreleri% 5'ten az olduğunda), fareler kemik yaralanması deneylerine maruz kaldı. Mx1+ (Domates+), αSMA+ (GFP+), Mx1+α SMA+ (Domates+GFP+) ve kemik (mavi). (B) Mx1/Tomato/αSMA-GFP faresinin sagittal (SS) ve koronal (CS) dikişleri ile ilgili olarak temsili bir calvaria yaralanması (beyaz daire) ve görüntüleme (beyaz kare) konumlarının maksimum Z-projeksiyonu. Noktalı çizgiler calvaria dikişlerini temsil eder. (C) Mx1+α SMA+ P-SSC yanıtının in vivo görüntülemesi yaralanma sonrası 24 saat. Ölçek çubuğu = 25 μm. (D) Yaralanma sonrası 24 saat, yaralanma görmede CCL5 uygulandı ve in vivo görüntüleme 1 saat sonra koronal dikiş (CS) ile ilgili olarak yapıldı. Beyaz kare, (E) olarak gösterilen hücre geçiş görüntülerinin konumunu temsil eder. Ölçek çubuğu = 75 μm. (E) Kemik (mavi) yüzeyindeki Mx1+α SMA+ P-SSC'lerin yaralanma görüşüne (sağ üst) doğru geçişi. Ölçek çubuğu = 25 μm. (C,D,E)'de, sayılar görüntüleme zamanını gösterir. Sarı ok yaralanma yerinin yönünü gösterir. Yıldız işareti, Mx1+α SMA+ P-SSC'nin göçmen yolunu gösterir. Görüntü, üç ila beş fareden elde edilen sonuçları temsil ediyor. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kemik iyileşmesi sırasında periosteal hücreler, bir yaralanma callusu içinde yeni farklılaşmış kondrositlerin ve osteoblastların ana kaynağıdır3. Kemik iliğine benzer şekilde periosteum4,5,6'da osteojenik/kondrojenik SSC'ler de tanımlanmıştır. Endojen P-SSC fonksiyonel özelliklerini değerlendirmek teknik olarak zordur. Genellikle, SSC'lerin göçmen dinamikleri in vitro olarak değerlendirilir ve karşılık gelen in vivo sistemlerinin yorumlanmasını zorlaştırır. Canlı hayvan intravital mikroskopislerindeki son gelişmeler ve ek muhabir farelerin (Mx1/Tomato/αSMA-GFP) üretimi nedeniyle, bireysel hücrelerin in vivo takibi artık mümkündür. Böylece, bu yöntem CCL5 kaynaklı P-SSC'lerin gerçek zamanlı olarak in vivo kaydedilini sağlar.
Bu yöntemle ilişkili görüntüleme tutarlılığını etkileyebilecek birkaç teknik zorluk vardır. Bu yöntemle ilgili önemli bir teknik zorluk, Z ekseni görüş düzlemini korumaktır. Z ekseni kayması (Z-drift), sabit ve canlı örneklerin uzun süreli görüntülenmesinde yaygın bir konudur ve büyük ölçüde görüntüleme ortamındaki sıcaklık değişikliklerine atfedilir. Bu yapı tamamen karşı koyamasa da, sahneyi, objektif lensleri ve destekleyici yapıları kaplamak Z-drift21'i azaltmaya yardımcı olur.
Ayrıca, zaman atlamalı görüntülemeden önce görüntüleme konumunun Z yığını serisini elde etmek, görüntü alımları arasında başvurulabilecek Z ekseninin bir referansını oluşturacaktır (yani, görüntüler genellikle her 30-60 s'de bir alınır, bu da gerekirse Z ekseninde ayarlamalar için zaman sağlar). Bir diğer teknik zorluk da calvaria dikişlerinden aynı boyut, şekil ve mesafede tutarlı bir mikro çatlak yapmaktır. Koronal ve sagittal dikişlerden uzaklık kritiktir, çünkü calvaria dikişleri sessiz SSC'ler için bir niştir10. Mikro çatlak değişkenliğini azaltmak için en iyi yöntem, bu tekniği son analize dahil olmayan farelerde uygulamaktır.
Sınırlamalara rağmen, bu yöntem bir kemik hasarına in vivo bireysel hücresel yanıtı değerlendirmek için benzersiz bir sistem sağlar. Kırık onarımı birden fazla hücre tipini içeren son derece karmaşık bir süreç olduğundan, tam olarak anlaşılamayan birkaç yön vardır. Bunlardan biri, P-SSC'lerin bir yaralanmaya karşı erken göçmen tepkisini içerir. CCR5/CCL5, P-SSC'lerin bir yaralanmaya alındığı benzersiz bir mekanizma olsa da, ek sitokinlerin ve büyüme faktörlerinin kırık iyileşmesinde önemli bir rol oynaması mümkündür. Daha önce, çeşitli sitokinler ve büyüme faktörleri ile kırıkların tedavisi, genel kırık iyileşmesinde oldukça değişken sonuçlarla sonuçlanmıştır22. Bu görüntüleme yöntemi, potansiyel ilaç/sitokin/büyüme faktörü tedavilerinin bireysel hücresel yanıtlar üzerindeki fizyolojik etkilerini belirlemek için benzersiz bir platform sağlar. Son olarak, belirli bir tedavinin kırık iyileşmesini artırıcısını destekleyebilecek in vivo mekanistik veriler sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
L.C.O. ve D.P., "Kemik Onarımında Periosteal İskelet Kök Hücreleri" (BAYM) başlıklı bekleyen bir patenti açıkladılar. P0264US. P1). Geri kalan yazarlar rakip çıkar beyan etmemektedir.
Acknowledgments
Bu çalışma Teksas Kemik Hastalıkları Programı Ödülü, Caroline Wiess Hukuk Fonu Ödülü ve Ulusal Sağlık Enstitüleri NIAMS tarafından R01 AR072018, R21 AG064345, R01 CA221946 to D.P. BCM Optik Görüntüleme ve Vital Mikroskopi Çekirdeği'ndeki M.E. Dickinson ve T.J. Vadakkan'a ve NIH (AI036211, CA125123 ve DK056338) fonlarıyla BCM İleri Teknoloji Çekirdeklerine teşekkür ederiz.
.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ½” optical post | ThorLabs | TR2 | For imaging mount |
| 1 mL syringe | BD | 309659 | |
| 27G needle | BD PercisionGlide | 305111 | |
| 29G insulin syringe | McKesson | 102-SN05C905P | |
| 50 mL conicol tube | Falcon | 352098 | For mouse restraint |
| Adjustable angle plate | Renishaw | R-PCA-5023-50-20 | For imaging mount |
| Alcohol wipes | Coviden | 6818 | |
| betadine surgical scrub | Henry Schen | 67618-151-16 | |
| Buprenorphine SR-LAB | ZooPharm | 1mg/mL Sustained Release | |
| Combo III | Obtained from staff veterinarian | N/A | 37.6 mg/mL Ketamine; 1.9 mg/mL Xylazine; 0.37 mg/mL Acepronazine |
| Coverslip | Fisher | 12-545-87 | 24 x 40 premium superslip |
| Fine tip forcepts | FST | 11254-20 | |
| Ketamine | KetaVed | 50989-161-06 | 100 mg/mL |
| Leica TCS SP8MP with DM6000CFS | Leica Microsystems | N/A | |
| Matrigel | R & D Systems | 344500101 | |
| Medical tape | McKesson | 100199 | 3" x 10 yds (7.6 cm x 9.1 m) |
| Methocellulose | Electron Microscopy Sciences | 19560 | |
| Microdissection scissors | FST | 1456-12 | |
| Motorized stage | Anaheim automation | N/A | |
| Needle holder | FST | 12500-12 | |
| Nonabsorbable sutures | McKesson | S913BX | monofilament nylon 5-0 nonabsorbable sutures with attached C-1 reverse cutting needle |
| Opthalmic ointment | Rugby | 0536-1086-91 | |
| RANTES | Biolegend | 594202 | 10 µg/50 µL |
| Right-angle clamp for ½” post, 3/16” Hex | ThorLabs | RA90 | For imaging mount |
| Spring-loaded 3/16” Hex-locking ¼” thumbscrew | ThorLabs | TS25H | For imaging mount |
| Sterile cotton swabs | Henry Schen | 100-9249 | |
| Sterile DPBS (1x) | Corning | 21-030-CV | |
| Sterile drapes | McKessen | 25-517 | |
| Surgical gloves | McKessen | 3158VA | |
| Triple antibiotic ointment | Taro Pharmaceuticals U.s.a., Inc. | 51672-2120-2 | |
| Vacutainer blood collection set | BD | REF 367298 | 25G butterfly needle infusion set with 12" tubing |
References
- Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: mechanisms and interventions. Nature Reviews Rheumatology. 11 (1), 45-54 (2015).
- Murao, H., Yamamoto, K., Matsuda, S., Akiyama, H. Periosteal cells are a major source of soft callus in bone fracture. Journal of Bone and Mineral Metabolism. 31 (4), 390-398 (2013).
- Colnot, C. Skeletal cell fate decisions within periosteum and bone marrow during bone regeneration. Journal of Bone and Mineral Research. 24 (2), 274-282 (2009).
- Roberts, S. J., van Gastel, N., Carmeliet, G., Luyten, F. P. Uncovering the periosteum for skeletal regeneration: the stem cell that lies beneath. Bone. 70, 10-18 (2015).
- Duchamp de Lageneste, O., et al. Periosteum contains skeletal stem cells with high bone regenerative potential controlled by Periostin. Nature Communications. 9 (1), 773 (2018).
- Olivos-Meza, A., et al. Pretreatment of periosteum with TGF-beta1 in situ enhances the quality of osteochondral tissue regenerated from transplanted periosteal grafts in adult rabbits. Osteoarthritis Cartilage. 18 (9), 1183-1191 (2010).
- Debnath, S., et al. Discovery of a periosteal stem cell mediating intramembranous bone formation. Nature. 562 (7725), 133-139 (2018).
- Ransom, R. C., et al. Axin2-expressing cells execute regeneration after skeletal injury. Scientific Reports. 6, 36524 (2016).
- Ouyang, Z., et al. Prx1 and 3.2kb Col1a1 promoters target distinct bone cell populations in transgenic mice. Bone. 58, 136-145 (2013).
- Wilk, K., et al. Postnatal Calvarial Skeletal Stem Cells Expressing PRX1 Reside Exclusively in the Calvarial Sutures and Are Required for Bone Regeneration. Stem Cell Reports. 8 (4), 933-946 (2017).
- Ortinau, L. C., et al. Identification of Functionally Distinct Mx1+alphaSMA+ Periosteal Skeletal Stem Cells. Cell Stem Cell. 25 (6), 784-796 (2019).
- Deveza, L., Ortinau, L., Lei, K., Park, D. Comparative analysis of gene expression identifies distinct molecular signatures of bone marrow- and periosteal-skeletal stem/progenitor cells. PLoS One. 13 (1), 0190909 (2018).
- Schindeler, A., McDonald, M. M., Bokko, P., Little, D. G. Bone remodeling during fracture repair: The cellular picture. Seminars in Cell and Developmental Biology. 19 (5), 459-466 (2008).
- Shi, Y., et al. Gli1 identifies osteogenic progenitors for bone formation and fracture repair. Cell Stem Cell. 15 (2), 782-796 (2017).
- Zhou, B. O., Yue, R., Murphy, M. M., Peyer, J. G., Morrison, S. J. Leptin-receptor-expressing mesenchymal stromal cells represent the main source of bone formed by adult bone marrow. Cell Stem Cell. 15 (2), 154-168 (2014).
- Grcevic, D., et al. In vivo fate mapping identifies mesenchymal progenitor cells. Stem Cells. 30 (2), 187-196 (2012).
- Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K.
- Srinivas, S., et al. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Developmental Biology. 1, 4 (2001).
- Park, D., et al. Endogenous bone marrow MSCs are dynamic, fate-restricted participants in bone maintenance and regeneration. Cell Stem Cell. 10 (3), 259-272 (2012).
- Nitzsche, F., et al. Concise Review: MSC Adhesion Cascade-Insights into Homing and Transendothelial Migration. Stem Cells. 35 (6), 1446-1460 (2017).
- Adler, J., Pagakis, S. N. Reducing image distortions due to temperature-related microscope stage drift. Journal of Microscopy. 210, Pt 2 131-137 (2003).
- Roberts, S. J., Ke, H. Z. Anabolic Strategies to Augment Bone Fracture Healing. Current Osteoporosis Reports. 16 (3), 289-298 (2018).
