Isolierung menschlicher ventrikulärer Kardiomyozyten aus Vibratome-Cut Myokardscheiben

Zusammenfassung

Präsentiert wird ein Protokoll zur Isolierung von humanen und tierischen ventrikulären Kardiomyozyten aus vibratomegeschnittenen Myokardscheiben. Hohe Erträge von kalziumtoleranten Zellen (bis zu 200 Zellen/mg) können aus kleinen Gewebemengen (<50 mg) gewonnen werden. Das Protokoll gilt für Myokard, das bis zu 36 h kalten Ischämien ausgesetzt ist.

Zusammenfassung

Die Isolierung ventrikulärer Herzmyozyten aus tierischen und menschlichen Herzen ist eine grundlegende Methode in der Herzforschung. Tierische Kardiomyozyten werden häufig durch koronare Perfusion mit Verdauungsenzymen isoliert. Die Isolierung menschlicher Kardiomyozyten ist jedoch eine Herausforderung, da menschliche Myokardproben in der Regel keine koronare Perfusion zulassen und alternative Isolationsprotokolle zu schlechten Erträgen lebensfähiger Zellen führen. Darüber hinaus sind humane Myokardproben selten und nur regelmäßig in Einrichtungen mit Herzchirurgie vor Ort verfügbar. Dies erschwert die Übersetzung von Befunden von tierischen in menschliche Kardiomyozyten. Hier wird ein zuverlässiges Protokoll beschrieben, das eine effiziente Isolierung ventrikulärer Myozyten von menschlichem und tierischem Myokard ermöglicht. Um das Verhältnis von Oberfläche zu Volumen zu erhöhen und gleichzeitig die Zellschädigung zu minimieren, werden aus Myokardproben mit einem Vibram eine Dicke von 300 m dicke Myokardscheiben erzeugt. Gewebescheiben werden dann mit Protease und Kollagenase verdaut. Rattenmyokard wurde verwendet, um das Protokoll zu bestimmen und die Erträge lebensfähiger, kalziumtoleranter Myozyten durch strömungszytometrische Zellzählung zu quantifizieren. Der Vergleich mit der häufig verwendeten Gewebe-Chunk-Methode zeigte signifikant höhere Erträge von stabförmigen Kardiomyozyten (41,5 x 11,9 vs. 7,89 x 3,6 %, p < 0,05). Das Protokoll wurde in versagendes und nicht versagendes menschliches Myokard übersetzt, wo die Erträge ähnlich waren wie bei Rattenmyokard und wiederum deutlich höher als bei der Gewebe-Chunk-Methode (45,0 x 15,0 vs. 6,87 x 5,23 Zellen/mg, p < 0,05). Insbesondere mit dem vorgelegten Protokoll ist es möglich, eine angemessene Anzahl lebensfähiger menschlicher Kardiomyozyten (9–200 Zellen/mg) aus minimalen Gewebemengen (<50 mg) zu isolieren. So ist die Methode auf gesundes und versagendes Myokard sowohl von menschlichen als auch tierischen Herzen anwendbar. Darüber hinaus ist es möglich, erregbare und kontraktile Myozyten aus menschlichen Gewebeproben zu isolieren, die bis zu 36 h in kalter kardioplegischer Lösung gelagert werden, was die Methode besonders nützlich für Laboratorien in Einrichtungen ohne Herzchirurgie vor Ort macht.

Einleitung

Eine wegweisende Technik, die den Weg zu wichtigen Einblicken in die Kardiomyozytenphysiologie geebnet hat, ist die Isolierung lebender ventrikulärer Kardiomyozyten von intakten Herzen¹. Isolierte Kardiomyozyten können verwendet werden, um normale zelluläre Struktur und Funktion zu studieren, oder die Folgen von In-vivo-Experimenten; zum Beispiel, um Veränderungen in der zellulären Elektrophysiologie oder Anregungs-Kontraktionskopplung in Tiermodellen von Herzerkrankungen zu bewerten. Darüber hinaus können isolierte Kardiomyozyten für Zellkultur, pharmakologische Interventionen, Gentransfer, Tissue Engineering und viele andere Anwendungen verwe....

Protokoll

Alle Versuche mit Ratten wurden vom Tierschutz- und Einsatzausschuss Mittelfranken, Bayern, genehmigt. Die Entnahme und Verwendung menschlicher Herzgewebeproben wurde von den Institutionellen Fachkollegien der Universität Erlangen-Nürnberg und der Ruhr-Universität Bochum genehmigt. Die Studien wurden gemäß den Richtlinien der Helsinki-Erklärung durchgeführt. Die Patienten gaben ihre schriftliche Einwilligung in Kenntnis der Sachlage vor der Gewebeentnahme ab.

Weibliche Wistar-Ratten (150–200 g) wurden kommerziell erhalten, durch Injektion von 100 mg/kg Thiopental-Natrium intraperitoneal anentäbt und durch Zervixdislokation, gefolgt von Thor....

Ergebnisse

Um die Isolationseffizienz zu überprüfen, wurde das Protokoll mit Rattenmyokard verwendet und die resultierende Anzahl lebensfähiger Myozyten wurde mit den Zahlen verglichen, die durch Isolierung durch koronare Perfusion und durch Isolierung von kleinen Gewebestücken (Chunk-Isolation, Abbildung 2). Chunk Isolation und Isolierung von Gewebescheiben wurden von den gleichen Herzen durchgeführt. Für die Isolierung durch koronare Perfusion wurde jedoch das ganze Herz verwendet. Die koronare Perfu.......

Diskussion

Obwohl die Isolation lebender Kardiomyozyten vor mehr als 40 Jahren etabliert wurde und immer noch eine Voraussetzung für viele experimentelle Ansätze in der Herzforschung ist, bleibt sie eine schwierige Technik mit unvorhersehbaren Ergebnissen. Die Kardiomyozytenisolation durch Perfusion der Herzkranzgefäße mit Enzymlösung wird häufig für Herzen von Kleintieren verwendet und liefert eine große Anzahl lebensfähiger Zellen. Dies erfordert jedoch ein relativ komplexes System und Fachwissen. Darüber hinaus sind die meisten .......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Chemicals
2,3-butandionmonoxim	Carl Roth	3494.1	Reinheit>99%
Rinderserumalbumin	Carl Roth	163.2
CaCl2	Carl Roth	5239.2
Kreatinmonohydrat	Alfa Aesar	B250009
Glucose	Merck	50-99-7
HEPES	Carl Roth	9105.3
KCl	Carl Roth	P017.1
KH2PO4	Carl Roth	3904.2
L-Glutaminsäure	Fluka Biochemica	49450
Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt	Carl Roth	6351.5
MgCl2 x 6H2O	Carl Roth	A537.1
MgSO4	Sigma Aldrich	M-7506
NaCl	Carl Roth	9265.1
NaHCO3	Carl Roth	8551.2
Paraformaldehyd	Sigma Aldrich	P6148
Taurin	Sigma Aldrich	T8691
Dyes
Di-8-ANEPPS	Thermo Fisher	Scientific D3167
Fluo-4 AM	Thermo Fisher Scientific	F14201
FluoVolt	Thermo Fisher Scientific	F10488
Enzyme
Kollagenase CLS Typ I	Worthington	LS004196	Wird für menschliches Gewebe in einer Dosis von 4 mg/ml verwendet (Aktivität: 280 U/mg)
Kollagenase CLS Typ II	Worthington	LS004176	Wird für Rattengewebe in einer Dosis von 1,5 mg/ml (Aktivität 330 U/mg) verwendetProtease
XIV	Sigma Aldrich	P8038	Wird für Rattengewebe in einer Dosis von 0,5 mg/ml (Aktivität ≥ 3,5 U/mg) verwendetProteinase
XXIV	Sigma Aldrich	P5147	Zur Verwendung für menschliches Gewebe bei 0,5 mg/ml (Aktivität: 7-14 U/mg)
Material
Cell Analyzer (LSR Fortessa)	BD Bioscience	649225
Zentrifugenröhrchen, 15 mL	Corning	430790
Zentrifugenröhrchen, 50 mL	Corning	430829
Compact Shaker	Edmund Bü hler	KS-15 B Steuerung	Rührrichtung: horizontal
Einweg-Pasteur-Pipetten aus Kunststoff	Carl Roth	EA65.1	Für die Zellverreibung werden nur Pipetten mit einem Innenspitzendurchmesser ≥ 2 mm
Pinzette	FST	11271-30
Heatblock	VWR	BARN88880030
Nylon Netzfilter, 180 & micro; m	Merck	NY8H04700
TC Dish 100, Standard	Sarstedt	83.3902
TC Dish 35, Standard	Sarstedt	83.3900
TC Dish 60, Standard	Sarstedt	83.3901
Vibratome (VT1200S)	Leica	1491200S001	Inklusive VibroCheck zur infrarotgestützten Korrektur der z-Auslenkung