Summary
Denne protokollen beskriver påvisning av CCL5-mediert periosteal skjelett stamcellemigrasjon i sanntid ved hjelp av levende dyr intravital mikroskopi.
Abstract
Periosteal skjelett stamceller (P-SSCs) er avgjørende for livslang bein vedlikehold og reparasjon, noe som gjør dem et ideelt fokus for utvikling av terapier for å forbedre brudd healing. Periosteale celler migrerer raskt til en skade for å levere nye kondrocytter og osteoblaster for bruddheling. Tradisjonelt har effekten av en cytokin for å indusere cellemigrasjon bare blitt utført in vitro ved å utføre en transwell eller ripeanalyse. Med fremskritt innen intravital mikroskopi ved hjelp av multifotoneksitasjon, ble det nylig oppdaget at 1) P-SSC-er uttrykker migrasjonsgenet CCR5 og 2) behandling med CCR5-liganden kjent som CCL5 forbedrer bruddheling og migrering av P-SSC-er som svar på CCL5. Disse resultatene har blitt fanget opp i sanntid. Beskrevet her er en protokoll for å visualisere P-SSC migrasjon fra calvarial suture skjelett stamcelle (SSC) nisje mot en skade etter behandling med CCL5. Protokollen beskriver byggingen av en musbeherskelse og bildemontering, kirurgisk forberedelse av musekalvaria, induksjon av en calvaria-defekt og oppkjøp av tidsforløpavbildning.
Introduction
Bruddreparasjon er en dynamisk, multicellulær prosess som skiller seg fra embryonal skjelettutvikling og ombygging. Under denne prosessen etterfølges induksjonen av skadesignaler fra skadet vev av rask rekruttering, spredning og påfølgende differensiering av skjelettstamme / stamceller, som alle er kritiske for den generelle stabiliteten og fikseringen av brudd1. Spesielt krever tidlige stadier av bruddheling myk callusdannelse, som hovedsakelig tilskrives periosteale beboerceller2. Når bein er skadet, reagerer en undergruppe av periosteale celler raskt og bidrar til nylig differensierte brusk mellomprodukter og osteoblaster i callus3, noe som impliserer tilstedeværelsen av en distinkt skjelettstamme / stamcellepopulasjon i periosteum. Derfor utgjør identifisering og funksjonell karakterisering av periosteum-bosatte skjelettstammeceller (SSCer) en lovende terapeutisk tilnærming for degenerative beinsykdommer og beinfeil4.
SSC-er antas å ligge på flere vevssteder, inkludert benmargen. I likhet med benmarg er osteogene/kondrogene SSC-er også identifisert i periosteum4,5,6. Disse periosteale SSC-ene (P-SSCer) kan merkes med tidlige mesenchymale avstamningsmarkører (dvs. Prx1-Cre5, Ctsk-Cre7 og Axin2-CreER8) under utvikling av fosterben4,7,8,9,10. En betydelig begrensning av disse enkle genetiske avledningssporingsmodellene er at det er betydelig heterogenitet i merkede cellepopulasjoner. Videre kan de ikke skille merkede SSC-er fra deres avkom in vivo. For å løse denne begrensningen har vi nylig utviklet en dobbel reportermus (Mx1-Cre+Rosa26-Tomato+α SMA-GFP+) for å visualisere P-SSCer fra benmargs-SSCer (BM-SSCer)11. Med denne modellen har det blitt fastslått at P-SSCer er merket med Mx1 + αSMA + dobbel merking, mens mer differensierte Mx1 + celler ligger i benmargen, endosteale og periosteale overflater, og kortikale og trabekulære bein11,12.
Flere cytokiner og vekstfaktorer er kjent for å regulere beinoppussing og reparasjon og har blitt testet for forbedring av skjelettreparasjon i kritiske segmentfeil1,13. På grunn av den cellulære kompleksiteten til skademodeller generert gjennom forstyrrelse av beinrommets fysiske barriere, er imidlertid de direkte effektene av disse molekylene på endogen P-SSC-migrasjon og aktivering under helbredelse uklart. De funksjonelle egenskapene og trekkdynamikken til SSC-er vurderes ofte in vitro ved å utføre en transwell- eller scratch-analyse, i kombinasjon med cytokiner eller vekstfaktorer som er kjent for å indusere migrasjon i andre cellepopulasjoner. Dermed er tolkning av resultater fra disse in vitro-eksperimentene for anvendelse i deres tilsvarende in vivo-systemer utfordrende. For tiden observeres in vivo vurdering av skjelettstamme / stamcellemigrasjon vanligvis ikke i sanntid; Snarere måles det ved faste tidspunkter etter brudd5,7,14,15,16.
En begrensning ved denne metoden er at migrasjon ikke vurderes på et enkeltcellenivå. Snarere måles det via endringer i cellepopulasjoner. På grunn av nylige fremskritt innen levende animalsk intravital mikroskopi og generering av ekstra reportermus, er in vivo-sporing av individuelle celler nå mulig. Ved hjelp av levende dyr intravital mikroskopi observerte vi den distinkte migrasjonen av P-SSC-er fra calvaria sutur nisje til en beinskade innen 24-48 timer etter skade hos Mx1 / Tomat / αSMA-GFP-mus.
CCL5/CCR5 ble nylig identifisert som en regulatorisk mekanisme som påvirker rekrutterings- og aktiverings-P-SSCene under tidlig skaderespons. Interessant nok var det ingen påvisning av betydelig P-SSC-migrasjon som svar på en skade i sanntid. Behandling av en skade med CCL5 gir imidlertid en robust, retningsmessig distinkt migrering av P-SSCer, som kan fanges opp i sanntid. Derfor er målet med denne protokollen å gi en detaljert metodikk for registrering av in vivo-migrering av P-SSCer i sanntid etter behandling med CCL5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle mus ble opprettholdt under patogenfrie forhold, og alle prosedyrer ble godkjent av Baylor College of Medicines Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Forberedelse av mus
- Kryss Mx1-Cre17 og Rosa26-loxP-stop-loxP-tdTomato (Tom)18 mus (kjøpt fra Jackson Laboratory) med αSMA-GFP mus (levert her av Drs. Ivo Kalajzic og Henry Kronenberg) for å generere Mx1-Cre+Rosa26-Tomat+α SMA-GFP+ (Mx1/Tomat/αSMA-GFP) reportermus (figur 2A).
- For Mx1-Cre induksjon injiserer du mus med 25 mg/kg pIpC annenhver dag i 10 dager.
- Bestråle mus med 9,5 Gy 1 dag før intravenøs transplantasjon av 1 x 106 hele benmargsmonologceller fra wild-type C57BL/6 mus (WT-BMT)19.
- Etter 6 til 8 ukers gjenoppretting, subjektmus til in vivo-avbildning av periosteal cellemigrasjonsprotokoll beskrevet nedenfor.
MERK: Bestråling og WT-BMT av Mx1-Cre-mus er nødvendig for å eliminere endogent Mx1-merkede hematopoietiske celler som kan reagere på en skade. Seks til åtte uker etter bestråling er vertens hematopoietiske celleantall på <5% og dermed klar for avbildning19.
2. Musbeherskelse og bildemontering
- Lag en musebeherskelse med et konisk rør på 50 ml (figur 1A).
- Bruk spiss saks, stikk et hull gjennom bunnen av den koniske. Klipp fra bunnhullet til toppen av konisk (den kuttede siden vil være toppen av selvbeherskelsen).
- Lag et kutt ca 4-5 cm langt parallelt med forrige kutt og halvveis ned (~ 2 cm) fra toppen av selvbeherskelsen. Fjern denne delen av den koniske og glatte kantene var nødvendig.
- Konstruer en konisk røravbildningsbrakett ved hjelp av en justerbar vinkelplate, en 0,5" optisk stift og en rettvinklemklemme for den 0,5" stiften, 0,1875" hex (figur 1B og materialbord).
- Juster vinkelplaten til en vinkel på 35°. Skru den optiske stiften inn i det andre hullet på baksiden av platen på venstre side av vinkelplaten.
- På høyre side av den justerbare platen setter du inn en fjærbelastet 0,1875" sekskantlås 0,25" tommelskrue i det andre hullet fra forsiden og de siste hullene på platen. Rettvinklemmen vil bli brukt med den optiske stiften for å sikre den koniske musebeherskelsen på plass.
3. Preoperativ kirurgisk prosedyre
- Musebedøvelse
- For smertebehandling, subkutant injisere musen med vedvarende frigjøring buprenorfin (1 mg / kg BW) 30-60 min før operasjonen.
- Bedøv mus ved hjelp av gnager III CCM-kombinasjon (kombinasjon III) anestesi som inneholder 37,5 mg/ml ketamin, 1,9 mg/ml xylazin og 0,37 mg/ml acepromazin. Riktig dosering for mus er 0,75-1,50 ml per 1 kg kroppsvekt. Dosen varer 30–45 min.
- Når musen er bedøvet, bruk oftalmisk salve på øynene med en steril bomullspinne for å forhindre øyedehydrering.
- For langtidsavbildning (>45 min) administrer anestesi igjen for å opprettholde riktig bedøvelsesdybde som følger.
- Forbered en 1 ml sprøyte med tilstrekkelig mengde kombinasjon III for å opprettholde anestesi for den planlagte bildebehandlingsvarigheten (0,75 ml / kg BW per 30 min ekstra sedasjon). Fest et 25 G sommerfuglnålinfusjonssett med 12" slange til sprøyten og skyv bedøvelse gjennom slangen og kanylen.
- Sett inn sommerfuglnålen intraperitonealt, og teip deretter nålen på plass.
MERK: Dette er hvordan den ekstra kombinasjonen III vil bli administrert under avbildning slik at det ikke er nødvendig å flytte dyret eller forstyrre synsplanet.
- Gi termisk støtte med en varmepute holdt ved 37 °C gjennom hele prosedyren. For langvarig avbildning (>1t) vil det være nødvendig med ekstra væskestøtte. Ekstra væsker kan leveres I.P. med ekstra Combo III under bildebehandling eller 33 ml/kg saltvann (0,9 NaCl) subkutant.
- Musbeherskelse og forberedelse av operasjonsstedet
- Bruk clippers for å fjerne så mye hår som mulig fra toppen av hodet. Påfør depilatorisk krem på det barberte området for å fjerne eventuelt gjenværende hår på operasjonsstedet.
- Forsikre deg om at musen er fullstendig bedøvet av mangel på respons på tåklemmer. Etter 15 min, hvis musen ikke er fullstendig bedøvet, administrer en annen mindre dose kombinasjon III (<0,75 ml / kg kroppsvekt).
- Plasser musen i selvbeherskelse halen-først, skyve den langt nok bakover slik at nesen litt henger over kanten av den koniske.
- Tape de fremre potene til bunnen av det koniske røret ved hjelp av medisinsk tape.
- Plasser konisk rør med mus på en bildebrakett som er stilt inn i en 35°-vinkel og sikres ved hjelp av rettvinklemmen (figur 1C).
- Når musen er sikker i bildebraketten, rengjør du operasjonsstedet 3x med vekslende skrubber av betadineskrubb og 70% isopropylalkohol. Igjen, kontroller at dyret er helt bedøvet.
- Flytt musen til en ren absorberende pute og plasser en gardin over musen for å skape et stort sterilt felt.
4. Kirurgisk prosedyre
- Åpner snitt
- Bruk finspissede tang, plukk opp huden umiddelbart medial til høyre øre. Med mikrodisseksjon saks, kutt huden som holdes av tangene.
MERK: Ved å starte snittet ved hjelp av metoden beskrevet ovenfor, skapes et avrundet snitt som er mer egnet for suturering etter prosedyren. - Lag et tverrsnitt som starter fra det første snittet mot venstre øre (<1 cm). Gjør et nytt snitt, fra det første snittet, mot dyrets nese (~ 2-3 mm forbi høyre øye).
- Skill huden fra periosteumet ved hjelp av tang og saks for å forsiktig kutte gjennom bindevevet som skiller huden fra calvaria periosteum.
- Bruk en steril bomullspinne, påfør litt oftalmisk salve på toppen av hudklaffen. Plukk forsiktig opp hudklaffen og brett den over venstre øye. Skjæringspunktet mellom sagittal- og koronal suturer bør være klart eksponert (figur 1E).
MERK: Den oftalmiske salven brukes til å holde hudklaffen på plass. - Skyll den åpne overflaten med steril PBS for å rengjøre området av blod og gjenværende hår.
MERK: Bruk om nødvendig finspissede tang for å fjerne hår som forblir etter spyling, men vær forsiktig så du ikke skader periosteumet.
- Bruk finspissede tang, plukk opp huden umiddelbart medial til høyre øre. Med mikrodisseksjon saks, kutt huden som holdes av tangene.
- Mikrofraktur
- For å generere mikrofrakturer på calvaria, fjern stempelet på en 29 G insulinsprøyte og kutt den bakre enden av sprøyten, rundt 300-400 uL-merkene.
MERK: Dette trinnet gjør det lettere å manøvrere under et disseksjonsomfang når du produserer skaden. - Plasser spissen av en skråkant (en til to nålebredder) mot nesen fra koronal suturen og en til to nålebredder til høyre for sagittal sutur (figur 1E).
- Roter sprøyten forsiktig med klokken, og deretter mot klokken flere ganger.
MERK: Hos unge mus er det nødvendig med en svært liten mengde nedadgående trykk for å skape en sirkulær mikrofraktur. Vær forsiktig så du ikke lar nålen trenge inn i hjernen, da dette vil forårsake blødning og forstyrre avbildning. - Bruk en 27 G nål for å utvide mikrofrakturen til ~0,4 mm. Hvis beinfragmenter forblir i mikrofrakturen, skyll området med PBS. Hvis beinfragmenter fortsatt forblir i mikrofrakturen, bruk 29 G nålen til å forsiktig øse dem ut.
- Gjenta trinn 4.2.1–4.2.4 for å skape en skade på venstre side av sagittal suturen.
MERK: På dette tidspunktet er det to alternativer: 1) fortsett umiddelbart til CCL5-behandling (avsnitt 4.3) og avbildning (avsnitt 5); eller 2) stenge operasjonsstedet etter de postoperative prosedyrene i avsnitt 6. Ved 24 timer senere bedøver du musen igjen, åpner det kirurgiske synet på nytt, behandler skaden med CCL5 (avsnitt 4.3), og utfører intravital avbildning (avsnitt 5) og postoperativ behandling (avsnitt 6).
- For å generere mikrofrakturer på calvaria, fjern stempelet på en 29 G insulinsprøyte og kutt den bakre enden av sprøyten, rundt 300-400 uL-merkene.
- CCL5-behandling
- Fra et lager av RANTES (100 ng/ml) lage en løsning på 10 ng/ml ved hjelp av kjellermembranmatrise (Materialbord). Hold denne løsningen på is for å holde matrisen i flytende form.
- Behandle hver skade med 2 μL CCL5 (10 ng/μL) ved hjelp av en 2-20 μL pipette (denne pipettespissen har en større diameter, noe som er mer effektivt når du bruker en viskøs væske). La matrisen størkne.
- Når matrisen har størknet, dekk forsiktig calvaria med hudklaffen for å sikre at vevet ikke blir dehydrert. Inkuber i 1 time før avbildning.
5. Intravital avbildning
- Innstillinger for mikroskop
- Slå på multifotonlaseren (femtosecond titan-safirlaser). Sett bølgelengden til 880 nm og juster kraften for andre harmoniske generering (SHG) bildebehandling (440 nm) av beinet.
- Slå på 488 nm og 561 nm solid state lasere for eksitasjon av henholdsvis GFP- og tdTomato-uttrykkende celler.
- Slå på PMT-detektorer (fotomultiplierrør) for andre harmoniske generasjons (405–455 nm deteksjon) og GFP-signaler (505–550 nm deteksjon). Slå på HyD 3-detektor for tomat (590–620 nm deteksjon) signal.
- Montering
- Før du flytter musen til omfanget, kontroller det visuelle planet til calvaria ved å trykke forsiktig på baksiden av musens hode. Hvis planet ikke er i vater, justerer du posisjonen ved å rotere musepekeren forsiktig mot venstre eller høyre.
MERK: Dette er et kritisk trinn for å sikre tilstrekkelig bildekvalitet. - Påfør steril 2% metylcellulose i vann (w / v) for å dekke hele calvaria og hudklaff og forhindre tørking av vevet.
- Plasser musen på det motoriserte mikroskoptrinnet XYZ-aksen (figur 1G). Bruk epifluorescent lys, juster musen slik at 1) den vender mot mikroskopet og 2) skjæringspunktet mellom koronar og sagittal suturer er det sentrerte referansepunktet til scenen.
- Plasser glassdekselet på bildeområdet og dobbeltsjekk justeringen (figur 1H).
- Før du flytter musen til omfanget, kontroller det visuelle planet til calvaria ved å trykke forsiktig på baksiden av musens hode. Hvis planet ikke er i vater, justerer du posisjonen ved å rotere musepekeren forsiktig mot venstre eller høyre.
- Bilde av tidsforløp
- Bruk et objektiv med lav forstørrelse (25x vann nedsenkingsmål med NA = 0,95) for å skanne calvaria. Skaff deg et referansebilde av det sagittale og koronal suturkrysset.
- Bruk SHG- og fluorescerende signaler fra cellene til å lokalisere hvert skadesyn og registrere XYZ-koordinatene samt avstandene fra sagittal- og koronal suturer (figur 2B).
- Velg et sted på enten koronal eller sagittal suturer for langsiktig bildebehandling. Ta et detaljert Z-stakkbilde av dette området fra referansen under avbildning.
MERK: Siden suturene representerer en kjent P-SSC-nisje, er det her cellene vil migrere fra som svar på calvaria-skaden. - Bruk innstillingene for tidsforløpprogramvare til å ta opp et bilde hvert 1. I tiden mellom øyeblikksbilder sammenligner du gjeldende synsfelt med det første visningsfeltet. Hvis de er forskjellige, bruker du Z-stack-bildet til å bestemme i hvilken retning synsfeltet må justeres.
6. Postoperativ dyrepleie
- Etter avbildning, skyll den eksponerte calvaria med steril PBS for å fjerne metylcellulose.
- For å lukke snittet, plasser hudklaffen forsiktig over calvaria. Bruk sterile bomullspinne for å fjerne gjenværende oftalmisk salve og tørk snittstedet.
- Bruk monofilament nylon 5-0 størrelse ikke-brennbare suturer med en vedlagt C-1 omvendt skjærenål, lukk operasjonsstedet. Bruk en steril bomullspinne for å påføre trippel antibiotikasalve på det lukkede snittet.
MERK: Arrdannelse reduseres med sutureringsteknikker av høy kvalitet og minimal blødning. - Plasser musen i et rent bur på en varm overflate og kontroller hver 15 min til sternal heftelse er oppnådd.
- Administrer en ny dose vedvarende frigjøring buprenorfin 72 timer etter operasjonen.
- Overvåk daglig for huddling atferd, ruffled pels, og / eller mangel på ambulering til suturer er fjernet (~ 1 uke).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Skjelettforfedere er foreslått å ha trekk- eller sirkulasjonspotensial20. Nylig ble Mx1-Cre+Rosa26-Tomato+α SMA-GFP+ (Mx1/Tomato/αSMA-GFP) reportermus generert, der P-SSCer er merket med Mx1+α SMA+ dual labeling (figur 2A, B). Betydelig migrering av Mx1 + α SMA + P-SSCer skjedde ut av suturmesenchyme innen 24-48 h etter skade11. Også testet var muligheten for å oppdage in vivo P-SSC migrasjon i sanntid 24 timer etter en calvaria defekt. Lite eller ingen migrering av Mx1+αSMA+ P-SSCer ble observert innen 1 time etter bildebehandling (figur 2C).
Mx1+α SMA+ P-SSCer uttrykker CCL5-reseptoren kjent som CCR511 unikt. Behandling av en calvaria-defekt 24 timer etter skade med CCL5 førte dermed til retningsmessig distinkt migrasjon vekk fra koronal suturen og mot skadesiktet (figur 2D,E). Innen 1 t avbildning migrerte en av Mx1+αSMA+ P-SSCene omtrent 50 μm mot skaden (figur 2E). Andre Mx1+αSMA+ P-SSCer ble også observert migrerende som svar på CCL5-behandling, men i mindre grad.
Figur 1: Oppsett for in vivo-avbildning av musekalvaria. Representative bilder av musebeherskelsen (A) og bildebraketten (B) som brukes under live bildebehandling. (C) Mus i selvbeherskelsen og festet til bildebraketten. (D) Skjematisk representasjon av mus calvaria struktur, identifisere frontal (FS), coronal (CS), sagittal (SS) og lambdoid (LS) suturer. (E) Representativ plassering av calvaria mikrofrakturskader. (F) Postoperativ kirurgisk suturplassering for optimal helbredelse og fremtidig avbildning. Representative bilder av monteringsplassering på mikroskopstadium (G) og dekslerlipplassering (H). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Sanntids in vivo-avbildning av Mx1+αSMA+ P-SSC-migrering. (A) Skjematisk for Mx1/Tomat/αSMA-GFP dual reporter mus forberedelse. Mus ble injisert intraperitonealt med 25 mg/kg pIpC annenhver dag i 10 dager (1). Mx1/Tomat/αSMA-GFP-mus ble dødelig bestrålet med 9,5 Gy (2) 1 dag før intravenøs transplantasjon av 1 x 106 hele benmargsmonynukleære celler fra WT C57BL/6 mus (3). Etter 6-8 ukers restitusjon (da vertens hematopoietiske celler gråter mindre enn 5%), ble mus utsatt for beinskadeforsøk. Mx1+ (Tomat+), αSMA+ (GFP+), Mx1+α SMA+ (Tomat+GFP+) og ben (blå). (B) Maksimal Z-projeksjon av en representativ calvaria skade (hvit sirkel) og bildebehandling (hvit firkant) steder i forhold til sagittal (SS) og coronal (CS) suturer av Mx1 / Tomat / αSMA-GFP mus. Prikkede linjer representerer calvaria-suturer. (C) In vivo-avbildning av Mx1+α SMA+ P-SSCer respons 24 timer etter skade. Skalastang = 25 μm. (D) 24 timer etter skade, CCL5 ble administrert ved skadesiktet, og in vivo-avbildning ble utført 1 time senere i forhold til koronal suturen (CS). Hvit firkant representerer plasseringen av celleoverføringsbilder som vises i (E). Skalastang = 75 μm. (E) Migrering av Mx1+α SMA+ P-SSCer på benoverflaten (blå) mot skadesiktet (øverst til høyre). Skalastang = 25 μm. I (C, D,E) angir tallene tidspunktet for avbildning. Gul pil angir retningen på skadestedet. Stjerne angir den migrerende banen til Mx1+α SMA+ P-SSC. Bildet er representativt for resultater fra tre til fem mus. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Under beinheling er periosteale celler hovedkilden til nylig differensierte kondrocytter og osteoblaster i en skade callus3. I likhet med benmarg er osteogene/kondrogene SSC-er også identifisert i periosteum4,5,6. Vurdering av endogene P-SSC funksjonelle egenskaper er teknisk utfordrende. Ofte vurderes migrasjonsdynamikken til SSC-er in vitro, noe som gjør tolkning av deres tilsvarende in vivo-systemer utfordrende. På grunn av nylige fremskritt innen levende animalsk intravital mikroskopi og generering av ekstra reportermus (Mx1/ Tomat / αSMA-GFP), er in vivo-sporing av individuelle celler nå mulig. Dermed tillater denne metoden in vivo-opptak av CCL5-indusert P-SSCer-migrering i sanntid.
Det er flere tekniske utfordringer knyttet til denne metoden som kan påvirke avbildningskonsistensen. En stor teknisk utfordring med denne metoden er å opprettholde Z-akseplanet. Z-aksedrift (Z-drift) er et vanlig problem ved langtidsavbildning av faste og aktive prøver, og det tilskrives i stor grad temperaturendringer i bildemiljøet. Selv om denne artefakten ikke kan motvirkes fullstendig, bidrar det å dekke scenen, objektive linser og støttestrukturer til å redusere Z-drift21.
Videre vil det å skaffe en Z-stack-serie av bildeplasseringen før tidsforløpavbildning etablere en referanse til Z-aksen som kan refereres til mellom bildeanskaffelser (dvs. bilder tas vanligvis hver 30-60 s, noe som gir tid til justeringer av Z-aksen, om nødvendig). En annen teknisk utfordring er å lage en konsistent mikrofraktur som har samme størrelse, form og avstand fra calvaria-suturene. Avstanden fra koronal og sagittal suturer er kritisk, fordi calvaria sutures er en nisje for passiv SSCs10. Den beste metoden for å redusere variasjonen av mikrofrakturen er å praktisere denne teknikken hos mus som ikke er inkludert i den endelige analysen.
Til tross for begrensningene gir denne metoden et unikt system for å vurdere individuell cellulær respons in vivo til en beinskade. Siden bruddreparasjon er en svært kompleks prosess som involverer flere celletyper, er det flere aspekter som ikke er fullt ut forstått. En av disse inkluderer den tidlige trekkende responsen fra P-SSCer mot en skade. Selv om CCR5/CCL5 er en unik mekanisme som P-SSCer rekrutteres til en skade på, er det mulig at ytterligere cytokiner og vekstfaktorer spiller en viktig rolle i bruddheling. Tidligere har behandling av frakturer med ulike cytokiner og vekstfaktorer resultert i svært variable utfall i samlet bruddheling22. Denne avbildningsmetoden gir en unik plattform for å bestemme de fysiologiske effektene av potensielle legemiddel/cytokin/vekstfaktorbehandlinger på individuelle cellulære responser. Til slutt gir den in vivo mekanistiske data som kan støtte en bestemt terapis forbedring av bruddheling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
L.C.O. og D.P. avslører et ventende patent med tittelen "Periosteal Skjelett stamceller i bein reparasjon" (BAYM. P0264US. P1). De resterende forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Bone Disease Program of Texas Award, Caroline Wiess Law Fund Award og NIAMS of the National Institutes of Health under tildelingsnumrene R01 AR072018, R21 AG064345, R01 CA221946 til D.P. Vi takker M.E. Dickinson og T.J. Vadakkan i BCM Optical Imaging og Vital Microscopy Core og BCM Advanced Technology Cores med finansiering fra NIH (AI036211, CA125123 og DK056338).
.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ½” optical post | ThorLabs | TR2 | For imaging mount |
| 1 mL syringe | BD | 309659 | |
| 27G needle | BD PercisionGlide | 305111 | |
| 29G insulin syringe | McKesson | 102-SN05C905P | |
| 50 mL conicol tube | Falcon | 352098 | For mouse restraint |
| Adjustable angle plate | Renishaw | R-PCA-5023-50-20 | For imaging mount |
| Alcohol wipes | Coviden | 6818 | |
| betadine surgical scrub | Henry Schen | 67618-151-16 | |
| Buprenorphine SR-LAB | ZooPharm | 1mg/mL Sustained Release | |
| Combo III | Obtained from staff veterinarian | N/A | 37.6 mg/mL Ketamine; 1.9 mg/mL Xylazine; 0.37 mg/mL Acepronazine |
| Coverslip | Fisher | 12-545-87 | 24 x 40 premium superslip |
| Fine tip forcepts | FST | 11254-20 | |
| Ketamine | KetaVed | 50989-161-06 | 100 mg/mL |
| Leica TCS SP8MP with DM6000CFS | Leica Microsystems | N/A | |
| Matrigel | R & D Systems | 344500101 | |
| Medical tape | McKesson | 100199 | 3" x 10 yds (7.6 cm x 9.1 m) |
| Methocellulose | Electron Microscopy Sciences | 19560 | |
| Microdissection scissors | FST | 1456-12 | |
| Motorized stage | Anaheim automation | N/A | |
| Needle holder | FST | 12500-12 | |
| Nonabsorbable sutures | McKesson | S913BX | monofilament nylon 5-0 nonabsorbable sutures with attached C-1 reverse cutting needle |
| Opthalmic ointment | Rugby | 0536-1086-91 | |
| RANTES | Biolegend | 594202 | 10 µg/50 µL |
| Right-angle clamp for ½” post, 3/16” Hex | ThorLabs | RA90 | For imaging mount |
| Spring-loaded 3/16” Hex-locking ¼” thumbscrew | ThorLabs | TS25H | For imaging mount |
| Sterile cotton swabs | Henry Schen | 100-9249 | |
| Sterile DPBS (1x) | Corning | 21-030-CV | |
| Sterile drapes | McKessen | 25-517 | |
| Surgical gloves | McKessen | 3158VA | |
| Triple antibiotic ointment | Taro Pharmaceuticals U.s.a., Inc. | 51672-2120-2 | |
| Vacutainer blood collection set | BD | REF 367298 | 25G butterfly needle infusion set with 12" tubing |
References
- Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: mechanisms and interventions. Nature Reviews Rheumatology. 11 (1), 45-54 (2015).
- Murao, H., Yamamoto, K., Matsuda, S., Akiyama, H. Periosteal cells are a major source of soft callus in bone fracture. Journal of Bone and Mineral Metabolism. 31 (4), 390-398 (2013).
- Colnot, C. Skeletal cell fate decisions within periosteum and bone marrow during bone regeneration. Journal of Bone and Mineral Research. 24 (2), 274-282 (2009).
- Roberts, S. J., van Gastel, N., Carmeliet, G., Luyten, F. P. Uncovering the periosteum for skeletal regeneration: the stem cell that lies beneath. Bone. 70, 10-18 (2015).
- Duchamp de Lageneste, O., et al. Periosteum contains skeletal stem cells with high bone regenerative potential controlled by Periostin. Nature Communications. 9 (1), 773 (2018).
- Olivos-Meza, A., et al. Pretreatment of periosteum with TGF-beta1 in situ enhances the quality of osteochondral tissue regenerated from transplanted periosteal grafts in adult rabbits. Osteoarthritis Cartilage. 18 (9), 1183-1191 (2010).
- Debnath, S., et al. Discovery of a periosteal stem cell mediating intramembranous bone formation. Nature. 562 (7725), 133-139 (2018).
- Ransom, R. C., et al. Axin2-expressing cells execute regeneration after skeletal injury. Scientific Reports. 6, 36524 (2016).
- Ouyang, Z., et al. Prx1 and 3.2kb Col1a1 promoters target distinct bone cell populations in transgenic mice. Bone. 58, 136-145 (2013).
- Wilk, K., et al. Postnatal Calvarial Skeletal Stem Cells Expressing PRX1 Reside Exclusively in the Calvarial Sutures and Are Required for Bone Regeneration. Stem Cell Reports. 8 (4), 933-946 (2017).
- Ortinau, L. C., et al. Identification of Functionally Distinct Mx1+alphaSMA+ Periosteal Skeletal Stem Cells. Cell Stem Cell. 25 (6), 784-796 (2019).
- Deveza, L., Ortinau, L., Lei, K., Park, D. Comparative analysis of gene expression identifies distinct molecular signatures of bone marrow- and periosteal-skeletal stem/progenitor cells. PLoS One. 13 (1), 0190909 (2018).
- Schindeler, A., McDonald, M. M., Bokko, P., Little, D. G. Bone remodeling during fracture repair: The cellular picture. Seminars in Cell and Developmental Biology. 19 (5), 459-466 (2008).
- Shi, Y., et al. Gli1 identifies osteogenic progenitors for bone formation and fracture repair. Cell Stem Cell. 15 (2), 782-796 (2017).
- Zhou, B. O., Yue, R., Murphy, M. M., Peyer, J. G., Morrison, S. J. Leptin-receptor-expressing mesenchymal stromal cells represent the main source of bone formed by adult bone marrow. Cell Stem Cell. 15 (2), 154-168 (2014).
- Grcevic, D., et al. In vivo fate mapping identifies mesenchymal progenitor cells. Stem Cells. 30 (2), 187-196 (2012).
- Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K.
- Srinivas, S., et al. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Developmental Biology. 1, 4 (2001).
- Park, D., et al. Endogenous bone marrow MSCs are dynamic, fate-restricted participants in bone maintenance and regeneration. Cell Stem Cell. 10 (3), 259-272 (2012).
- Nitzsche, F., et al. Concise Review: MSC Adhesion Cascade-Insights into Homing and Transendothelial Migration. Stem Cells. 35 (6), 1446-1460 (2017).
- Adler, J., Pagakis, S. N. Reducing image distortions due to temperature-related microscope stage drift. Journal of Microscopy. 210, Pt 2 131-137 (2003).
- Roberts, S. J., Ke, H. Z. Anabolic Strategies to Augment Bone Fracture Healing. Current Osteoporosis Reports. 16 (3), 289-298 (2018).
