Summary

Aislamiento de cardiomiocitos ventriculares humanos de rebanadas de miocardio de corte de vibratome

Published: May 10, 2020
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Summary

Presentado es un protocolo para el aislamiento de cardiomiocitos ventriculares humanos y animales de rodajas de miocardio cortados por vibratome. Se pueden obtener altos rendimientos de células tolerantes al calcio (hasta 200 células/mg) a partir de pequeñas cantidades de tejido (<50 mg). El protocolo es aplicable al miocardio expuesto a isquemia fría durante un máximo de 36 h.

Abstract

El aislamiento de los miocitos cardíacos ventriculares de corazones animales y humanos es un método fundamental en la investigación cardíaca. Los cardiomiocitos animales son comúnmente aislados por perfusión coronaria con enzimas digestivas. Sin embargo, aislar los cardiomiocitos humanos es un reto porque los especímenes de miocardio humano generalmente no permiten la perfusión coronaria, y los protocolos de aislamiento alternativos resultan en rendimientos pobres de células viables. Además, los especímenes de miocardio humano son raros y solo están disponibles regularmente en instituciones con cirugía cardíaca in situ. Esto dificulta la traducción de los hallazgos de cardiomiocitos animales a humanos. Aquí se describe un protocolo fiable que permite el aislamiento eficiente de los miocitos ventriculares del miocardio humano y animal. Para aumentar la relación superficie-volumen y minimizar el daño celular, se generan rebanadas de tejido miocárdico de 300 m de espesor a partir de muestras de miocárdico con un vibratome. Las rodajas de tejido se digieren con proteasa y colagenasa. El miocardio de rata se utilizó para establecer el protocolo y cuantificar los rendimientos de miocitos viables y tolerantes al calcio mediante el recuento de células citométricas de flujo. La comparación con el método de trozos de tejido comúnmente utilizado mostró rendimientos significativamente más altos de los cardiomiocitos en forma de varilla (41,5 a 11,9 frente a 7,89 a 3,6%, p < 0,05). El protocolo se tradujo al miocardio humano en defecto y sin fallos, donde los rendimientos eran similares a los del miocardio de rata y, de nuevo, notablemente más altos que con el método de tejido-trozo (45,0 a 15,0 frente a 6,87 a 5,23 células/mg, p < 0,05). En particular, con el protocolo presentado es posible aislar un número razonable de cardiomiocitos humanos viables (9–200 células/mg) de cantidades mínimas de tejido (<50 mg). Por lo tanto, el método es aplicable al miocardio sano y en defecto de los corazones humanos y animales. Además, es posible aislar miocitos excitables y contráctiles de muestras de tejido humano almacenadas hasta 36 h en solución cardiopléjica en frío, haciendo que el método sea particularmente útil para laboratorios en instituciones sin cirugía cardíaca in situ.

Introduction

Una técnica seminal que ha allanado el camino a información importante sobre la fisiología cardiomiocitos es el aislamiento de cardiomiocitos ventriculares vivos de corazones intactos1. Cardiomiocitos aislados se pueden utilizar para estudiar la estructura celular normal y la función, o las consecuencias de los experimentos in vivo; por ejemplo, para evaluar los cambios en la electrofisiología celular o el acoplamiento excitación-contracción en modelos animales de enfermedad cardíaca. Además, los cardiomiocitos aislados se pueden utilizar para el cultivo celular, intervenciones farmacológicas, transferencia de genes, ingeniería de tejidos y muchas otras aplicaciones. Por lo tanto, los métodos eficientes para el aislamiento de cardiomiocitos son de valor fundamental para la investigación cardíaca básica y traslacional.

Los cardiomiocitos de pequeños mamíferos, como los roedores, y de mamíferos más grandes, como cerdos o perros, son comúnmente aislados por perfusión coronaria del corazón con soluciones que contienen colágenos crudos y/o proteasas. Esto ha sido descrito como el método “estándar de oro” para el aislamiento de cardiomiocitos, lo que resulta en rendimientos de hasta el 70% de las células viables2. El enfoque también se ha utilizado con los corazones humanos, lo que resulta en rendimientos de cardiomiocitos aceptables3,,4,5. Sin embargo, debido a que la perfusión coronaria sólo es factible si el corazón intacto o una cuña miocárdica grande que contiene una rama de la arteria coronaria está disponible, la mayoría de los especímenes cardíacos humanos no son adecuados para este enfoque debido a su pequeño tamaño y la falta de vasculatura adecuada. Por lo tanto, el aislamiento de los cardiomiocitos humanos es un desafío.

Los especímenes de miocardio humano consisten principalmente en trozos de tejido de tamaño variable (aproximadamente 0,5 x 0,5 x 0,5 cm a 2 x 2 x 2 cm), obtenidos a través de biopsias endomiocardiales6, miectomies septal7, implantaciones de VAD8, o de corazones explantados9. Los procedimientos más comunes para el aislamiento de cardiomiocitos comienzan con la picadura del tejido usando tijeras o un bisturí. Los contactos de célula a célula se interrumpen por inmersión en tampones libres de calcio o de bajo contenido de calcio. Esto es seguido por múltiples pasos de digestión con extractos de enzimas brutas o enzimas purificadas como proteasas (por ejemplo, tripina), colagenasa, hialuronidasa, o elastasa, lo que resulta en una desintegración de la matriz extracelular y la liberación de los cardiomiocitos. En un paso final y crítico, una concentración fisiológica de calcio tiene que ser restaurada cuidadosamente, o el daño celular puede ocurrir debido a la paradoja de calcio10,11,12. Este enfoque de aislamiento es conveniente, pero generalmente ineficiente. Por ejemplo, un estudio encontró que casi 1 g de tejido miocárdico era necesario para obtener un número suficiente de cardiomiocitos adecuado para experimentos posteriores13. Una posible razón para los bajos rendimientos es el método relativamente duro de picar el tejido. Esto puede dañar particularmente los cardiomiocitos ubicados en los bordes de los trozos, aunque estos miocitos son más propensos a ser liberados por digestión enzimática.

Otro aspecto que puede influir en la eficiencia del aislamiento y la calidad de las células obtenidas de muestras humanas es la duración de la isquemia tisular. La mayoría de los protocolos mencionan los tiempos de transporte cortos al laboratorio como un requisito previo para obtener buenos resultados. Esto restringe el estudio de cardiomiocitos ventriculares humanos a laboratorios con instalaciones de cirugía cardíaca cercanas. Juntos, estas restricciones dificultan la verificación de hallazgos importantes de modelos animales en cardiomiocitos humanos. Por lo tanto, son deseables protocolos de aislamiento mejorados que permiten altos rendimientos de cardiomiocitos a partir de pequeñas cantidades de tejido, preferiblemente sin daños graves después de tiempos de transporte prolongados.

Aquí se describe un protocolo de aislamiento basado en la digestión enzimática de las rebanadas de tejido miocárdico delgado generadas con un vibratoma14,,15. Demostramos que el aislamiento de las rodajas de tejido es mucho más eficiente que el de los trozos de tejido picados con tijeras. El método descrito no sólo permite altos rendimientos de cardiomiocitos humanos viables a partir de pequeñas cantidades de tejido miocárdico, sino que también es aplicable a muestras almacenadas o transportadas en solución cardiopléjica en frío hasta 36 h.

Protocol

Todos los experimentos con ratas fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Mittelfranken, Baviera, Alemania. La recolección y el uso de muestras de tejido cardíaco humano fueron aprobados por las Juntas de Revisión Institucional de la Universidad de Erlangen-Núremberg y el Ruhr-Universidad Bochum. Los estudios se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices de la Declaración de Helsinki. Los pacientes dieron su consentimiento informado por escrito antes de la recolección de tejidos. <p clas…

Representative Results

Para verificar la eficiencia del aislamiento, el protocolo se utilizó con miocardio de rata y el número resultante de miocitos viables se comparó con los números obtenidos por aislamiento a través de perfusión coronaria y por aislamiento de pequeños trozos de tejido (aislamiento de trozos, Figura 2). El aislamiento de los trozos y el aislamiento de las rebanadas de tejido se realizaron desde los mismos corazones. Para el aislamiento a través de perfusión coronaria, sin embargo, se u…

Discussion

Aunque el aislamiento de los cardiomiocitos vivos se estableció hace más de 40 años y sigue siendo un requisito previo para muchos enfoques experimentales en la investigación cardíaca, sigue siendo una técnica difícil con resultados impredecibles. El aislamiento de cardiomiocitos a través de la perfusión de las arterias coronarias con solución enzimática se utiliza comúnmente para corazones de animales pequeños y produce un gran número de células viables. Sin embargo, esto requiere un sistema y experiencia…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nos gustaría dar las gracias a Andreas Dendorfer, del Centro Walter-Brendel de Medicina Experimental, LMU Munich, por su ayuda con el protocolo de corte. Por proporcionar muestras de tejido miocárdico humano, nos gustaría agradecer a Ghazali Minabari y Christian Heim del Departamento de Cirugía Cardíaca, Hospital Universitario Erlangen, Hendrik Milting del Instituto Erich & Hanna Klessmann, Ruhr-University Bochum y Muhannad Alkassar del Departamento de Cardiología Pediátrica, Hospital Universitario Erlangen. Para el apoyo con la citometría de flujo, nos gustaría dar las gracias a Simon V-ll y a sus colegas del Centro de Investigación Traslacional (TRC), Hospital Universitario Erlangen. También nos gustaría dar las gracias a Lorenz McCargo y a Celine Gracianinger del Instituto de Fisiología Celular y Molecular de Erlangen por su excelente apoyo técnico.

Este trabajo fue apoyado por el DZHK (Centro Alemán de Investigación Cardiovascular), por el Centro Interdisciplinario de Investigación Clínica (IZKF) en el Hospital Universitario de la Universidad de Erlangen-Núremberg, y la Universidad erlangen-Núremberg.

Materials

Chemicals
2,3-butanedionemonoxime Carl Roth 3494.1 Purity>99%
Bovine serum albumin Carl Roth 163.2
CaCl2 Carl Roth 5239.2
Creatine monohydrate Alfa Aesar B250009
Glucose Merck 50-99-7
HEPES Carl Roth 9105.3
KCl Carl Roth P017.1
KH2PO4 Carl Roth 3904.2
L-glutamic acid Fluka Biochemica 49450
Low melting-point agarose Carl Roth 6351.5
MgCl2 x 6H2O Carl Roth A537.1
MgSO4 Sigma Aldrich M-7506
NaCl Carl Roth 9265.1
NaHCO3 Carl Roth 8551.2
Paraformaldehyde Sigma Aldrich P6148
Taurine Sigma Aldrich T8691
Dyes
Di-8-ANEPPS Thermo Fisher Scientific D3167
Fluo-4 AM Thermo Fisher Scientific F14201
FluoVolt Thermo Fisher Scientific F10488
Enzymes
Collagenase CLS type I Worthington LS004196 Used for human tissue at 4 mg/mL
(activity: 280 U/mg)
Collagenase CLS type II Worthington LS004176 Used for rat tissue at 1.5 mg/mL
(activity 330 U/mg)
Protease XIV Sigma Aldrich P8038 Used for rat tissue at 0.5 mg/mL
(activity ≥ 3.5 U/mg)
Proteinase XXIV Sigma Aldrich P5147 Used for human tissue at 0.5 mg/mL
(activity: 7-14 U/mg)
Material
Cell analyzer (LSR Fortessa) BD Bioscience 649225
Centrifuge tube, 15 mL Corning 430790
Centrifuge tube, 50 mL Corning 430829
Compact shaker Edmund Bühler KS-15 B control Agitation direction: horizontal
Disposable plastic pasteur-pipettes Carl Roth EA65.1 For cell trituration use only pipettes with an inner tip diameter ≥2 mm
Forceps FST 11271-30
Heatblock VWR BARN88880030
Nylon net filter, 180 µm Merck NY8H04700
TC Dish 100, Standard Sarstedt 83.3902
TC Dish 35, Standard Sarstedt 83.3900
TC Dish 60, Standard Sarstedt 83.3901
Vibratome (VT1200S) Leica 1491200S001 Includes VibroCheck for infrared-assisted correction of z-deflection

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Fiegle, D. J., Volk, T., Seidel, T. Isolation of Human Ventricular Cardiomyocytes from Vibratome-Cut Myocardial Slices. J. Vis. Exp. (159), e61167, doi:10.3791/61167 (2020).

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