Präsentiert wird ein Protokoll zur Isolierung von humanen und tierischen ventrikulären Kardiomyozyten aus vibratomegeschnittenen Myokardscheiben. Hohe Erträge von kalziumtoleranten Zellen (bis zu 200 Zellen/mg) können aus kleinen Gewebemengen (<50 mg) gewonnen werden. Das Protokoll gilt für Myokard, das bis zu 36 h kalten Ischämien ausgesetzt ist.
Die Isolierung ventrikulärer Herzmyozyten aus tierischen und menschlichen Herzen ist eine grundlegende Methode in der Herzforschung. Tierische Kardiomyozyten werden häufig durch koronare Perfusion mit Verdauungsenzymen isoliert. Die Isolierung menschlicher Kardiomyozyten ist jedoch eine Herausforderung, da menschliche Myokardproben in der Regel keine koronare Perfusion zulassen und alternative Isolationsprotokolle zu schlechten Erträgen lebensfähiger Zellen führen. Darüber hinaus sind humane Myokardproben selten und nur regelmäßig in Einrichtungen mit Herzchirurgie vor Ort verfügbar. Dies erschwert die Übersetzung von Befunden von tierischen in menschliche Kardiomyozyten. Hier wird ein zuverlässiges Protokoll beschrieben, das eine effiziente Isolierung ventrikulärer Myozyten von menschlichem und tierischem Myokard ermöglicht. Um das Verhältnis von Oberfläche zu Volumen zu erhöhen und gleichzeitig die Zellschädigung zu minimieren, werden aus Myokardproben mit einem Vibram eine Dicke von 300 m dicke Myokardscheiben erzeugt. Gewebescheiben werden dann mit Protease und Kollagenase verdaut. Rattenmyokard wurde verwendet, um das Protokoll zu bestimmen und die Erträge lebensfähiger, kalziumtoleranter Myozyten durch strömungszytometrische Zellzählung zu quantifizieren. Der Vergleich mit der häufig verwendeten Gewebe-Chunk-Methode zeigte signifikant höhere Erträge von stabförmigen Kardiomyozyten (41,5 x 11,9 vs. 7,89 x 3,6 %, p < 0,05). Das Protokoll wurde in versagendes und nicht versagendes menschliches Myokard übersetzt, wo die Erträge ähnlich waren wie bei Rattenmyokard und wiederum deutlich höher als bei der Gewebe-Chunk-Methode (45,0 x 15,0 vs. 6,87 x 5,23 Zellen/mg, p < 0,05). Insbesondere mit dem vorgelegten Protokoll ist es möglich, eine angemessene Anzahl lebensfähiger menschlicher Kardiomyozyten (9–200 Zellen/mg) aus minimalen Gewebemengen (<50 mg) zu isolieren. So ist die Methode auf gesundes und versagendes Myokard sowohl von menschlichen als auch tierischen Herzen anwendbar. Darüber hinaus ist es möglich, erregbare und kontraktile Myozyten aus menschlichen Gewebeproben zu isolieren, die bis zu 36 h in kalter kardioplegischer Lösung gelagert werden, was die Methode besonders nützlich für Laboratorien in Einrichtungen ohne Herzchirurgie vor Ort macht.
Eine wegweisende Technik, die den Weg zu wichtigen Einblicken in die Kardiomyozytenphysiologie geebnet hat, ist die Isolierung lebender ventrikulärer Kardiomyozyten von intakten Herzen1. Isolierte Kardiomyozyten können verwendet werden, um normale zelluläre Struktur und Funktion zu studieren, oder die Folgen von In-vivo-Experimenten; zum Beispiel, um Veränderungen in der zellulären Elektrophysiologie oder Anregungs-Kontraktionskopplung in Tiermodellen von Herzerkrankungen zu bewerten. Darüber hinaus können isolierte Kardiomyozyten für Zellkultur, pharmakologische Interventionen, Gentransfer, Tissue Engineering und viele andere Anwendungen verwendet werden. Effiziente Methoden zur Kardiomyozytenisolation sind daher von grundlegender Bedeutung für die Grundlagen- und Translational-Herzforschung.
Kardiomyozyten von kleinen Säugetieren, wie Nagetieren, und von größeren Säugetieren, wie Schweinen oder Hunden, werden häufig durch koronare Perfusion des Herzens mit Lösungen isoliert, die rohe Kollagenatonse und/oder Proteasen enthalten. Dies wurde als die “Goldstandard”-Methode für die Kardiomyozytenisolation beschrieben, was zu Erträgen von bis zu 70% der lebensfähigen Zellen2führt. Der Ansatz wurde auch mit menschlichen Herzen verwendet, was zu akzeptablen Kardiomyozytenerträgen3,4,5. Da jedoch eine koronare Perfusion nur möglich ist, wenn das intakte Herz oder ein großer Myokardkeil mit einem koronaren Herzzweig zur Verfügung steht, sind die meisten menschlichen Herzproben aufgrund ihrer geringen Größe und des Mangels an geeigneter Gefäße für diesen Ansatz nicht geeignet. Daher ist die Isolierung menschlicher Kardiomyozyten eine Herausforderung.
Menschliche Myokardproben bestehen meist aus Gewebestücken variabler Größe (ca. 0,5 x 0,5 x 0,5 cm bis 2 x 2 x 2 cm), die durch endomyocardiale Biopsien6, septale Myektomien7, VAD-Implantationen8oder aus explantierten Herzen9. Die häufigsten Verfahren für die Kardiomyozytenisolation beginnen mit dem Hacken des Gewebes mit einer Schere oder einem Skalpell. Zell-zu-Zell-Kontakte werden dann durch Eintauchen in kalziumfreie oder kalziumarme Puffer gestört. Es folgen mehrere Verdauungsschritte mit Rohenzymextrakten oder gereinigten Enzymen wie Proteasen (z.B. Trypsin), Kollagenase, Hyaluronidase oder Elastase, was zu einem Zerfall der extrazellulären Matrix und der Befreiung von Kardiomyozyten führt. In einem letzten, kritischen Schritt muss eine physiologische Kalziumkonzentration sorgfältig wiederhergestellt werden, oder zelluläre Schäden können aufgrund des Calcium-Paradoxons10,11,12auftreten. Dieser Isolationsansatz ist praktisch, aber in der Regel ineffizient. Eine Studie ergab beispielsweise, dass fast 1 g Myokardgewebe erforderlich waren, um eine ausreichende Anzahl von Kardiomyozyten zu erhalten, die für nachfolgende Experimente geeignet sind13. Ein möglicher Grund für niedrige Erträge ist die relativ harte Methode, das Gewebe zu hacken. Dies kann besonders kardiomyozyten an den Klodrändern beschädigen, obwohl diese Myozyten am ehesten durch enzymatische Verdauung freigesetzt werden.
Ein weiterer Aspekt, der die Isolationseffizienz und -qualität der aus menschlichen Proben gewonnenen Zellen beeinflussen kann, ist die Dauer der Gewebeischämie. Die meisten Protokolle nennen kurze Transportzeiten ins Labor als Voraussetzung für gute Ergebnisse. Dies beschränkt die Untersuchung von humanventrikulären Kardiomyozyten auf Laboratorien mit nahe gelegenen Herzchirurgie-Einrichtungen. Zusammen behindern diese Einschränkungen die Überprüfung wichtiger Erkenntnisse von Tiermodellen in menschlichen Kardiomyozyten. Verbesserte Isolationsprotokolle, die hohe Kardiomyozytenausbeuten aus kleinen Gewebemengen ermöglichen, vorzugsweise ohne schwerwiegende Schäden nach längeren Transportzeiten, sind daher wünschenswert.
Beschrieben wird hier ein Isolationsprotokoll, das auf der enzymatischen Verdauung dünner Myokardgewebescheiben basiert, die mit einem Vibratom14,15erzeugt werden. Wir zeigen, dass die Isolierung von Gewebescheiben viel effizienter ist als die von Gewebestücken, die mit einer Schere gehackt werden. Die beschriebene Methode ermöglicht nicht nur hohe Erträge lebensfähiger menschlicher Kardiomyozyten aus kleinen Mengen Myokardgewebe, sondern ist auch auf Proben anwendbar, die in kalter kardioplegischer Lösung bis zu 36 h gelagert oder transportiert werden.
Obwohl die Isolation lebender Kardiomyozyten vor mehr als 40 Jahren etabliert wurde und immer noch eine Voraussetzung für viele experimentelle Ansätze in der Herzforschung ist, bleibt sie eine schwierige Technik mit unvorhersehbaren Ergebnissen. Die Kardiomyozytenisolation durch Perfusion der Herzkranzgefäße mit Enzymlösung wird häufig für Herzen von Kleintieren verwendet und liefert eine große Anzahl lebensfähiger Zellen. Dies erfordert jedoch ein relativ komplexes System und Fachwissen. Darüber hinaus sind di…
The authors have nothing to disclose.
Wir danken Andreas Dendorfer vom Walter-Brendel-Zentrum für Experimentelle Medizin, LMU München, für die Hilfe beim Schneideprotokoll. Für die Bereitstellung menschlicher Myokardgewebeproben danken wir Ghazali Minabari und Christian Heim von der Klinik für Herzchirurgie, Universitätsklinikum Erlangen, Hendrik Milting vom Erich & Hanna Klessmann Institut, Ruhr-Universität Bochum und Muhannad Alkassar von der Klinik für Kinderkardiologie, Universitätsklinikum Erlangen. Für die Unterstützung bei der Durchflusszytometrie danken wir Simon Völkl und Kollegen vom Translational Research Center (TRC), Universitätsklinikum Erlangen. Wir danken auch Lorenz McCargo und Celine Grüninger vom Institut für Zell- und Molekularphysiologie Erlangen für die hervorragende technische Unterstützung.
Unterstützt wurde diese Arbeit vom DZHK (Deutsches Zentrum für Herz-Kreislauf-Forschung), vom Interdisziplinären Zentrum für Klinische Forschung (IZKF) am Universitätsklinikum der Universität Erlangen-Nürnberg und dem Universitätsbund Erlangen-Nürnberg.
Chemicals | |||
2,3-butanedionemonoxime | Carl Roth | 3494.1 | Purity>99% |
Bovine serum albumin | Carl Roth | 163.2 | |
CaCl2 | Carl Roth | 5239.2 | |
Creatine monohydrate | Alfa Aesar | B250009 | |
Glucose | Merck | 50-99-7 | |
HEPES | Carl Roth | 9105.3 | |
KCl | Carl Roth | P017.1 | |
KH2PO4 | Carl Roth | 3904.2 | |
L-glutamic acid | Fluka Biochemica | 49450 | |
Low melting-point agarose | Carl Roth | 6351.5 | |
MgCl2 x 6H2O | Carl Roth | A537.1 | |
MgSO4 | Sigma Aldrich | M-7506 | |
NaCl | Carl Roth | 9265.1 | |
NaHCO3 | Carl Roth | 8551.2 | |
Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
Taurine | Sigma Aldrich | T8691 | |
Dyes | |||
Di-8-ANEPPS | Thermo Fisher Scientific | D3167 | |
Fluo-4 AM | Thermo Fisher Scientific | F14201 | |
FluoVolt | Thermo Fisher Scientific | F10488 | |
Enzymes | |||
Collagenase CLS type I | Worthington | LS004196 | Used for human tissue at 4 mg/mL (activity: 280 U/mg) |
Collagenase CLS type II | Worthington | LS004176 | Used for rat tissue at 1.5 mg/mL (activity 330 U/mg) |
Protease XIV | Sigma Aldrich | P8038 | Used for rat tissue at 0.5 mg/mL (activity ≥ 3.5 U/mg) |
Proteinase XXIV | Sigma Aldrich | P5147 | Used for human tissue at 0.5 mg/mL (activity: 7-14 U/mg) |
Material | |||
Cell analyzer (LSR Fortessa) | BD Bioscience | 649225 | |
Centrifuge tube, 15 mL | Corning | 430790 | |
Centrifuge tube, 50 mL | Corning | 430829 | |
Compact shaker | Edmund Bühler | KS-15 B control | Agitation direction: horizontal |
Disposable plastic pasteur-pipettes | Carl Roth | EA65.1 | For cell trituration use only pipettes with an inner tip diameter ≥2 mm |
Forceps | FST | 11271-30 | |
Heatblock | VWR | BARN88880030 | |
Nylon net filter, 180 µm | Merck | NY8H04700 | |
TC Dish 100, Standard | Sarstedt | 83.3902 | |
TC Dish 35, Standard | Sarstedt | 83.3900 | |
TC Dish 60, Standard | Sarstedt | 83.3901 | |
Vibratome (VT1200S) | Leica | 1491200S001 | Includes VibroCheck for infrared-assisted correction of z-deflection |