Sunulan vibratome kesilmiş miyokardiyal dilimlerden insan ve hayvan ventriküler kardiyomiyosit izolasyon için bir protokoldür. Kalsiyuma dayanıklı hücrelerin yüksek verimi (200 hücre/mg’a kadar) az miktarda dokudan (<50 mg) elde edilebilir. Protokol soğuk iskemiye maruz kalan miyokardiyum için 36 saate kadar geçerlidir.
Ventriküler kardiyak miyositlerin hayvan ve insan kalplerinden izole edilmesi kardiyak araştırmalarda temel bir yöntemdir. Hayvan kardiyomiyositler genellikle sindirim enzimleri ile koroner perfüzyon ile izole edilir. Ancak, insan kardiyomiyositleri izole etmek zordur çünkü insan miyokardiyal numuneler genellikle koroner perfüzyona izin vermez ler ve alternatif izolasyon protokolleri canlı hücrelerin verimlerinin düşük olmasıyla sonuçlanır. Buna ek olarak, insan miyokardiyal örnekler nadirdir ve sadece düzenli olarak yerinde kalp cerrahisi olan kurumlarda mevcuttur. Bu da bulguların hayvandan insan kardiyomiyositlerine çevrilmesini engellemektedir. Burada açıklanan insan ve hayvan miyokardiyum ventriküler miyositlerin verimli izolasyon sağlayan güvenilir bir protokoldür. Hücre hasarını en aza indirirken yüzey-hacim oranını artırmak için miyokard doku dilimleri 300 m kalınlığında miyokardiyal örneklerden vibratom ile üretilir. Doku dilimleri daha sonra proteaz ve kollajenaz ile sindirilir. Sıçan miyokardiyum protokolü kurmak ve akış-sitometrik hücre sayımı ile uygulanabilir, kalsiyuma dayanıklı miyositlerin verimlerini ölçmek için kullanılmıştır. Yaygın olarak kullanılan doku-öbek yöntemi ile karşılaştırıldığında çubuk şekilli kardiyomiyositlerin (41.5 ± 11.9 vs. %7.89 ± %3.6, p < 0.05) önemli ölçüde daha yüksek verimi saptandı. Protokol, verimin fare miyokardiyumundakine benzer olduğu ve yine doku-öbek yöntemine göre belirgin bir şekilde daha yüksek olduğu başarısız ve başarısız olmayan insan miyokardiyumuna çevrildi (45.0 ± 15.0 vs. 6.87 ± 5.23 hücre/mg, p < 0.05). Özellikle sunulan protokol ile makul sayıda insan kardiyomiyositini (9-200 hücre/mg) az miktarda dokudan (<50 mg) izole etmek mümkündür. Bu nedenle, yöntem hem insan hem de hayvan kalplerinden sağlıklı ve başarısız miyokardiçin geçerlidir. Ayrıca, soğuk kardiyoplejik solüsyonda 36 saate kadar saklanan insan doku örneklerinden uyarılabilir ve kontraktil miyositleri izole etmek mümkündür ve bu yöntem, yerinde kalp ameliyatı olmayan kurumlardaki laboratuvarlar için özellikle yararlı hale getirilmektedir.
Kardiyomiyosit fizyolojisi içine önemli anlayışlar için yol açtı bir seminal tekniği bozulmamış kalplerden yaşayan ventriküler kardiyomiyositizolasyonolduğunu 1. İzole kardiyomiyositler normal hücresel yapı ve fonksiyon, ya da in vivo deneylerin sonuçlarını incelemek için kullanılabilir; örneğin, kardiyak hastalığın hayvan modellerinde hücresel elektrofizyoloji veya uyarma-daralma kaplin değişiklikleri değerlendirmek için. Ayrıca, izole kardiyomiyositler hücre kültürü, farmakolojik müdahaleler, gen transferi, doku mühendisliği ve diğer birçok uygulama için kullanılabilir. Bu nedenle, kardiyomiyosit izolasyonu için etkili yöntemler temel ve çevirisel kardiyak araştırmalar için temel değere dayanır.
Kemirgenler gibi küçük memelilerden ve domuz lar veya köpekler gibi daha büyük memelilerden gelen kardiyomiyositler, genellikle kalbin koroner perfüzyonu ile ham kollajenler ve/veya proteazlar içeren çözeltiler ile izole edilir. Bu kardiyomiyosit izolasyoniçin “altın standart” yöntemi olarak tarif edilmiştir, canlı hücrelerin% 70’e kadar verimleri sonuçlanan2. Yaklaşım aynı zamanda kabul edilebilir kardiyomiyosit verimleri 33sonuçlanan,insan kalpleri ile kullanılmıştır ,4,5. Ancak, koroner perfüzyon sadece sağlam kalp veya koroner arter dalı içeren büyük bir miyokardkin kama mevcut olduğunda mümkün olduğundan, çoğu insan kardiyak örnekleri küçük boyutu ve uygun vaskülatür eksikliği nedeniyle bu yaklaşım için uygun değildir. Bu nedenle, insan kardiyomiyositizolasyon zordur.
İnsan miyokardiyal örnekler çoğunlukla değişken boyutta doku parçaları oluşur (yaklaşık 0.5 x 0.5 x 0.5 cm için 2 x 2 x 2 cm), endomiyokardiyal biyopsiler ile elde6, septal miektomiler7, VAD implantasyonları8, veya eksplant kalpler9. Kardiyomiyosit izolasyonu için en yaygın prosedürler makas veya neşter kullanarak doku kıyma ile başlar. Hücre-hücre temasları daha sonra kalsiyumsuz veya düşük kalsiyum tamponlar daldırma tarafından bozulur. Bunu, proteazlar (örneğin, tripsin), kollajenaz, hyaluronidaz veya elastaz gibi ham enzim ekstreleri veya saflaştırılmış enzimler ile birden fazla sindirim adımı takip eder ve bu da ekstrasellüler matriksin parçalanması ve kardiyomiyositlerin serbestleşmesiile sonuçlanır. Son, kritik bir adımda, fizyolojik kalsiyum konsantrasyonu dikkatle restore edilmelidir, ya da hücresel hasar kalsiyum-paradoks10nedeniyle oluşabilir,11,12. Bu izolasyon yaklaşımı kullanışlıdır ancak genellikle verimsizdir. Örneğin, bir çalışmada yaklaşık 1 g miyokardiyal doku sonraki deneyler için uygun kardiyomiyosit yeterli sayıda elde etmek için gerekli olduğunu bulundu13. Düşük verim için olası bir nedeni doku kıyma nispeten sert bir yöntemdir. Bu miyositler enzimatik sindirim tarafından serbest olma olasılığı en yüksek olmasına rağmen bu özellikle yığın kenarlarında bulunan kardiyomiyositler zarar verebilir.
İnsan örneklerinden elde edilen hücrelerin izolasyon verimliliğini ve kalitesini etkileyebilecek bir diğer husus da doku iskemi süresidir. Çoğu protokol, iyi sonuçlar için bir ön koşul olarak laboratuvara kısa ulaşım süreleri söz. Bu, insan ventriküler kardiyomiyositlerin çalışmasını yakındaki kalp cerrahisi tesisleri olan laboratuvarlarla sınırlandırmaktadır. Birlikte, bu kısıtlamalar insan kardiyomiyositlerde hayvan modellerinden elde edilen önemli bulguların doğrulanmasını engellemektedir. Bu nedenle, düşük miktarda dokudan yüksek kardiyomiyosit verimi sağlayan, tercihen uzun taşıma sürelerinden sonra ciddi hasar olmadan geliştirilmiş izolasyon protokolleri tercih edilir.
Burada açıklanan bir vibratom14,,15ile oluşturulan ince miyokard doku dilimleri enzimatik sindirim dayalı bir izolasyon protokolüdür. Doku dilimlerinden izolasyonun makasla doğrama dan çok daha verimli olduğunu gösteriyoruz. Açıklanan yöntem sadece miyokard dokusunun küçük miktarlarda canlı insan kardiyomiyosityüksek verimleri için izin verir ama aynı zamanda depolanan veya soğuk kardiyoplejik çözelti taşınan örnekler için de geçerlidir 36 saat.
Yaşayan kardiyomiyositlerin izolasyonu 40 yıldan daha uzun bir süre önce kurulmuş ve kardiyak araştırmalarda birçok deneysel yaklaşım için ön koşul olmasına rağmen, öngörülemeyen sonuçları olan zor bir teknik olmaya devam etmektedir. Enzim çözeltisi ile koroner arterlerin perfüzyon yoluyla kardiyomiyosit izolasyon yaygın küçük hayvanların kalpleri için kullanılan ve canlı hücrelerin çok sayıda verimleri. Ancak, bu nispeten karmaşık bir sistem ve uzmanlık gerektirir. Ayrıca, çoğu in…
The authors have nothing to disclose.
Walter-Brendel Deneysel Tıp Merkezi, LMU Münih’ten Andreas Dendorfer’e dilimleme protokolüile ilgili yardımları için teşekkür ederiz. İnsan miyokardiyal doku örnekleri sağlamak için Kalp Cerrahisi Bölümü’nden Gazali Minabari ve Christian Heim’a, Erlangen Üniversitesi Hastanesi’nden, Erlangen Üniversitesi’nden Hendrik Milting’e, Erich & Hanna Klessmann Enstitüsü’nden Hendrik Milting’e, Ruhr-Üniversitesi Bochum’a ve Erlangen Üniversitesi Hastanesi Çocuk Kardiyoloji Bölümü’nden Muhannad Alkassar’a teşekkür ederiz. Akış sitometrisi desteği için Simon Völkl’e ve Çeviri Araştırma Merkezi’nden (TRC), Erlangen Üniversitesi Hastanesi’nden meslektaşlarımıza teşekkür ederiz. Ayrıca, Hücresel ve Moleküler Fizyoloji Erlangen Enstitüsü’nden Lorenz McCargo ve Celine Grüninger’e mükemmel teknik destek için teşekkür ederiz.
Bu çalışma, Erlangen-Nürnberg Üniversitesi Üniversitesi Hastanesi’ndeki Disiplinlerarası Klinik Araştırma Merkezi (IZKF) ve Universitätsbund Erlangen-Nürnberg tarafından DZHK (Alman Kardiyovasküler Araştırma Merkezi) tarafından desteklenmiştir.
Chemicals | |||
2,3-butanedionemonoxime | Carl Roth | 3494.1 | Purity>99% |
Bovine serum albumin | Carl Roth | 163.2 | |
CaCl2 | Carl Roth | 5239.2 | |
Creatine monohydrate | Alfa Aesar | B250009 | |
Glucose | Merck | 50-99-7 | |
HEPES | Carl Roth | 9105.3 | |
KCl | Carl Roth | P017.1 | |
KH2PO4 | Carl Roth | 3904.2 | |
L-glutamic acid | Fluka Biochemica | 49450 | |
Low melting-point agarose | Carl Roth | 6351.5 | |
MgCl2 x 6H2O | Carl Roth | A537.1 | |
MgSO4 | Sigma Aldrich | M-7506 | |
NaCl | Carl Roth | 9265.1 | |
NaHCO3 | Carl Roth | 8551.2 | |
Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
Taurine | Sigma Aldrich | T8691 | |
Dyes | |||
Di-8-ANEPPS | Thermo Fisher Scientific | D3167 | |
Fluo-4 AM | Thermo Fisher Scientific | F14201 | |
FluoVolt | Thermo Fisher Scientific | F10488 | |
Enzymes | |||
Collagenase CLS type I | Worthington | LS004196 | Used for human tissue at 4 mg/mL (activity: 280 U/mg) |
Collagenase CLS type II | Worthington | LS004176 | Used for rat tissue at 1.5 mg/mL (activity 330 U/mg) |
Protease XIV | Sigma Aldrich | P8038 | Used for rat tissue at 0.5 mg/mL (activity ≥ 3.5 U/mg) |
Proteinase XXIV | Sigma Aldrich | P5147 | Used for human tissue at 0.5 mg/mL (activity: 7-14 U/mg) |
Material | |||
Cell analyzer (LSR Fortessa) | BD Bioscience | 649225 | |
Centrifuge tube, 15 mL | Corning | 430790 | |
Centrifuge tube, 50 mL | Corning | 430829 | |
Compact shaker | Edmund Bühler | KS-15 B control | Agitation direction: horizontal |
Disposable plastic pasteur-pipettes | Carl Roth | EA65.1 | For cell trituration use only pipettes with an inner tip diameter ≥2 mm |
Forceps | FST | 11271-30 | |
Heatblock | VWR | BARN88880030 | |
Nylon net filter, 180 µm | Merck | NY8H04700 | |
TC Dish 100, Standard | Sarstedt | 83.3902 | |
TC Dish 35, Standard | Sarstedt | 83.3900 | |
TC Dish 60, Standard | Sarstedt | 83.3901 | |
Vibratome (VT1200S) | Leica | 1491200S001 | Includes VibroCheck for infrared-assisted correction of z-deflection |