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Biology

Isolement des cardiomyocytes ventriculaires humains des tranches myocardales vibratoires-cut

Published: May 10, 2020 doi: 10.3791/61167
Automatic Translation
1, 1,2, 1,2
1Institute of Cellular and Molecular Physiology, Friedrich-Alexander University Erlangen-Nürnberg, 2Muscle Research Center Erlangen (MURCE), Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

Summary

Présenté est un protocole pour l’isolement des cardiomyocytes ventriculaires humains et animaux des tranches myocardales vibratoires. Des rendements élevés de cellules tolérantes au calcium (jusqu’à 200 cellules/mg) peuvent être obtenus à partir de petites quantités de tissus (<50 mg). Le protocole s’applique au myocarde exposé à l’ischémie froide jusqu’à 36 h.

Abstract

L’isolement des myocytes cardiaques ventriculaires des cœurs animaux et humains est une méthode fondamentale dans la recherche cardiaque. Les cardiomyocytes animaux sont généralement isolés par perfusion coronaire avec des enzymes digestives. Cependant, isoler les cardiomyocytes humains est difficile parce que les spécimens myocardiques humains ne permettent généralement pas la perfusion coronaire, et les protocoles d’isolement alternatifs entraînent de faibles rendements de cellules viables. En outre, les spécimens myocardes humains sont rares et ne sont disponibles que régulièrement dans les établissements où la chirurgie cardiaque est sur place. Cela entrave la traduction des résultats des cardiomyocytes animaux aux cardiomyocytes humains. Décrit ici est un protocole fiable qui permet l’isolement efficace des myocytes ventriculaires du myocarde humain et animal. Pour augmenter le rapport surface-volume tout en minimisant les dommages cellulaires, des tranches de tissu myocardique de 300 μm d’épaisseur sont générées à partir de spécimens myocardiaux avec un vibratome. Les tranches de tissu sont ensuite digérées avec la protéase et la collagènease. Le myocarde de rat a été employé pour établir le protocole et quantifier des rendements des myocytes viables et tolérants de calcium par le comptage de cellules fluage-cytométriques. La comparaison avec la méthode couramment utilisée en morceaux de tissu a montré des rendements significativement plus élevés de cardiomyocytes en forme de tige (41,5 ± 11,9 contre 7,89 ± 3,6 %, p < 0,05). Le protocole a été traduit par un myocarde humain défaillant et non défaillant, où les rendements étaient semblables à ceux du myocarde de rat et, encore une fois, nettement plus élevés qu’avec la méthode des morceaux de tissu (45,0 ± 15,0 contre 6,87 ± 5,23 cellules/mg, p < 0,05). Notamment, avec le protocole présenté, il est possible d’isoler un nombre raisonnable de cardiomyocytes humains viables (9–200 cellules/mg) à partir de quantités minimales de tissu (<50 mg). Ainsi, la méthode s’applique au myocarde sain et défaillant des cœurs humains et animaux. En outre, il est possible d’isoler les myocytes excitables et contractiles des spécimens de tissus humains stockés jusqu’à 36 h dans une solution cardioplégique froide, rendant la méthode particulièrement utile pour les laboratoires des établissements sans chirurgie cardiaque sur place.

Introduction

Une technique séminale qui a ouvert la voie à des idées importantes dans la physiologie cardiomyocyte est l’isolement des cardiomyocytes ventriculaires vivants des coeurs intacts1. Les cardiomyocytes isolés peuvent être utilisés pour étudier la structure et la fonction cellulaires normales, ou les conséquences des expériences in vivo; par exemple, évaluer les changements dans l’électrophysiologie cellulaire ou le couplage excitation-contraction dans les modèles animaux de maladies cardiaques. En outre, les cardiomyocytes isolés peuvent être utilisés pour la culture cellulaire, les interventions pharmacologiques, le transfert de gènes, l’ingénierie tissulaire, et beaucoup d’autres applications. Par conséquent, les méthodes efficaces pour l’isolement cardiomyocyte sont d’une valeur fondamentale à la recherche cardiaque fondamentale et translationnelle.

Les cardiomyocytes de petits mammifères, tels que les rongeurs, et de grands mammifères, comme les porcs ou les chiens, sont généralement isolés par perfusion coronaire du cœur avec des solutions contenant des collagèneases brutes et/ou des protéases. Ceci a été décrit comme la méthode « étalon-or » pour l’isolement de cardiomyocyte, ayant pour résultat des rendements allant jusqu’à 70% des cellules viables2. L’approche a également été utilisée avec les cœurs humains, résultant en rendements cardiomyocyte acceptables3,4,5. Cependant, parce que la perfusion coronaire n’est possible que si le cœur intact ou un grand coin myocardique contenant une branche de l’artère coronaire est disponible, la plupart des spécimens cardiaques humains ne sont pas adaptés à cette approche en raison de leur petite taille et un manque de vascularisation appropriée. Par conséquent, l’isolement des cardiomyocytes humains est difficile.

Les spécimens myocardiaux humains se composent principalement de morceaux de tissu de taille variable (environ 0,5 x 0,5 x 0,5 cm à 2 x 2 x 2 cm), obtenus par biopsies endomyocardiales6, myectomies septales7, implantations VAD8, ou à partir de cœurs explantés9. Les procédures les plus courantes pour l’isolement cardiomyocyte commencent par hacher le tissu à l’aide de ciseaux ou d’un scalpel. Les contacts cellule-cellule sont ensuite perturbés par immersion dans des tampons sans calcium ou à faible teneur en calcium. Elle est suivie de multiples étapes de digestion avec des extraits d’enzymes brutes ou des enzymes purifiées comme les protéases (p. ex., la trypsine), la collagène, l’hyaluronidase ou l’élastase, entraînant une désintégration de la matrice extracellulaire et la libération des cardiomyocytes. Dans une dernière étape critique, une concentration physiologique de calcium doit être soigneusement restaurée, ou des dommages cellulaires peuvent se produire en raison du calcium-paradoxe10,11,12. Cette approche d’isolement est pratique mais généralement inefficace. Par exemple, une étude a révélé que près d’un g de tissu myocardique était nécessaire pour obtenir un nombre suffisant de cardiomyocytes adaptés aux expériences ultérieures13. Une raison possible de faibles rendements est la méthode relativement dure de hacher le tissu. Cela peut particulièrement endommager les cardiomyocytes situés sur les bords des morceaux bien que ces myocytes soient les plus susceptibles d’être libérés par la digestion enzymatique.

Un autre aspect qui peut influencer l’efficacité d’isolement et la qualité des cellules obtenues à partir de spécimens humains est la durée de l’ischémie tissulaire. La plupart des protocoles mentionnent les délais de transport courts au laboratoire comme condition préalable à de bons résultats. Cela limite l’étude des cardiomyocytes ventriculaires humains aux laboratoires avec des installations de chirurgie cardiaque à proximité. Ensemble, ces restrictions entravent la vérification des résultats importants des modèles animaux dans les cardiomyocytes humains. Il est donc souhaitable d’améliorer les protocoles d’isolement qui permettent des rendements cardiomyocytes élevés à partir de petites quantités de tissus, de préférence sans dommages graves après des périodes de transport prolongées.

Décrit ici est un protocole d’isolement basé sur la digestion enzymatique de fines tranches de tissu myocardique générées avec un vibratome14,15. Nous démontrons que l’isolement des tranches de tissu est beaucoup plus efficace que celui des morceaux de tissu hachés avec des ciseaux. La méthode décrite permet non seulement des rendements élevés de cardiomyocytes humains viables à partir de petites quantités de tissu myocardique, mais elle s’applique également aux spécimens stockés ou transportés dans une solution cardioplégique froide jusqu’à 36 h.

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Protocol

Toutes les expériences avec des rats ont été approuvées par le Comité de soins et d’utilisation des animaux Mittelfranken, Bavière, Allemagne. La collecte et l’utilisation d’échantillons de tissus cardiaques humains ont été approuvées par les commissions d’examen institutionnelles de l’Université d’Erlangen-Nürnberg et du Bochum de la Ruhr-Université. Des études ont été menées conformément aux lignes directrices de la Déclaration d’Helsinki. Les patients ont donné leur consentement écrit en connaissance de cause avant la collecte des tissus.

Des rats wistar femelles (150–200 g) ont été obtenus commercialement, anesthésiés en injectant 100 mg/kg de thiopental-sodium intrapéritoneally, et euthanasiés par dislocation cervicale suivie de la thoracotomie et de l’excision du coeur. Des échantillons humains de tissu cardiaque ont été prélevés dans le noyau apical du ventriculaire gauche pendant l’implantation de dispositifs d’assistance mécanique, de la myectomie septale, de la tétralogie de la chirurgie corrective de Fallot, ou de la paroi libre de ventriculaire gauche des coeurs explantés. Le protocole suivant décrit l’isolement du tissu ventriculaire humain. L’isolement des cardiomyocytes de rat a été exécuté en conséquence, mais avec différentes enzymes (voir tableau des matériaux). Un flux de travail schématique du protocole est illustré à la figure 1.

1. Préparation de tampons, de solutions et d’enzymes

  1. Préparer les tampons et les solutions énumérés dans le tableau 1.
  2. Solutions d’échauffement 1, 2, 3 et solution tyrode modifiée à 37 °C. Conserver la solution de coupe à 4 °C jusqu’à l’utilisation.
    REMARQUE : Pour 1 à 2 tranches de myocarde, un total d’environ 15 mL, 8 mL et 5 mL de solutions 1, 2 et 3 sont nécessaires pour l’isolement dans un plat de culture tissulaire de 35 mm. Augmentez en conséquence pour les isolements simultanés de myocyte dans plusieurs plats. La solution de coupe peut être congelée et conservée à -20 °C pendant plusieurs mois.
  3. Peser 1 mg de protéinase XXIV (voir tableau des matériaux)dans un tube de centrifugeuse de 15 ml préchillé et conserver sur la glace jusqu’à l’utilisation. Il s’agit pour le traitement d’un échantillon. Augmentez le montant en conséquence. Ne mélangez pas la protéinase et la collagènease.
  4. Pesez 8 mg de collagènease CLSI (voir Tableau des matériaux)dans un tube de centrifugeuse préchillé de 15 mL et rangez-les sur la glace jusqu’à l’utilisation. Il s’agit pour le traitement d’un échantillon. Augmentez le montant en conséquence. Ne mélangez pas la protéinase et la collagènease.
    ATTENTION : Portez un masque facial ou travaillez sous une hotte de fumée pour éviter l’inhalation de poudre enzymatique.
    REMARQUE : L’activité enzymatique peut varier en différents lots. Par conséquent, la concentration optimale peut différer et doit être déterminée avec chaque enzyme nouvellement achetée16.

2. Stockage et transport de tissus myocardiques

  1. Conserver et transporter des échantillons cardiaques humains dans une solution de coupe refroidie à 4 °C (tableau 1).
  2. Utilisez la même solution pour le traitement des tissus et le tranchage vibromètre.
    REMARQUE : Les biopsies et les échantillons cardiaques chirurgicaux doivent être transférés immédiatement à la solution de coupe à 4 °C et peuvent ensuite être stockés ou transportés à 4 °C pendant un maximum de 36 h avant l’application de ce protocole.

3. Traitement et tranchage du tissu

NOTE : Le protocole pour le tranchage des tissus suit Fischer et coll.15.

  1. Coupe du bloc tissulaire
    ATTENTION : Le tissu cardiaque humain est potentiellement infectieux. Utilisez toujours l’usure protectrice et respectez les règles de sécurité de votre établissement. Manipuler soigneusement les lames usagées et les jeter dans des contenants de sécurité.
    1. Placer le spécimen dans un plat de culture tissulaire de 100 mm rempli d’une solution de coupe à froid de 20 mL et conserver sur une plaque refroidie de 4 °C.
    2. Enlever l’excès de tissu fibrotique et la graisse épicardiale avec un scalpel. Dans le cas d’un spécimen transmural, enlever les trabeculae et les couches de tissu près de l’endocardium.
      REMARQUE : Le tissu fibrotique est raide et semble blanc. La graisse est généralement molle et semble blanche à jaune. Les couches de trabeculae et de tissu endocardial peuvent être identifiées à partir de leur composition de tissu lâche et d’une orientation de fibre non alignée comparée au myocarde des couches épicardiales
    3. Pour un traitement optimal du vibromètre, coupez des blocs de tissu rectangulaire d’environ 8 mm x 8 mm x 8 mm avec un scalpel d’un plus grand spécimen de tissu. Pour les biopsies plus petites sauter cette étape et passer à l’intégration agarose.
  2. Intégration de tissus cardiaques dans l’agarose à faible point de fusion
    1. Faire bouillir 400 mg d’agarose à faible point de fusion dans 10 mL de solution de coupe dans un bécher en verre.
      ATTENTION : Portez des gants et des lunettes de sécurité pour éviter les brûlures. Manipuler la verrerie chaude seulement avec l’usure de protection de chaleur.
    2. Remplir une seringue de 10 mL avec le gel agarose chaud et dissous. Sceller la seringue et laisser l’agarose équilibrer dans un bain d’eau de 37 °C pendant au moins 15 min.
    3. Utilisez des forceps pour placer le spécimen cardiaque ou la biopsie paré dans un plat propre de culture tissulaire de 35 mm avec l’épicardium orienté vers le bas et enlever l’excès de liquide à l’aide d’un écouvillon stérile.
    4. Verser l’agarose équilibrée (étape 3.2.2) sur le tissu en vidant la seringue. Fixer le tissu contre le mouvement avec des forceps tout en versant l’agarose. Assurez-vous que le tissu est complètement immergé dans l’agarose.
    5. Déposer immédiatement le plat sur la glace et laisser l’agarose se solidifier pendant 10 min.
  3. Trancher le myocarde
    1. Montez une nouvelle lame de rasoir sur le support de lame du vibratome et calibrez le vibratome en ajustant si possible la déviation z de la lame.
      REMARQUE : Ce protocole utilise un vibratome avec un dispositif d’étalonnage assisté par infrarouge pour aligner la lame en position horizontale avec une déviation minimale en z (déviation mesurée <0,1 μm).
    2. Utilisez un scalpel pour exciser un bloc de tissu agarose qui s’adapte au support du vibratome. Pour assurer la stabilité, assurez-vous que le tissu est encore suffisamment immergé dans l’agarose (marges agarose ≥ 8 mm).
    3. Fixer le bloc agarose sur le support du spécimen avec une fine couche de colle cyanoacrylate et une légère pression.
    4. Placez le porte-spécimen avec le tissu dans le bain vibratoire. Remplissez le bain de solution de coupe et maintenez-le à 4–6 °C tout au long du traitement avec de la glace concassée, rempli dans le réservoir de refroidissement externe du vibratome.
    5. Générer des tranches de 300 μm d’épaisseur avec une vitesse d’avancement de ≤0,1 mm/s, une fréquence oscillante de 80 Hz, une amplitude latérale de 1,5 mm et un angle de lame de 15°. Lors de la manipulation des tranches, maintenez l’agarose au lieu du tissu lui-même pour éviter les dommages tissulaires. Conserver les tranches dans la solution de coupe à 4 °C pendant un maximum de 2 h, si nécessaire.
      REMARQUE : Les cardiomyocytes sont orientés parallèlement à l’épicardium. Par conséquent, il est important de couper en parallèle à l’épicardium pour éviter les dommages excessifs de myocyte. Il est recommandé de jeter les premières tranches 1 à 3, car seules des tranches uniformes d’épaisseur constante doivent être utilisées pour l’isolement. Pour les biopsies de petits tissus, cependant, ne jeter que la première tranche.
    6. Vérifiez l’alignement des cardiomyocytes sous un microscope léger standard avec un grossissement de 40-100x.

4. Digestion des tissus

  1. Placez la plaque chauffante sur le shaker de laboratoire et faites-la chauffer à 37 °C. Démarrez le shaker de laboratoire à 65 tr/min.
  2. Dissoudre la protéinase (préparée à l’étape 1.3) en 2 mL de solution 1 (étape 1.1 et 1.2) et incuber à 37 °C jusqu’à l’utilisation. Ne mélangez pas la protéinase et la collagènease.
  3. Dissoudre la collagènease (préparée à l’étape 1.4) dans 2 mL de solution 1 (étape 1.1 et 1.2) et incuber à 37 °C jusqu’à l’utilisation. Ne mélangez pas la protéinase et la collagènease.
    ATTENTION : Portez des lunettes et des gants de protection, car les enzymes dissoutes peuvent causer des blessures à la peau et aux yeux.
  4. Ajouter le chlorure de calcium (CaCl2)à la solution contenant de la collagènease (préparée à l’étape 4.3) à une concentration finale de 5 μM.
  5. Utilisez des forceps pour transférer une tranche de tissu du bain vibratoire vers un plat propre de culture tissulaire de 60 mm rempli de 5 mL de solution de coupe préchillée (étape 1.1 et 1.2) et garder sur la glace.
  6. Retirez soigneusement l’agarose du tissu myocardique à l’aide d’une lame ou d’un forceps.
    REMARQUE : Évitez l’excès de tension et le stress de cisaillement sur les tranches de myocarde, car ils peuvent endommager les cardiomyocytes.
  7. Pour effectuer le lavage initial, placez un plat propre de culture tissulaire de 35 mm sur la plaque chauffante et remplissez-le de 2 mL de solution préguerre (37 °C) 1. Transférer 1 à 2 tranches de myocarde dans le plat préparé avec des forceps. Apirate la solution avec une pipette de 1 mL et effectuer les étapes de lavage 2x pour enlever les restes de la solution de coupe.
    REMARQUE : Ne pas aspirate les tranches cardiaques. Les solutions et les tranches doivent rester à une température constante de 35 °C sur la plaque chauffante agitée. Ajuster la température de la plaque thermique si nécessaire.
  8. Retirer la solution 1 du plat et ajouter 2 mL de la solution protéinase (étape 4.2). Incuber pendant 12 min sur la plaque chauffante à 65 tr/min.
  9. Laver 2x avec 2 mL de solution préguerre 1 (37 °C).
  10. Retirer la solution 1 du plat et ajouter 2 mL de solution de collagène (étapes 4.3 et 4.4). Incuber au moins 30 min sur la plaque chauffante à 65 tr/min.
  11. Vérifiez les myocytes individuels gratuits à 30, 35, 40 min, etc., en plaçant le plat sous un microscope léger. Travaillez rapidement pour éviter un refroidissement significatif de la solution.
    REMARQUE : Le temps de digestion requis peut varier en fonction de la constitution tissulaire et du degré de fibrose. Dès que le tissu devient visiblement mou et se dissocie facilement lorsqu’il est doucement tiré, le temps de digestion optimal a été atteint. Si suffisamment de tissu est disponible, plusieurs tranches peuvent être digérées en parallèle avec des temps de digestion variables.
  12. Lorsque le tissu est digéré et que les myocytes individuels sont visibles (étape 4.11), lavez 2x avec 2 mL de solution préguerre 2 (37 °C) et remplissez à nouveau de 2 mL.

5. Dissociation tissulaire

  1. Dissocier les tranches de tissu digérées au forceps en retirant soigneusement les fibres.
  2. Soigneusement pipette plusieurs fois avec une pipette Pasteur à usage unique (diamètre d’ouverture >2 mm).
    REMARQUE : L’utilisation de forceps et de pipetage peut induire un stress mécanique et causer des dommages aux cardiomyocytes. Cependant, il s’agit d’une étape cruciale pour la séparation des cellules. Utilisez des forceps fins pour minimiser les dommages aux cellules et dissociez soigneusement les tranches en petits morceaux.
  3. Vérifiez les cardiomyocytes libérés en forme de tige sous le microscope léger.

6. Réintroduction de la concentration physiologique de calcium

  1. Augmenter lentement la concentration de calcium de 5 μM à 1,5 mM tout en agitant à 35 °C sur la plaque chauffante. Utilisez des solutions de stock de 10 mM et 100 mM CaCl2. Étapes recommandées : 20, 40, 80, 100, 150, 200, 400, 800, 1 200, 1 500 μM. Permettre aux cellules de s’adapter aux niveaux accrus de calcium dans des intervalles d’incubation de 5 min entre chaque étape.
  2. Retirez soigneusement les morceaux de tissu non digérés avec des forceps ou filtrez la suspension cellulaire à travers un maillage en nylon avec une taille de pore de 180 μm à la fin de l’augmentation du calcium.

7. Retrait de l’agent de découplage mécanique

  1. Arrêter l’agitation et retirer lentement un tiers de la solution (~700 μL) du haut avec une pipette de 1 000 μL. Évitez l’aspiration des cardiomyocytes.
    REMARQUE : Si le tissu non digéré a été enlevé, les cardiomyocytes s’accumuleront dans le centre du plat, ce qui facilite l’aspiration de la solution sans cellules. Si ce n’est pas le cas, transférer la solution cellulaire dans un tube de centrifugeuse de 15 mL et laisser les cellules se sédimenter pendant 10 min à 35 °C, puis remplacer 700 μL du supernatant et jeter, resuspender les cellules, les transférer dans un plat de culture tissulaire de 35 mm et procéder à l’étape 7.2.
  2. Ajouter 700 μL de solution 3 aux cellules, reprendre l’agitation sur la plaque chauffante et incuber pendant 10 min.
  3. Répétez les étapes 7.1 et 7.2.
  4. Transférer la solution dans un tube de centrifugeuse de 15 ml et laisser les cardiomyocytes dans les sédiments pendant au moins 10 min et un maximum de 30 min à température ambiante ou tourner à 50 x g pendant 1 min. Retirez complètement le supernatant et resuspendez dans la solution de Tyrode modifiée ou dans le tampon d’expérimentation souhaité.
    REMARQUE : Les cardiomyocytes peuvent être stockés dans la solution de Tyrode modifiée (tableau 1) pendant plusieurs heures à 37 °C et 5 % de CO2 avant utilisation.
  5. Vérifiez la qualité de la cellule avec un microscope léger standard au grossissement 40x et 200x.
    REMARQUE : Environ 30 à 50 % des cardiomyocytes doivent être en forme de tige, lisses sans taches de membrane et afficher des stries croisées claires. Seulement 5 à 10% des cellules viables devraient montrer des contractions spontanées.

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Representative Results

Pour vérifier l’efficacité de l’isolement, le protocole a été utilisé avec le myocarde de rat et le nombre résultant de myocytes viables a été comparé aux nombres obtenus par isolement par perfusion coronaire et par isolement de petits morceaux de tissu (isolement de morceaux, Figure 2). L’isolement et l’isolement des morceaux des tranches de tissu ont été exécutés des mêmes coeurs. Pour l’isolement par perfusion coronaire, cependant, le coeur entier a été employé. La perfusion coronaire a donné principalement des cardiomyocytes croisés en forme de tige et. Avec des isolements des tranches myocardiques une proportion plus faible de cellules en forme de tige ont été observées, mais le nombre total était encore élevé. En revanche, après l’isolement des morceaux de tissu, seulement peu de cellules en forme de tige ont été récupérées (Figure 2A). La cytométrie de flux a été employée pour comparer les résultats quantitativement. En raison de leur taille relativement grande et de leur stration croisée, les cardiomyocytes affichent généralement de grandes valeurs pour la diffusion vers l’avant et le côté. Ces propriétés ont été utilisées pour compter les myocytes en forme de tige avec un analyseur de cellules cytométriques à flux, appliquant un schéma simple de gating qui discriminait en forme de tige des cardiomyocytes hypercontractés et arrondis. (Figure supplémentaire 1). Les parcelles de points représentatives sont représentées dans Figure 2B. L’analyse statistique a montré des dénombrements nettement plus élevés dans la porte de cardiomyocyte CM1 pour l’isolement des tranches que des morceaux de tissu (41,5 ± 11,9 contre 7,89 ± 3,6 %, respectivement; n =3 isolements; p < 0.05, paired two-tailed t-test). As expected from visual inspection, coronary perfusion yielded the highest counts, with 71.0 ± 9.4% (n = 3 isolations; p < 0.05, unpaired two-tailed t-test) (Figure 2C). Ainsi, l’isolement des cardiomyocytes des tranches de tissu n’atteint pas le rendement obtenu par perfusion coronaire, mais se traduit par un nombre considérablement plus grand de myocytes en forme de tige que l’isolement des morceaux de tissu, fournissant suffisamment de cellules pour des expériences ultérieures. En plus du nombre de cellules, les paramètres structurels des cardiomyocytes de rat ont été quantifiés. La longueur des cellules, la largeur des cellules et la longueur du sarcomère n’étaient pas différentes dans les cellules isolées par perfusion ou par tranches de tissus (longueur = 110,0 ± 5,4 μm contre 99,4 ± 3,2 μm, p - 0,05; largeur = 33,9 ± 1,9 μm vs. 30,6 ± 1,2 μm, p - 0,05, pour n = 19 et n = 21 cellules, respectivement; longueur sarcomère = 1,62 ± 0,04 μm vs 1,68 ± 0,04 μm, p = 0,28, n = 24 et n = 23 cellules respectivement) (Figure supplémentaire 2A–C). Utilisation de myocytes chargés Fluo-4 soumis à la stimulation électrique du champ17 des paramètres fonctionnels ont également été évalués (Figure supplémentaire 2D–F). Temps moyen d’activation (27,5 ± 1,5 vs 23,6 ± 2,5 ms, n = 100 vs n = 31 cellules; perfusion vs tranche, p - 0,05) (Figure supplémentaire 2D) et le raccourcissement relatif (12,2 ± 1,1 contre 11,3 ± 2,5 %, n = 42 vs n= 7 cellules, perfusion vs tranche, p - 0,05) (Figure supplémentaire 2F) des cardiomyocytes qui ont répondu à la stimulation ne différaient pas sensiblement entre les deux groupes. L’amplitude transitoire de calcium (ca normalisé maximal2+, F/F0) (Figure supplémentaire 2E) a été légèrement augmenté chez les cardiomyocytes isolés des tranches par rapport aux cardiomyocytes isolés par perfusion (4,9 ± 0,2 contre 5,7 ± 0,3, n = 104 vs n = 25 cellules, perfusion vs tranche, p < 0.05). Although the fraction of rod-shaped cardiomyocytes responding to electrical stimulation was approximately 15% higher in preparations obtained by perfusion, the majority of cells was also excitable in preparations from tissue slices (74.3 ± 4.2% vs. 62.1 ± 2.9%, perfusion vs. slice, p < 0.05, ten fields of view, 452 vs. 276 counted cells, respectively) (Figure supplémentaire 2G). Pour évaluer la qualité cellulaire après culture, le pourcentage de myocytes se contractant en réponse à la stimulation électrique du champ après 48 h dans la culture cellulaire a été déterminé17. La fraction des cellules répondantes a été réduite d’environ la moitié dans les deux groupes (41,9 ± 3,6 % contre 31,5 ± 2,3 %, perfusion vs tranche, p < 0.05, 10 fields of view, n = 371 vs. n = 329 counted cells, respectively) (Figure supplémentaire 2H).

Ensuite, le protocole a été appliqué au myocarde humain. Le nombre de cardiomyocytes ventriculaires humains isolés en forme de tige et viables obtenus à partir de tranches de tissus a été comparé par paires avec le nombre obtenu à partir de morceaux de tissu des mêmes spécimens de myocarde (figure 3). Nous avons constaté que l’isolement des tranches myocardes a donné une grande proportion de tige en forme et seulement une petite proportion de cardiomyocytes arrondis (Figure 3A). Nous avons compté les myocytes en forme de tige à partir d’images à large champ et normalisé leur nombre par le poids humide de tissu employé pour l’isolement. La quantification a montré que l’isolement des tranches myocardiques a entraîné un nombre étonnamment plus élevé de myocytes en forme de tige que l’isolement des morceaux de tissu (45,0 ± 15,0 vs 6,87 ± 5,23 cellules/mg, n = 7 isolements, p < 0,05, apparié t-test à deux queues) (Figure 3B). En outre, la viabilité a été évaluée avec un test de viabilité de MTT14, normalisant l’absorption photométrique de formazan à la quantité totale de protéine dans le lysate de cellule. La quantification photométrique a confirmé une viabilité inocyte sensiblement plus élevée après isolement des tranches myocardes (4,76 ± 0,47 vs 1,09 ± 0,18 UA, n = 3 isolements, p < 0,05, t-test jumelé à deux queues) (Figure 3C).

Au total, la méthode a été appliquée à des spécimens myocardes de 30 cœurs humains avec des temps de transport allant jusqu’à 36 h. De 23 des 30 cellules viables des 30 spécimens ont été obtenus pour des expériences ultérieures (voir également tableau supplémentaire 1). Un exemple d’expérience infructueuse (c.-à-d. <100 cellules par plat) est illustré dans la figure supplémentaire 3. Ici, la plupart des cellules ne toléraient pas le calcium extracellulaire élevé et hypercontracté. Nous avons évalué la contractilité dans les myocytes de 14 isolements, et dans deux cas les cellules n’ont pas répondu à la stimulation électrique. Notez que la technique a non seulement fonctionné avec de grands spécimens obtenus à partir de cœurs adultes, mais aussi avec de petites biopsies (aussi peu que 40 mg) des cœurs d’enfants (Figure supplémentaire 4).

Pour démontrer que les cellules humaines isolées avec le protocole décrit peuvent être soumises à l’analyse structurelle, elles ont été tachées d’alpha-actinine, les protéines de couplage EC de type LCC (LTCC) et le récepteur de la ryanodine (RyR), ainsi que la membrane cellulaire et les noyaux, selon une méthode de coloration décrite récemment dans les myocytes de rat17 (Figure 4). La coloration alpha-actinine a révélé un motif dense et régulier de ligne z et une longueur moyenne de sarcomere de 1,92 ± 0,06 μm dans les cardiomyocytes au repos (n = 4, figure 4A). LTCC et RyR ont montré des grappes claires et ont été, comme prévu, colocalisés près de la membrane cellulaire et des tubules t (figure 4B).

Le colorant potentiométrique FluoVolt18 et le colorant sensible au calcium Fluo-417 ont été utilisés pour démontrer que les cardiomyocytes humains isolés avec le protocole décrit étaient excitables et pouvaient être utilisés pour des études sur l’électrophysiologie cellulaire ou le couplage excitation-contraction (figure 5). La forme et la durée du potentiel d’action (AP) ont été analysées (Figure 5A,B). Les valeurs de 50% et 90% de durée AP (APD50: 400.6 ± 41.1 ms, APD90: 748.9 ± 56.6 ms, n = 10 cellules) étaient dans la gamme rapportée par d’autres pour les cardiomyocytes ventriculaires des coeurs humains défaillants4,6,7,9. Les transitoires de calcium enregistrées par balayage confocal des cellules chargées par Fluo4 (Figure 5C,D) ont montré un coup de pouce clair après la stimulation et un rapport signal/bruit acceptable. L’amplitude transitoire du calcium (maximum F/F0)était de 2,9 ± 0,5 (n = 31 cellules). Le raccourcissement cardiomyocyte par contraction peut être vu dans l’exemple de la déviation de la frontière inférieure de cellule, qui a eu une moyenne de 4.6 ± 0.8% (n = 31 cellules).

Figure 1
Figure 1 : Flux de travail du protocole d’isolement des tranches de tissu cardiaque humain. Les blocs de tissu ou les biopsies du myocarde humain (en haut à gauche) sont incorporés dans de l’agarose à faible point de fusion et des tranches de 300 μm d’épaisseur sont générées avec la lame oscillante d’un vibratome (milieu supérieur). Les tranches sont transférées dans un plat de culture et retirées de l’agarose environnante (en haut à droite). La digestion des tissus est effectuée à ~35 °C et 65 tr/min sur une plaque chauffée et agitée (milieu, gauche) et comprend : (étape 4.8) Incubation dans une solution nominalement sans calcium complétée par de la protéinase, (étape 4.10) Digestion de la matrice extracellulaire avec la collagènease, (étape 5) Dissociation et libération de cardiomyocytes individuels avec des forceps et des pipetages. (étape 6) Augmentation lente de la concentration de calcium extracellulaire de 5 μM à 1,5 mM par intervalles de 5 min. (étape 7) Retrait en toute sécurité du monoxime mécanique non-bucoupleur 2,3-butanedione (BDM). Les cardiomyocytes humains en forme de tige et striés croisés sont récupérés. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Rendements cardiomyocytes de tranche myocardique, de perfusion et d’isolement des morceaux. (A) Micrographes légers représentatifs des cardiomyocytes de rat isolés soit par perfusion coronaire (Perfusion), à partir de tissus coupés au vibratome (tranches de myocarde), soit par des tissus hachés (morceaux de tissus). (B) Parcelles de cytométrie représentatives respectives des isolements de cardiomyocyte décrits dans A. La zone de dispersion latérale (SSC-Area) et la zone de dispersion vers l’avant (FSC-Area) ont été utilisées comme indicateurs de granularité cellulaire et de taille, respectivement. Le schéma de gating de la porte CM1 pour les cardiomyocytes est indiqué par la ligne noire et les fractions respectives du nombre total en pourcentage sont affichées. (C) Moyenne ± erreur standard des fractions de cardiomyocytes (CM1) évaluées par analyse débit-cytométrique décrite dans B à partir de n = 3 isolements cellulaires par groupe. L’isolement des tranches myocardes et des morceaux de tissu a été effectué à partir des mêmes cœurs (t-test jumelé à deux queues). L’isolement par perfusion a été effectué à partir de cœurs entiers de différents animaux et comparé par le t-test non apparié à deux queues. *p < 0,05, après correction de comparaison multiple. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Comparaison du rendement et de la viabilité des cardiomyocytes humains après l’isolement des tranches myocardes et des morceaux de tissu hachés. (A) Image représentative des cardiomyocytes ventriculaires humains tolérants au calcium après isolement des tranches de tissu. Les cardiomyocytes en forme de tige et striés sont prédominants (flèche noire), avec seulement peu de cellules arrondies et hypercontractées (flèche blanche). (B) Quantification de myocytes tolérants au calcium en forme de tige isolés en parallèle, soit à partir de tranches myocardiques, soit de morceaux de tissus comptés à partir de micrographes à large champ et normalisés au poids humide du matériau d’entrée (en milligrammes) à partir de n = 7 isolements appariés. (C) Quantification de la viabilité de cardiomyocyte par mesure photométrique de l’absorption de colorant de formazan après l’essai de MTT. L’absorption a été normalisée à la quantité totale de protéines, évaluée par le test BCA à partir de n = 3 isolements appariés. *p < 0,05, **p < 0,01 (t-test jumelé à deux queues). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Caractérisation microstructurale des cardiomyocytes humains après isolement. (A) Image microscopique confocale représentative après immunostaining de l’alpha-actinine (vert) et tache nucléaire avec 4′,6-diamidin-2-phénylindol (DAPI, bleu). La longueur du sarcomère était de 1,92 ± 0,06 μm (n = 4 myocytes), déterminée par l’analyse du spectre de Fourier. (B) Images microscopiques confocales représentatives d’un cardiomyocyte ventriculaire humain fixe coimmunostained pour le canal de calcium de type L (LTCC) et le récepteur cardiaque de ryanodine (RyR). La superposition de RyR et de LTCC (superposition) et la coloration de la matrice extracellulaire avec l’agglutinine de germe de blé (WGA, magenta) sont également montrées. Les noyaux ont été tachés de DAPI (bleu). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : Potentiel d’action et calcium intracellulaire transitoire dans les myocytes ventriculaires humains. (A) Image confocale bidimensionnelle d’un cardiomyocyte humain isolé chargé du colorant potentiométrique FluoVolt (vert, 488 nm longueur d’onde d’excitation). La boîte rouge indique un élément du système t-tubulaire qui a été mesuré à l’aide d’un balayage de ligne rapide pendant la stimulation électrique du champ à 0,5 Hz. (B) Fluorescence fluovolt moyenne et normalisée de base (F/F0) de cinq potentiels d’action consécutifs obtenus par imagerie confocale comme décrit dans A. (C) Image de balayage de ligne d’un cardiomyocyte humain isolé chargé avec le colorant sensible au calcium Fluo-4 AM (488 nm longueur d’onde d’excitation) le long de l’axe cellulaire longitudinal. L’intensité de la fluorescence est indiquée dans les valeurs grises [UA] et les points bleus indiquent l’augmentation maximale de l’intensité de fluorescence (dF/dtmax)de chaque pixel le long de la ligne numérisée. Le taux d’échantillonnage était de 529 Hz. (D) Calcium transitoire obtenu en faisant la moyenne de la fluorescence de chaque pixel le long de la ligne numérisée de l’image en C et la normalisation aux valeurs de base avant la stimulation (F/F0). Toutes les expériences ont été réalisées à température ambiante. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Nom Composition en mmol/L Suppléments Ph Volume requis en mL
Solution 1 20 KCl, 10 KH2PO4, 10 MgCl2, 10 glucose, 70 acide glutamique, 20 taurin, 10 bêta-hydroxybutyrate, 30 BDM 2 mg/ml d’albumine de sérum bovin 7.3 avec KOH 300
Solution 2 20 KCl, 10 KH2PO4, 10 MgCl2, 10 glucose, 70 acide glutamique, 20 taurin, 10 bêta-hydroxybutyrate, 0,005 CaCl2, 30 BDM 10 mg/ml d’albumine de sérum bovin 7.3 avec KOH 300
Solution 3 20 KCl, 10 KH2PO4, 10 MgCl2, 10 glucose, 70 acide glutamique, 20 taurin, 10 bêta-hydroxybutyrate, 1,5 CaCl2 10 mg/ml d’albumine de sérum bovin 7.3 avec KOH 300
Solution modifiée de Tyrode 130 NaCl, 0,4 NaH2PO4, 5,8 NaHCO3, 5,4 KCl, 0,5 MgCl2, 1,5 CaCl2, 25 HEPES, 22 glucose 2 mg/ml d’albumine de sérum bovin 7.3 avec NaOH à 5 % CO2 100
Solution de coupe 138 NaCl, 0,33 NaH2PO4, 5,4 KCl, 2 MgCl2, 0,5 CaCl2, 10 HEPES, 10 glucose, 30 BDM 7.3 avec NaOH 500

Tableau 1 : Tampons et solutions. Composition des tampons et solutions requis.

Figure supplémentaire 1 : Validation du régime de gating de cardiomyocyte (CM1). Les parcelles de points provenant de la cytométrie du débit, la mesure de la zone de dispersion avant et latérale (FSC-A, SSC-A) indiquant la taille et la granularité des cellules détectées dans un échantillon témoin (CTRL) des cardiomyocytes de rat isolés par perfusion et après incubation de cardiomyocytes de la même préparation pendant 15 min à 37 °C dans la solution de Tyrode modifiée contenant 100 m de calcium (surdosage de calcium). Le calcium extracellulaire élevé provoque l’hypercontraction et l’arrondi des cardiomyocytes en forme de tige, ce qui entraîne une réduction des cellules (87,6 % contre 6,00 %) dans la porte définie (CM1). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce chiffre.

Figure supplémentaire 2 : Caractéristiques de cardiomyocyte isolées par perfusion ou en tranches. La longueur cellulaire (A) et la largeur des cellules (B) ont été déterminées à partir de cardiomyocytes de rat fixés directement après l’isolement par perfusion ou à partir de tranches myocardiques par microscopie (n = 19 et n = 21 cellules, respectivement). La longueur du sarcomère (C)a été déterminée à partir d’images microscopiques après immunostaining avec l’analyse alpha-actinine et Fourier (n = 24 et n = 23 cellules, respectivement). Le temps moyen d’activation (D), le maximum F/F0 (E) et le raccourcissement relatif (F) ont été évalués à partir de fluo-4 cardiomyocytes chargés isolés par perfusion ou à partir de tranches myocardiales et sensibles à la stimulation électrique (n = 100/31 myocytes en D, n = 104/25 myocytes en E et n = 42/7 myocytes en F). La fraction des cardiomyocytes en forme de tige (G) qui se sont contractés sur la stimulation électrique, évaluée en comptant le nombre total de cellules en forme de tige et les cellules contractiles dans dix champs de vue à 200x de grossissement dans un microscope léger standard a été évaluée pour l’isolement de perfusion et de tranche (n = 452/276 cellules, respectivement). (H) Analyse effectuée en G mais après 48 h de culture (n = 371/329 cellules, respectivement). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce chiffre.

Figure supplémentaire 3 : Isolement cardiomyocyte humain avec faible rendement. Image représentative de microscope léger des myocytes d’un isolement avec principalement hypercontracté (bleu) ou arrondi (noir) et seulement quelques cellules en forme de tige et striées (blanc). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce chiffre.

Figure supplémentaire 4 : Isolement cardiomyocyte des biopsies cardiaques infantiles. (A)Image d’une biopsie endomyocardiale (poids humide approximativement 40 mg) obtenue pendant la chirurgie corrective pour la tétralogie de Fallot dans un enfant en bas âge. (B) Tranche myocardique du tissu indiqué dans A, incorporé dans l’agarose. (C) Cardiomyocytes isolés d’une tranche myocardique comme indiqué dans B. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce chiffre.

Tableau supplémentaire 1 : Données sur les patients humains. Une liste du nombre d’échantillons prélevés sur des patients humains inclus dans cette étude est donnée. Les échantillons ont été classés en fonction des types de chirurgie, de l’âge, de l’étiologie de la maladie et du temps de transport, avec le nombre total d’échantillons respectifs et le nombre d’isolements réussis de myocyte. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

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Discussion

Bien que l’isolement des cardiomyocytes vivants ait été établi il y a plus de 40 ans et demeure une condition préalable à de nombreuses approches expérimentales dans la recherche cardiaque, il demeure une technique difficile avec des résultats imprévisibles. L’isolement cardiomyocyte par perfusion des artères coronaires avec solution enzymatique est couramment utilisé pour les cœurs de petits animaux et donne un grand nombre de cellules viables. Toutefois, cela nécessite un système et une expertise relativement complexes. En outre, la plupart des échantillons de tissus humains ne sont pas adaptés à cette méthode, en raison de leur petite taille ou l’absence de branches coronariennes, ce qui rend souhaitables de nouvelles méthodes pour l’isolement des cardiomyocytes humains. Le protocole décrit ici est basé sur la génération atraumatique de fines tranches de tissu cardiaque, qui sont ensuite soumises à la digestion enzymatique. Il peut être appliqué à des spécimens myocardiques provenant de cœurs d’animaux et de myocarde humaine tels que les noyaux aticals provenant de l’implantation d’appareils d’assistance-ventriculaire gauche, les biopsies endomycardiques de la myectomie septale ou les cœurs explantés (voir tableau supplémentaire 1),et produit de manière fiable des quantités suffisantes de cardiomyocytes viables et tolérants au calcium qui peuvent être utilisés pour des expériences ultérieures, comme la culture cardiomyocyte17.

Une raison majeure pour des rendements plus élevés de myocytes des tranches de tissu vibratome-coupé que des morceaux de tissu haché pourrait être un degré inférieur des dommages de myocyte pendant le tranchage. Lorsque la perfusion coronaire n’est pas possible, trancher ou hacher le spécimen de tissu est nécessaire pour augmenter la surface de contact pour digérer les enzymes. Les dimensions de tranches d’environ 8 mm x 8 mm x 0,3 mm permettent un bon accès aux enzymes en raison d’un rapport surface/volume relativement important (~7 mm-1). À l’aide de ciseaux, un rapport surface/volume similaire (~6 mm-1) peut être atteint en minçant les spécimens en petits morceaux d’environ 1 mm x 1 mm x 1 mm. Bien que les dommages de myocyte dans les tranches et les morceaux hachés avant la digestion enzymatique n’ait pas été quantifié, le découpage sur un vibratome cause probablement beaucoup moins de dommages parce qu’il permet la coupe douce dans la direction de fibre. En fait, on a estimé que dans les tranches de vibratome-coupé moins de 5% des myocytes sont endommagés19. Les résultats montrent que les cardiomyocytes humains peuvent être isolés très efficacement avec le protocole fourni, avec une proportion beaucoup plus élevée de cellules viables par rapport aux morceaux de tissu. Ceci est conforme à un protocole qui a utilisé des tranches de tissu auriculaire20. Notre méthode produit jusqu’à 200 myocytes ventriculaires tolérants au calcium par milligramme de tissu et fournit la possibilité de stocker ou de transporter des tissus cardiaques jusqu’à 36 h avant l’isolement. Cela rend le protocole applicable pour les laboratoires sans chirurgie cardiaque sur place et étend ainsi les possibilités de collaborations.

Les étapes critiques du protocole sont le traitement correct du myocarde en tranches sur un vibratome et leur digestion ainsi que les dernières étapes de la réintroduction du calcium et de la lavage de BDM. Contrairement à d’autres méthodes19,21, le tissu cardiaque est incorporé dans l’agarose avec une basse température de fusion pour éviter le mouvement pendant la procédure de tranchage14,15. Ceci était nécessaire pour stabiliser le bloc de tissu et pour produire des tranches uniformes. Lors de l’intégration du tissu, l’agarose doit toujours être liquide, mais la température ne doit pas dépasser 37–38 °C pour éviter les dommages cellulaires par l’hyperthermie. Inversement, si l’agarose est trop froide (<35 °C), elle ne se lie pas bien au bloc tissulaire et peut se briser pendant le tranchage. Pour tester la viabilité des myocytes après le traitement du vibratome, un essai simple de MTT qui permet l’évaluation rapide de la viabilité de cellules par microscopie légère et également pour la quantification par analyse photométrique est suggéré14,22. Des dommages cardiomyocytes peuvent également se produire pendant la réintroduction du calcium extracellulaire après une période d’incubation dans la solution sans calcium23,24. Ce phénomène de paradoxe du calcium dans les cellules isolées peut être atténué par une lente augmentation progressive des niveaux de calcium pour permettre aux cardiomyocytes de s’adapter. Cette étape doit être effectuée avec soin lors d’une agitation continue à 35 °C et avec des intervalles de 5 min. L’hypothermie légère (21 °C) augmente la tolérance au calcium des cardiomyocytes de rat pendant la réintroduction, qui est conforme aux rapports précédents25. Cependant, les cardiomyocytes humains n’ont pas montré de différences majeures dans la tolérance au calcium à 35 °C ou 21 °C. L’utilisation de BDM pendant la coupe, la digestion et la réintroduction du calcium empêche la contraction des myocytes et la dépense d’énergie cellulaire ainsi que l’hypercontraction et est donc protectrice. Cependant, pour les expériences ultérieures évaluant la contractilité cardiaque ou le couplage excitation-contraction, BDM doit être enlevé26. Un lavage progressif a été appliqué pour minimiser des hypercontractions spontanées. BDM peut être omis, mais cela augmentera nettement la quantité de myocytes hypercontractés, comme observé dans les expériences et études précédentes6.

Le protocole décrit utilise une solution qui contient un taux élevé de potassium et seulement des traces de sodium pour la digestion. Cette solution a donné les rendements les plus élevés de cardiomyocytes croisés en forme de tige. Pour la digestion enzymatique, cependant, il a exigé une concentration plus élevée de collagènease (4 mg/mL) par rapport à la digestion dans la solution normale de Tyrode (1.5 mg/mL). Un sodium extracellulaire élevé peut entraîner une surcharge intracellulaire de sodium, exacerbant les effets négatifs du paradoxe du calcium, réduisant ainsi les rendements cellulaires27. Par conséquent, il est suggéré d’utiliser des solutions avec un taux élevé de potassium et de faible teneur en sodium. Une forte concentration de magnésium extracellulaire est fréquemment utilisée dans les protocoles d’isolement cardiomyocyte3,28, et a été montré pour réduire les blessures d’ischémie-reperfusion29,30 et améliorer la fonction cardiaque après de longues périodes d’ischémie froide31. Par conséquent, la solution appliquée ici contient également une forte concentration de magnésium (10 mM). Cependant, il a été démontré que l’excitabilité, la force de contraction et la vitesse de conduction peuvent être réduites par des concentrations élevées de magnésium32. Bien que ces effets se soient révélés réversibles, les effets sur les cardiomyocytes isolés ne peuvent être exclus. Ainsi, l’utilisation du magnésium à des concentrations physiologiques (1–2 mM), pourrait entraîner un rendement global inférieur des cellules, mais améliorer l’excitabilité.

Le temps optimal de digestion est assez variable, car la quantité de matrice extracellulaire ou de fibrose peut varier considérablement dans le myocarde défaillant humain. Si le tissu est encore fermement connecté au moment de la dissociation, avec seulement peu de myocytes viables libérés, l’augmentation du temps de digestion en étapes de 5 min et régulièrement vérifier les myocytes gratuits et la texture des tranches est recommandée. Si le tissu reste non digéré après des périodes prolongées (>45 min), l’augmentation de la concentration de collagènease en étapes de 1 mg/mL ou l’essai d’un lot d’enzymes différent est recommandé16. Les valeurs respectives présentées dans ce travail peuvent servir d’amorce pour un isolement robuste des cardiomyocytes, mais les conditions pour un rendement optimal et la viabilité peuvent être affinées dans chaque laboratoire, en tenant compte de la grande variabilité des activités enzymatiques et des constitutions tissulaires. Un avantage de la méthode est qu’en raison des petites quantités de tissus nécessaires et le flux de travail simple en petits lots, plusieurs tests peuvent être effectués en parallèle. Ainsi, un protocole optimal peut être réalisé rapidement.

La génération de tranches myocardales de haute qualité nécessite un vibratome de haute précision. Le besoin d’un slicer tissulaire de haute précision ou vibratos est un inconvénient possible de la méthode, car il n’est pas facilement disponible dans tous les laboratoires. Le dispositif utilisé pour cette étude est décrit plus en détail ailleurs14,15. Différents appareils ont été utilisés avec succès pour générer des tranches de myocarde par d’autres groupes33,34,35. Par conséquent, si les réglages de la vitesse d’avancement, de l’amplitude de la lame et de la fréquence d’oscillation peuvent être atteints et qu’une orientation horizontale de la lame avec une déviation z inférieure à 0,1 μm est disponible, un tranchage et un isolement réussis devraient être possibles avec d’autres vibromètres. En outre, le tranchage des tissus est élaboré et prolonge considérablement la durée du protocole (environ 1–2 h). L’utilisation de BDM comme agent de découplage mécanique a des effets protecteurs en réduisant l’exposition à l’énergie cellulaire, les lésions ischémiques et l’hypercontraction26,36,37. Bien que l’effet inotrope négatif de BDM s’est avéré être rapidement réversible après lavage38,39, il n’est pas clair si BDM peut avoir des conséquences inconnues sur la fonction cardiomyocyte40. Cette étude montre que les cellules peuvent être isolées avec des rendements élevés après des temps de stockage des tissus allant jusqu’à 36 heures et que les cardiomyocytes humains peuvent être cultivés jusqu’à trois jours après l’isolement avec cette méthode17. Nous n’avons pas remarqué de différences fonctionnelles ou structurelles entre les myocytes avec des temps de stockage courts et longs. Toutefois, cela n’a pas été évalué systématiquement. D’autre part, pour les cœurs de lapin entiers, il a été montré que les différences fonctionnelles entre les cœurs frais et les cœurs exposés à l’ischémie froide dans la solution extracellulaire contenant 30 mM BDM étaient négligeables31, et la même chose peut être vraie dans ce cas.

Le protocole présenté fournit une base solide pour toutes sortes d’expériences avec des cardiomyocytes ventriculaires isolés et pourrait être particulièrement précieux pour la recherche sur les spécimens myocardiaux humains. Avec certaines adaptations, l’isolement d’autres cellules cardiaques, telles que les fibroblastes ou les cellules endothéliales semble également possible41. Comme il ne nécessite que de petites quantités de tissu qui peuvent être expédiés dans une solution de stockage à froid d’autres laboratoires, l’application du protocole peut réduire le nombre d’animaux de laboratoire sacrifiés. En fait, le protocole a été appliqué avec succès au lapin et au tissu cardiaque porcin. En outre, comme les expériences avec des tranches de tissu myocardique cultivé à long terme augmentent21,33,42 et sont constamment améliorées pour fournir des conditions de culture optimales15,43,44, la méthode peut être facilement appliquée après la culture de tranches. L’isolement à cellule unique du myocarde cultivé peut donc aider à caractériser les changements dans les cardiomyocytes après des interventions pharmacologiques ou physiques in vitro.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à révéler.

Acknowledgments

Nous tenons à remercier Andreas Dendorfer du Walter-Brendel-Centre of Experimental Medicine, LMU Munich, pour son aide pour le protocole de découpage. Pour avoir fourni des échantillons de tissus myocardiaux humains, nous tenons à remercier Ghazali Minabari et Christian Heim du Département de chirurgie cardiaque, l’hôpital universitaire d’Erlangen, Hendrik Milting de l’Institut Erich & Hanna Klessmann, Ruhr-University Bochum et Muhannad Alkassar du Département de cardiologie pédiatrique, Hôpital universitaire Erlangen. Pour le soutien avec la cytométrie de flux, nous tenons à remercier Simon Völkl et ses collègues du centre de recherche translationnelle (TRC), Hôpital universitaire d’Erlangen. Nous tenons également à remercier Lorenz McCargo et Céline Grüninger de l’Institut de physiologie cellulaire et moléculaire d’Erlangen pour leur excellent soutien technique.

Ces travaux ont été soutenus par le DZHK (Centre allemand de recherche cardiovasculaire), par le Centre interdisciplinaire de recherche clinique (IZKF) de l’hôpital universitaire de l’Université d’Erlangen-Nürnberg et l’Universitätsbund Erlangen-Nürnberg.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
2,3-butanedionemonoxime Carl Roth 3494.1 Purity>99%
Bovine serum albumin Carl Roth 163.2
CaCl2 Carl Roth 5239.2
Creatine monohydrate Alfa Aesar B250009
Glucose Merck 50-99-7
HEPES Carl Roth 9105.3
KCl Carl Roth P017.1
KH2PO4 Carl Roth 3904.2
L-glutamic acid Fluka Biochemica 49450
Low melting-point agarose Carl Roth 6351.5
MgCl2 x 6H2O Carl Roth A537.1
MgSO4 Sigma Aldrich M-7506
NaCl Carl Roth 9265.1
NaHCO3 Carl Roth 8551.2
Paraformaldehyde Sigma Aldrich P6148
Taurine Sigma Aldrich T8691
Dyes
Di-8-ANEPPS Thermo Fisher Scientific D3167
Fluo-4 AM Thermo Fisher Scientific F14201
FluoVolt Thermo Fisher Scientific F10488
Enzymes
Collagenase CLS type I Worthington LS004196 Used for human tissue at 4 mg/mL
(activity: 280 U/mg)
Collagenase CLS type II Worthington LS004176 Used for rat tissue at 1.5 mg/mL
(activity 330 U/mg)
Protease XIV Sigma Aldrich P8038 Used for rat tissue at 0.5 mg/mL
(activity ≥ 3.5 U/mg)
Proteinase XXIV Sigma Aldrich P5147 Used for human tissue at 0.5 mg/mL
(activity: 7-14 U/mg)
Material
Cell analyzer (LSR Fortessa) BD Bioscience 649225
Centrifuge tube, 15 mL Corning 430790
Centrifuge tube, 50 mL Corning 430829
Compact shaker Edmund Bühler KS-15 B control Agitation direction: horizontal
Disposable plastic pasteur-pipettes Carl Roth EA65.1 For cell trituration use only pipettes with an inner tip diameter ≥2 mm
Forceps FST 11271-30
Heatblock VWR BARN88880030
Nylon net filter, 180 µm Merck NY8H04700
TC Dish 100, Standard Sarstedt 83.3902
TC Dish 35, Standard Sarstedt 83.3900
TC Dish 60, Standard Sarstedt 83.3901
Vibratome (VT1200S) Leica 1491200S001 Includes VibroCheck for infrared-assisted correction of z-deflection

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References

  1. Powell, T., Twist, V. W. A rapid technique for the isolation and purification of adult cardiac muscle cells having respiratory control and a tolerance to calcium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 13, 258-283 (1976).
  2. Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51, 288-298 (2011).
  3. Isenberg, G., Klockner, U. Calcium Tolerant Ventricular Myocytes Prepared by preincubation in a KB Medium. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 395, 6-18 (1982).
  4. Beuckelmann, D. J., Näbauer, M., Erdmann, E. Intracellular calcium handling in isolated ventricular myocytes from patients with terminal heart failure. Circulation. 85, 1046-1055 (1992).
  5. Brixius, K., Hoischen, S., Reuter, H., Lasek, K., Schwinger, R. H. G. Force/shortening-frequency relationship in multicellular muscle strips and single cardiomyocytes of human failing and nonfailing hearts. Journal of Cardiac Failure. 7, 335-341 (2001).
  6. Peeters, G. A., et al. Method for isolation of human ventricular myocytes from single endocardial and epicardial biopsies. The American Journal of Physiology. 268, 1757-1764 (1995).
  7. Coppini, R., et al. Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples. Journal of Visualized Experiments. (86), e51116 (2014).
  8. Seidel, T., et al. Sheet-Like Remodeling of the Transverse Tubular System in Human Heart Failure Impairs Excitation-Contraction Coupling and Functional Recovery by Mechanical Unloading. Circulation. 135, 1632-1645 (2017).
  9. Hartmann, N., et al. Antiarrhythmic effects of dantrolene in human diseased cardiomyocytes. Heart Rhythm. 14, 412-419 (2017).
  10. Bkaily, G., Sperelakis, N., Doane, J. A new method for preparation of isolated single adult myocytes. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 247, 1018-1026 (1984).
  11. Trube, G. Enzymatic Dispersion of Heart and Other Tissues. Single-Channel Recording. Sakmann, B., Neher, E. , Springer. Boston, MA. 69-76 (1983).
  12. Schlüter, K. D., Schreiber, D. Adult Ventricular Cardiomyocytes. Basic Cell Culture Protocols. 290, 305-314 (2004).
  13. Del Monte, F., et al. Restoration of contractile function in isolated cardiomyocytes from failing human hearts by gene transfer of SERCA2a. Circulation. 100, 2308-2311 (1999).
  14. Brandenburger, M., et al. Organotypic slice culture from human adult ventricular myocardium. Cardiovascular Research. 93, 50-59 (2012).
  15. Fischer, C., et al. Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro. Nature Communications. 10, (2019).
  16. Worthington-Biochemical. Worthington Tissue Dissociation Guide. , Available from: http://www.worthington-biochem.com/tissuedissociation/default.html (2019).
  17. Seidel, T., et al. Glucocorticoids preserve the t-tubular system in ventricular cardiomyocytes by upregulation of autophagic flux. Basic Research in Cardiology. 114 (6), 47 (2019).
  18. Lipsett, D. B., et al. Cardiomyocyte substructure reverts to an immature phenotype during heart failure. Journal of Physiology. 597, 1833-1853 (2019).
  19. Watson, S. A., et al. Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals. Nature Protocols. 12, 2623-2639 (2017).
  20. Guo, G. R., et al. A modified method for isolation of human cardiomyocytes to model cardiac diseases. Journal of Translational Medicine. 16, 1-9 (2018).
  21. Kang, C., et al. Human Organotypic Cultured Cardiac Slices: New Platform For High Throughput Preclinical Human Trials. Scientific Reports. 6, 1-13 (2016).
  22. Gomez, L. A., Alekseev, A. E., Aleksandrova, L. A., Brady, P. A., Terzic, A. Use of the MTT assay in adult ventricular cardiomyocytes to assess viability: Effects of adenosine and potassium on cellular survival. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 29, 1255-1266 (1997).
  23. Zimmerman, A. N. E., Hülsmann, W. C. Paradoxical influence of calcium ions on the permeability of the cell membranes of the isolated rat heart. Nature. 211, 646-647 (1966).
  24. Piper, H. M. The calcium paradox revisited An artefact of great heuristic value. Cardiovascular Research. 45, 123-127 (2000).
  25. Boink, A. B. T. J., Ruigrok, T. J. C., de Moes, D., Maas, A. H. J., Zimmerman, A. N. E. The effect of hypothermia on the occurrence of the calcium paradox. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 385, 105-109 (1980).
  26. Mulieri, L. A., Hasenfuss, G., Ittleman, F., Blanchard, E. M., Alpert, N. R. Protection of human left ventricular myocardium from cutting injury with 2,3-butanedione monoxime. Circulation Research. 65, 1441-1444 (1989).
  27. Busselen, P. Effects of sodium on the calcium paradox in rat hearts. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 408, 458-464 (1987).
  28. Voigt, N., Zhou, X. B., Dobrev, D. Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+Transients and Membrane Currents. Journal of Visualized Experiments. (77), e50235 (2013).
  29. Leor, J., Kloner, R. An Experimental Model Examining the Role of Magnesium in the Therapy of Acute Myocardial Infarction. The American Journal of Cardiology. 75, 1292-1293 (1995).
  30. Herzog, W. R., et al. Timing of Magnesium Therapy Affects Experimental Infarct Size. Circulation. 92, 2622-2626 (1995).
  31. Stringham, J. C., Paulsen, K. L., Southard, J. H., Mentzer, R. M., Belzer, F. O. Forty-hour preservation of the rabbit heart: Optimal osmolarity, [Mg2+], and pH of a modified UW solution. The Annals of Thoracic Surgery. 58, 7-13 (1994).
  32. Hall, S. K., Fry, C. H. Magnesium affects excitation, conduction, and contraction of isolated mammalian cardiac muscle. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 263 (2), Pt 2 622-633 (1992).
  33. Bussek, A., et al. Tissue Slices from Adult Mammalian Hearts as a Model for Pharmacological Drug Testing. Cellular Physiology and Biochemistry. 24, (2009).
  34. Wang, K., et al. Living cardiac tissue slices: An organotypic pseudo two-dimensional model for cardiac biophysics research. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 115, 314-327 (2014).
  35. Thomas, R. C., et al. A Myocardial Slice Culture Model Reveals Alpha-1A-Adrenergic Receptor Signaling in the Human Heart. Journal of the American College of Cardiology: Basic to Translational Science. 1, 155-167 (2016).
  36. Perreault, C. L., et al. Cellular basis of negative inotropic effect of 2,3-butanedione monoxime in human myocardium. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 263, 503-510 (1992).
  37. Vahl, C. F., Bonz, A., Hagl, C., Hagl, S. Reversible desensitization of the myocardial contractile apparatus forcalcium: A new concept for improving tolerance to cold ischemia in human myocardium. European Journal of Cardio-thoracic Surgery. 8, 370-378 (1994).
  38. Horiuti, K., et al. Mechanism of action of 2, 3-butanedione 2-monoxime on contraction of frog skeletal muscle fibres. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 9, 156-164 (1988).
  39. Li, T., Sperelakis, N., Teneick, R. E., Solaro, R. J. Effects of diacetyl monoxime on cardiac excitation-contraction coupling. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 232, 688-695 (1985).
  40. Sellin, L. C., Mcardle, J. J. Multiple Effects of 2,3 Butanedione Monoxime. Pharmacology and Toxicology. 74, 305-313 (1993).
  41. Eghbali-Webb, M., Agocha, A. E. A simple method for preparation of cultured cardiac fibroblasts from adult human ventricular tissue. Novel Methods in Molecular and Cellular Biochemistry of Muscle. Pierce, G. N., Claycomb, W. C. , Springer US. 195-198 (1997).
  42. Camelliti, P., et al. Adult human heart slices are a multicellular system suitable for electrophysiological and pharmacological studies. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51, 390-398 (2011).
  43. Watson, S. A., et al. Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro. Nature Communications. 10, 2168 (2019).
  44. Watson, S. A., Terracciano, C. M., Perbellini, F. Myocardial Slices: an Intermediate Complexity Platform for Translational Cardiovascular Research. Cardiovascular Drugs and Therapy. 33, 239-244 (2019).

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Biologie numéro 159 humain insuffisance cardiaque tranches myocardiques isolement cardiomyocyte vibratome myocytes contractiles imagerie calcique couplage excitation cardiaque-contraction
Isolement des cardiomyocytes ventriculaires humains des tranches myocardales vibratoires-cut
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Fiegle, D. J., Volk, T., Seidel, T.… More

Fiegle, D. J., Volk, T., Seidel, T. Isolation of Human Ventricular Cardiomyocytes from Vibratome-Cut Myocardial Slices. J. Vis. Exp. (159), e61167, doi:10.3791/61167 (2020).

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