Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

בידוד של קרדיומיוציטים חדריים אנושיים מפרוסות שריר הלב ויסטום-לחתוך

Published: May 10, 2020 doi: 10.3791/61167
Automatic Translation
1, 1,2, 1,2
1Institute of Cellular and Molecular Physiology, Friedrich-Alexander University Erlangen-Nürnberg, 2Muscle Research Center Erlangen (MURCE), Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

Summary

מוצג הוא פרוטוקול לבידוד של קרדיומיוציטים חדריים אנושיים ובעלי חיים מפרוסות שריר הלב לחתוך vibratome. תפוקות גבוהות של תאים סובלניים סידן (עד 200 תאים / מ"ג) ניתן להשיג כמויות קטנות של רקמה (<50 מ"ג). הפרוטוקול ישים על שריר הלב החשוף לאישמיה קרה עד 36 שעות.

Abstract

הבידוד של מיוציטים לבביים חדריים מלב בעלי חיים ולבבות אנושיים היא שיטה בסיסית במחקר לב. קרדיומיוציטים בעלי חיים מבודדים בדרך כלל על ידי עירוי כלילית עם אנזימי עיכול. עם זאת, בידוד cardiomyocytes אנושי הוא מאתגר כי דגימות שריר הלב האנושי בדרך כלל אינם מאפשרים זינגה כלילית, פרוטוקולי בידוד חלופי לגרום לתשואות נמוכות של תאים קיימא. בנוסף, דגימות שריר הלב האנושי הן נדירות ותו זמינות רק באופן קבוע במוסדות עם ניתוח לב באתר. זה פוגע בתרגום של ממצאים מהחיות לקרדיומיוציטים אנושיים. מתואר כאן הוא פרוטוקול אמין המאפשר בידוד יעיל של מיוציטים חדריים מגוף שריר הלב אנושי ובעלי חיים. כדי להגדיל את יחס פני השטח לנפח תוך מזעור נזק לתא, רקמת שריר הלב פרוסות 300 μm עבה נוצרים מדגימות שריר הלב עם ויברטום. פרוסות רקמות מתעכלות לאחר מכן עם פרוטאז וcollagenase. עכברוש שריר הלב שימש כדי לבסס את הפרוטוקול ולכרות את התשואות של מיוציטים קיימא, סידן סובלני על ידי ספירת תאים ציטומטרי זרימה. השוואה עם שיטת נתח רקמות הנפוץ הראה תשואות גבוהות באופן משמעותי של cardiomyocytes בצורת מוט (41.5 ± 11.9 לעומת 7.89 ± 3.6%, p < 0.05). הפרוטוקול תורגם לכישלון ולא נכשל שריר הלב האנושי, שם התשואות היו דומות כמו שריר הלב חולדה, ושוב, גבוה באופן ניכר מאשר עם שיטת נתח רקמות (45.0 ± 15.0 לעומת 6.87 ± 5.23 תאים / מ"ג, p < 0.05). במיוחד, עם הפרוטוקול שהוצג ניתן לבודד מספרים סבירים של cardiomyocytes אנושי קיימא (9-200 תאים / מ"ג) מכמויות מינימליות של רקמה (<50 מ ג). לפיכך, השיטה ישימה על שריר הלב בריא ונכשל הן מלבבות האדם והן מלב בעלי החיים. יתר על כן, ניתן לבודד מיוציטים מרגשים והתכווצות מדגימות רקמות אנושיות המאוחסנים עד 36 שעות בתמיסה קרדיופלגית קרה, מה שהופך את השיטה שימושית במיוחד עבור מעבדות במוסדות ללא ניתוח לב באתר.

Introduction

טכניקה שסללה את הדרך לתובנות חשובות על פיזיולוגיה cardiomyocyte היא הבידוד של cardiomyocytes חדרי חיים מלבבות שלמים1. cardiomyocytes מבודד יכול לשמש כדי ללמוד מבנה תאי נורמלי ותפקוד, או את ההשלכות של ניסויי vivo; לדוגמה, כדי להעריך שינויים אלקטרופיזיולוגיה תאית או צימוד התכווצות-ריתוך במודלים של בעלי חיים של מחלות לב. בנוסף, cardiomyocytes מבודד יכול לשמש עבור תרבות תאים, התערבויות תרופתיות, העברת גנים, הנדסת רקמות, ויישומים רבים אחרים. לכן, שיטות יעילות לבידוד cardiomyocyte הן בעל ערך בסיסי למחקר לב בסיסי ותרגום.

קרדיומיוציטים מיונקים קטנים, כגון מכרסמים, ומיונקים גדולים יותר, כגון חזירים או כלבים, מבודדים בדרך כלל על ידי תסיסה כלילית של הלב עם פתרונות המכילים קולאזנס גולמי ו/או פרוטאזים. זה תואר כשיטה "תקן זהב" לבידוד cardiomyocyte, וכתוצאה מכך תשואות של עד 70% של תאים קיימא2. הגישה שימשה גם עם לב אנושי, וכתוצאה מכך ניבים cardiomyocyteמקובל 3,,4,5. עם זאת, מכיוון שזמיה כלילית אפשרית רק אם הלב השלם או טריז שריר הלב הגדול המכיל ענף עורק כלילי זמין, רוב דגימות הלב האנושיות אינן מתאימות לגישה זו בשל גודלן הקטן והיעדר כלי דם מתאימים. לכן, הבידוד של קרדיומיוציטים אנושיים הוא מאתגר.

דגימות שריר הלב האנושי מורכבות בעיקר נתחי רקמה בגודל משתנה (כ 0.5 x 0.5 x 0.5 ס"מ עד 2 x 2 ס"מ), שהושגו באמצעות ביופסיות אנדומיוקרדיאליות6, myectomiesמחיצה 7, השתלות VAD8, אומלבבות מושתלים 9. ההליכים הנפוצים ביותר לבידוד cardiomyocyte להתחיל עם טחינה הרקמה באמצעות מספריים או אזמל. מגעים מתא לתא משובשים לאחר מכן על ידי טבילה במאגרי סידן או סידן נמוך. זה מלווה שלבי עיכול מרובים עם תמציות אנזים גולמי או אנזימים מטוהרים כמו פרוטאזים (למשל, שלושה נסיפסין), קולגן, היאלורונידאז, או אלסטאז, וכתוצאה מכך התפוררות של מטריצה חוץ תאית ושחרור של קרדיומיוציטים. בשלב סופי וקריטי, יש לשחזר בזהירות ריכוז סידן פיזיולוגי, או שנגרם נזק תאי בשל פרדוקסהסידן 10,,11,,12. גישת בידוד זו נוחה אך בדרך כלל לא יעילה. לדוגמה, מחקר אחד מצא כי כמעט 1 גרם של רקמת שריר הלב נדרש כדי להשיג מספר מספיק של cardiomyocytes מתאים לניסויים הבאים13. סיבה אפשרית לתשואות נמוכות היא השיטה הקשה יחסית של טחנת הרקמה. זה עלול לגרום נזק במיוחד cardiomyocytes ממוקם בשולי הנתח למרות מיוציטים אלה נוטים ביותר להשתחרר על ידי עיכול אנזימטי.

היבט נוסף שעשוי להשפיע על יעילות הבידוד ואיכות התאים המתקבלים מדגימות אנושיות הוא משך הזמן של איסכמיה של רקמות. רוב הפרוטוקולים מזכירים זמני הובלה קצרים למעבדה כתור מוקדם לתוצאות טובות. זה מגביל את המחקר של קרדיומיוציטים חדריים אנושיים למעבדות עם מתקני ניתוח לב בקרבת מקום. יחד, הגבלות אלה פוגעות באימות ממצאים חשובים ממודלים של בעלי חיים בקרדיומיוציטים אנושיים. פרוטוקולי בידוד משופרים המאפשרים תפוקות קרדיומיוציט גבוהות מכמויות קטנות של רקמות, רצוי ללא נזק רציני לאחר זמני הובלה ממושכים, ולכן רצויים.

מתואר כאן פרוטוקול בידוד המבוסס על העיכול האנזימטי של פרוסות רקמת שריר הלב דקה שנוצר עם vibratome14,15. אנו מוכיחים כי בידוד מפרוסות רקמות הוא הרבה יותר יעיל מזה מחתיכות רקמה טחון עם מספריים. השיטה המתוארת לא רק מאפשרת תפוקה גבוהה של cardiomyocytes אנושי קיימא מכמויות קטנות של רקמת שריר הלב, אלא גם ישימה דגימות המאוחסנות או מועברות בתמיסה קרדיופלגית קרה עד 36 שעות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הניסויים בחולדות אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים ושימוש Mittelfranken, בוואריה, גרמניה. איסוף ושימוש בדגימות רקמת לב אנושית אושר על ידי ועדות הביקורת המוסדיות של אוניברסיטת ארנגן-נירנברג ואוניברסיטת רוהר בוכום. מחקרים נערכו על פי הנחיות הצהרת הלסינקי. המטופלים נתנו את הסכמתם הכתובה לפני איסוף רקמות.

חולדות Wistar נקבה (150-200 גרם) הושגו מסחרית, מותאם על ידי הזרקת 100 מ"ג/ק"ג של תיופנטל נתרן תוך-פריצינלי, והמתת חסד על ידי נקע צוואר הרחם ואחריו ניקור חזה וחתך של הלב. דגימות רקמת לב אנושית נאספו מהליבה השמאלית-חדרית במהלך השתלת מכשירי סיוע מכניים, מניתוח מיסטרה של מחיצה, מטטרולוגיה של ניתוח מתקן של פאלוט, או מקיר החדר השמאלי החופשי של לבבות שנשתלו. הפרוטוקול הבא מתאר את הבידוד מרקמות חדר האדם. הבידוד של קרדיומיוציטים חולדה בוצע בהתאם, אבל עם אנזימים שונים (ראה טבלת חומרים). זרימת עבודה סכמטית של הפרוטוקול מאוירת באות 1.

1. הכנת מאגרים, פתרונות ואנזימים

  1. הכן מאגרים ופתרונות כמפורט בטבלה 1.
  2. מחממים פתרונות 1, 2, 3 והפתרון של Tyrode ששונה ל- 37°C. אחסן את פתרון החיתוך ב- 4 °C עד לשימוש.
    הערה: עבור 1-2 פרוסות שריר הלב בסך הכל כ 15 מ"ל, 8 מ"ל, ו 5 מ"ל של פתרונות 1, 2, ו 3 נדרשים לבידוד בצלחת אחת 35 מ"מ תרבות רקמות. קנה מידה בהתאם לבידודים בו-זמנית במנות מרובות. פתרון חיתוך ניתן להקפיא ולהיות כל הזמן ב -20 מעלות צלזיוס במשך מספר חודשים.
  3. לשקול 1 מ"ג של חלבון XXIV (ראה טבלת חומרים)לתוך צינור צנטריפוגה 15 מ"ל prechilled ולאחסן על קרח עד לשימוש. זה לעיבוד מדגם אחד. להגדיל את הסכום בהתאם. אין לערבב את החלבונים ואת הקולגן.
  4. לשקול 8 מ"ג של קולגן CLSI (ראה טבלת חומרים)לתוך צינור צנטריפוגה 15 מ"ל prechilled ולאחסן על קרח עד לשימוש. זה לעיבוד מדגם אחד. להגדיל את הסכום בהתאם. אין לערבב את החלבונים ואת הקולגן.
    התראה: תחבשו מסכת פנים או תעבדו מתחת למכסה מנוע אדים כדי למנוע שאיפת אבקת אנזימים.
    הערה: פעילות האנזימים עשויה להשתנות בהמון שונה. לכן, הריכוז האופטימלי עשוי להיות שונה ויש לקבוע עם כל אנזים שנרכש לאחרונה16.

2. אחסון והובלה של רקמת שריר הלב

  1. לאחסן ולהעביר דגימות לב אנושיות בקירור, 4 ° C חיתוך פתרון(שולחן 1).
  2. השתמש באותו פתרון לעיבוד רקמות נוסף וחיתוך ויברטום.
    הערה: ביופסיות ודגימות לב כירורגיות יש להעביר באופן מיידי לפתרון חיתוך ב 4 °C ולאחר מכן ניתן לאחסן או להעביר ב 4 ° C לכל היותר 36 שעות לפני היישום של פרוטוקול זה.

3. עיבוד וחיתוך של הרקמה

הערה: הפרוטוקול לחיתוך רקמות עוקב פישר ואח'15.

  1. גזירה של בלוק הרקמה
    התראה: רקמת לב אנושית עלולה להיות מדבקת. השתמש תמיד בבגדי מגן ובצע את תקנות הבטיחות של המוסד שלך. לטפל בזהירות להבים בשימוש להשליך במכולות בטיחות.
    1. מניחים את הדגימה בצלחת תרבות רקמות של 100 מ"מ מלאה בתמיסת חיתוך קרה של 20 מ"ל ולשמור על צלחת מקורר של 4 מעלות צלזיוס.
    2. הסר עודפי רקמה פיברוטית ושומן אפיארדיאלי עם אזמל. במקרה של דגימה transmural, להסיר שכבות trabeculae ורקמות ליד אנדוקארדיום.
      הערה: רקמה פיברוטית נוקשה ומופיעה לבנה. שומן הוא בדרך כלל רך ומופיע לבן לצהוב. שכבות טרבקולה ורקמות אנדוקרדיאליות ניתן לזהות מהרכב הרקמה הרופפת שלהם וכיוון סיבים לא מיושר בהשוואה שריר הלב של שכבות epicardial
    3. לעיבוד ויברטום אופטימלי, לחתוך בלוקים רקמה מלבנית של כ 8 מ"מ x 8 מ"מ x 8 מ"מ עם אזמל מדגימה רקמות גדולה יותר. עבור ביופסיות קטנות יותר לדלג על שלב זה ולעבור להטביעה agarose.
  2. הטבעת רקמת לב באגזום בנקודת התכה נמוכה
    1. להרתיח 400 מג של נקודת התכה נמוכה agarose ב 10 מל של תמיסת חיתוך ב זכוכית.
      התראה: לבש כפפות ומשקפיים בטיחות כדי למנוע כוויות. לטפל בכלי זכוכית חמים רק עם בלאי הגנה מפני חום.
    2. מלאו מזרק של 10 מ"ל בג'ל אגרוז חם ומומס. לאטום את המזרק ולאפשר agarose כדי לשוויון באמבט מים 37 מעלות C לפחות 15 דקות.
    3. השתמשו במקציות כדי למקם את דגימת הלב הקצוצות או הביופסיה לצלחת נקייה של תרבות רקמות של 35 מ"מ עם האפיקארדיום פונה כלפי מטה ולהסיר נוזל עודף עם ספוגית סטרילית.
    4. יוצקים את האנגרוז המוגן (שלב 3.2.2) על הרקמה על ידי ריקון המזרק. לאבטח את הרקמה נגד תנועה עם ממחטות תוך שפיכת agarose. ודא כי הרקמה שקועה לחלוטין agarose.
    5. מניחים מיד את המנה על קרח ולתת לאגרוז להתבסס במשך 10 דקות.
  3. חיתוך שריר הלב
    1. הר סכין גילוח חדש למחזיק הלהב של הרטט ולכייל את הרטט על-ידי כוונון הסטת z של הלהב במידת האפשר.
      הערה: פרוטוקול זה משתמש ברטט עם התקן כיול בסיוע אינפרא-אדום כדי ליישר את הלהב במיקום אופקי עם סטיית z מינימלית (הסטה מדודה <0.1 μm).
    2. השתמשו באזמל כדי לחסום רקמת א-גרוז שמתאימה למחזיק הדגימה של הויברטום. כדי להבטיח יציבות, ודא כי הרקמה עדיין שקועה מספיק באגרוז (שולי agarose - 8 מ"מ).
    3. לתקן את בלוק agarose למחזיק הדגימה עם שכבה דקה של דבק cyanoacrylate ולחץ עדין.
    4. מניחים את מחזיק הדגימה עם הרקמה לתוך אמבט הרטט. ממלאים את האמבטיה בתמיסת חיתוך ולשמור על 4-6 °C לאורך כל העיבוד עם קרח כתוש, מלא במיכל הקירור בחוץ של vibratome.
    5. צור פרוסות בעובי 300 μm במהירות מתקדמת של כ-0.1 מ"מ לשעה, תדר נדנוד של 80 הרץ, משרעת רוחבית של 1.5 מ"מ וזווית להב של 15°. בעת טיפול פרוסות, להחזיק את agarose במקום הרקמה עצמה כדי למנוע נזק לרקמות. אחסן את הפרוסות בתמיסת החיתוך ב- 4 °C למשך 2 שעות לכל היותר, במידת הצורך.
      הערה: Cardiomyocytes הם מונחה במקביל epicardium. לכן, חשוב לחתוך במקביל epicardium כדי למנוע נזק מיוצייט מוגזם. מומלץ להיפטר מ-1-3 הפרוסות הראשונות, מכיוון שיש להשתמש רק בפרוסות אחידות של עובי קבוע לבידוד. עבור ביופסיות רקמות קטנות, עם זאת, רק להשליך את הפרוסה הראשונה.
    6. בדוק יישור cardiomyocyte תחת מיקרוסקופ אור סטנדרטי עם הגדלה של 40-100x.

4. עיכול רקמות

  1. מניחים את לוחית החום על שייקר המעבדה וחממים אותה ל-37 מעלות צלזיוס. הפעל את שייקר המעבדה ב65 סל"ד.
  2. ממיסים את החלבונים (שהוכנו בשלב 1.3) ב-2 מ"ל של פתרון 1 (שלב 1.1 ו-1.2) ותדגירה ב-37°C עד לשימוש. אין לערבב את החלבונים ואת הקולגן.
  3. ממיסים את הקולגן (שהוכן בשלב 1.4) ב- 2 מ"ל של פתרון 1 (שלב 1.1 ו- 1.2) ותדגירה ב- 37 °C עד לשימוש. אין לערבב את החלבונים ואת הקולגן.
    התראה: ללבוש משקפי מגן וכפפות, כי אנזימים מומסים יכולים לגרום לפציעות עור ועין.
  4. הוסף סידן כלוריד (CaCl2)קולגן המכיל פתרון (מוכן בשלב 4.3) לריכוז סופי של 5 μM.
  5. השתמשו במרטטים כדי להעביר פרוסת רקמה מאמבט הרטט לצלחת נקייה של תרבות רקמות של 60 מ"מ מלאה בתמיסת חיתוך מקצטת מראש ב-5 מ"ל (שלב 1.1 ו-1.2) ולשמור על קרח.
  6. בזהירות להסיר את agarose מרקמות שריר הלב עם להב או משקולות.
    הערה: הימנע מתח עודף ולחץ גהה על פרוסות שריר הלב, כי הם יכולים לפגוע cardiomyocytes.
  7. כדי לבצע את השטיפה הראשונית, מניחים צלחת נקייה של תרבות רקמות 35 מ"מ על צלחת החום ומלאו אותה בתמיסה של 2 מ"ל (37°C) 1. מעבירים 1-2 פרוסות שריר הלב לצלחת המוכנה עם מפסים. שאף את הפתרון עם פיפטה 1 מ"ל ולבצע את שלבי השטיפה 2x כדי להסיר שרידים של פתרון חיתוך.
    הערה: אין לאכוף את פרוסות הלב. הפתרונות והפרוסות צריכים להישאר בטמפרטורה קבועה של 35 מעלות צלזיוס על לוח החום הנסער. כוונן את טמפרטורת לוחית החום במידת הצורך.
  8. הסר את הפתרון 1 מהצלחת והוסף 2 מ"ל של תמיסת החלבונים (שלב 4.2). דגירה במשך 12 דקות על צלחת החום ב 65 סל"ד.
  9. לשטוף 2x עם 2 מ"ל של פתרון טרום חם 1 (37 ° C).
  10. הסר את הפתרון 1 מהצלחת והוסף 2 מ"ל של פתרון קולגנאז (שלבים 4.3 ו- 4.4). דגירה לפחות 30 דקות על לוח החום ב 65 סל"ד.
  11. בדוק מיוציטים בודדים בחינם ב 30, 35, 40 דקות, וכו ', על ידי הצבת המנה תחת מיקרוסקופ אור. עבוד במהירות כדי למנוע קירור משמעותי של הפתרון.
    הערה: זמן העיכול הנדרש עשוי להשתנות בהתאם לחוקת הרקמה ולדרגת הפיברוזיס. ברגע הרקמה מקבל רך באופן ניכר ומנתק בקלות כאשר משך בעדינות, זמן העיכול האופטימלי כבר הגיע. אם יש מספיק רקמות זמינות, ניתן לעכל מספר פרוסות במקביל לתקופות עיכול שונות.
  12. כאשר הרקמה מתעכלת ומיוציטים בודדים גלויים (שלב 4.11), לשטוף 2x עם 2 מ"ל של פתרון טרום חמם 2 (37 ° C) ולמלא שוב עם 2 מ"ל.

5. ניתוב רקמות

  1. ניתכו את פרוסות הרקמה המעוכלות במלקות על ידי משיכת הסיבים בזהירות.
  2. בזהירות פיפטה מספר פעמים עם פיפת פסטר חד-פעמיים (קוטר פתיחה >2 מ"מ).
    הערה: השימוש במלחציים ו pipetting יכול לגרום למתח מכני ולגרום נזק cardiomyocyte. עם זאת, זהו צעד מכריע להפרדה של התאים. השתמש בממצקים עדינים כדי למזער נזק לתאים ולנתק בזהירות את הפרוסות לחתיכות קטנות יותר.
  3. בדוק את קרדיומיוציטים בצורת מוט משוחררים מתחת למיקרוסקופ האור.

6. שיקום ריכוז הסידן הפיזיולוגי

  1. לאט להגדיל את ריכוז הסידן מ 5 μM כדי 1.5 mM תוך כדי עצבנות ב 35 מעלות צלזיוס על צלחת החום. השתמש בפתרונות מניות של 10 מ"מ ו- 100מ"מ. שלבים מומלצים: 20, 40, 80, 100, 150, 200, 400, 800, 1,200, 1,500 μM. לאפשר לתאים להסתגל לרמות הסידן מוגברת במרווחי דגירה 5 דקות בין כל שלב.
  2. הסר נתחי רקמה מעומצמים בזהירות עם ממחטות או לסנן את מתלי התא דרך רשת ניילון עם גודל נקבוביות 180 μm בסוף עלייה בסידן.

7. הסרת סוכן ניתק מכני

  1. להפסיק את התסיסה ולהסיר לאט שליש מהפתרון (~ 700 μL) מההתחלה עם 1,000 μL pipette. הימנע משאיפה של cardiomyocytes.
    הערה: אם רקמה לא אוכלז הוסר, cardiomyocytes יצטברו במרכז המנה, אשר מקל על השאיפה של פתרון ללא תאים. אם לא, להעביר את פתרון התא צינור צנטריפוגה 15 מ"ל ולאפשר לתאים לשקע במשך 10 דקות ב 35 ° C, לאחר מכן לשאוף 700 μL של supernatant ולהיפטר, לתוסף את התאים, להעביר אותם בחזרה לצלחת תרבות רקמות 35 מ"מ ולהמשיך עם שלב 7.2.
  2. להוסיף 700 μL של פתרון 3 לתאים, לחדש את התסיסה על לוח החום דגירה במשך 10 דקות.
  3. חזור על שלבים 7.1 ו- 7.2.
  4. להעביר את הפתרון 15 mL צנטריפוגה צינור ולאפשר cardiomyocytes לחשמל למינימום של 10 דקות ומקסימום של 30 דקות בטמפרטורת החדר או ספין ב 50 x g עבור 1 דקות. הסר את supernatant לחלוטין וsspend בפתרון של Tyrode שונה או מאגר הניסויים הרצוי.
    הערה: ניתן לאחסן Cardiomyocytes בתמיסה של Tyrode שונה (טבלה 1) במשך מספר שעות ב 37 °C ו 5% CO2 לפני השימוש.
  5. אמת את איכות התא עם מיקרוסקופ אור סטנדרטי בהגדלה של 40x ו- 200x.
    הערה: כ-30%-50% מהקרדיומיוציטים צריכים להיות בצורת מוט, חלקים ללא ממברנה, ולהציג פלגים צולבים ברורים. רק 5-10% מהתאים ה קיימא צריך להראות התכווצויות ספונטניות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כדי לאמת את יעילות הבידוד, הפרוטוקול שימש עם שריר הלב חולדה ומספר המיוציטים קיימא כתוצאה מכך הושווה למספרים שהושגו על ידי בידוד באמצעות זביה כלילית ועל ידי בידוד מחתיכות רקמות קטנות (בידוד נתחים, איור 2). בידוד נתחים ובידוד מפרוסות רקמות בוצעו מאותם לבבות. לבידוד באמצעות עירוי כלילית, עם זאת, כל הלב היה בשימוש. התסיסה הכלילית הניבה בעיקר קרדיומיוציטים בצורת מוט וקרוס-תיל. עם בידודים מפרוסות שריר הלב נצפו חלק נמוך יותר של תאים בצורת מוט, אבל המספר הכולל היה עדיין גבוה. לעומת זאת, לאחר בידוד מחתיכות רקמות, רק תאים מעטים בצורת מוט נמצאו (איור 2א). ציתימת זרימה שימשה להשוואת התוצאות באופן כמותי. בשל גודלם הגדול יחסית וההצטלבות הצולבת שלהם, cardiomyocytes בדרך כלל להראות ערכים גדולים עבור פיזור הן קדימה והן בצד. מאפיינים אלה שימשו לספירת מיוציטים בצורת מוט עם מנתח תאים ציטומטרי זרימה, החלת ערכת gating פשוטה כי מופלה בצורת מוט מ cardiomyocytes hypercontracted ומגולגל. (איור משלים 1). עלילות נקודה מייצגות מתוארות ב- איור 2B. ניתוח סטטיסטי הראה ספירות גבוהות באופן ייחודי בשער cardiomyocyte CM1 לבידוד מפרוסות מאשר מחתיכות רקמה (41.5 ± 11.9 לעומת 7.89 ± 3.6%, בהתאמה; n =3 בידודים; p < 0.05, paired two-tailed t-test). As expected from visual inspection, coronary perfusion yielded the highest counts, with 71.0 ± 9.4% (n = 3 isolations; p < 0.05, unpaired two-tailed t-test) (איור 2C). לכן, הבידוד של קרדיומיוציטים מפרוסות רקמה אינו מגיע לתשואה שהושגה על ידי עירוי כלילית, אבל התוצאה היא מספר גדול בהרבה של מיוציטים בצורת מוט מאשר בידוד מחתיכות רקמות, מתן מספיק תאים לניסויים הבאים. בנוסף לספירת תאים, פרמטרים מבניים של קרדיומיוציטים חולדה היו לכמת. אורך התא, רוחב התא ואורך sarcomere לא היו שונים בתאים מבודדים על ידי perfusion או מפרוסות רקמה (אורך = 110.0 ± 5.4 μm לעומת 99.4 ± 3.2 μm, p > 0.05; רוחב = 33.9 ± 1.9 μm לעומת 30.6 ± 1.2 μm, p < 0.05, עבור n = 19 ו- n = 21 תאים, בהתאמה; אורך sarcomere = 1.62 ± 0.04 μm לעומת 1.68 ± 0.04 μm, p = 0.28, n = 24 ו- n = 23 תאים בהתאמה ) (איור משלים 2A-C). שימוש במיוציטים טעונים Fluo-4 נתונים לגירוי שדה חשמלי17 כמו כן הוערכו פרמטרים פונקציונליים (איור משלים 2D–פ). זמן הפעלה ממוצע (27.5 ± 1.5 לעומת 23.6 ± 2.5 ms, n = 100 לעומת n = 31 תאים; עירוי לעומת פרוסה, p > 0.05) (איור משלים 2D) וקיצור יחסי (12.2 ± 1.1 לעומת 11.3 ± 2.5%, n = 42 לעומת n= 7 תאים, פריוז'ן לעומת פרוסה, p > 0.05) (איור משלים 2F), של קרדיומיוציטים שהגיבו לגירוי לא היו שונים באופן משמעותי בין שתי הקבוצות. משרעת ארעי סידן (Ca מנורמל מקסימלית2+ +2F/F0) (איור משלים 2E) היה מוגבר במקצת cardiomyocytes מבודד מפרוסות בהשוואה cardiomyocytes מבודד על ידי עירוי (4.9 ± 0.2 לעומת 5.7 ± 0.3, n = 104 לעומת n = 25 תאים, פריוזה לעומת פרוסה, p < 0.05). Although the fraction of rod-shaped cardiomyocytes responding to electrical stimulation was approximately 15% higher in preparations obtained by perfusion, the majority of cells was also excitable in preparations from tissue slices (74.3 ± 4.2% vs. 62.1 ± 2.9%, perfusion vs. slice, p < 0.05, ten fields of view, 452 vs. 276 counted cells, respectively) (איור משלים 2G). כדי להעריך את איכות התא לאחר הטיפוח, אחוז myocytes מתכווץ בתגובה לגירוי שדה חשמלי לאחר 48 שעות בתרבות התא נקבע17. השבר של תאים מגיבים הופחת בכמחצית בשתי הקבוצות (41.9 ± 3.6% לעומת 31.5 ± 2.3%, perfusion לעומת פרוסה, p < 0.05, 10 fields of view, n = 371 vs. n = 329 counted cells, respectively) (איור משלים 2H).

לאחר מכן, הפרוטוקול הוחל על שריר הלב האנושי. מספר קרדיומיוציטים אנושיים מבודדים בצורת מוט ו-קיימא המתקבלים מפרוסות רקמות הושווה בזו לזו עם המספר המתקבל מחתיכות רקמות של אותן דגימות שרירהלב (איור 3). מצאנו כי הבידוד מפרוסות שריר הלב הניב חלק גדול של מוט בצורת ורק חלק קטן של cardiomyocytes מעוגל(איור 3A). ספרנו מיוציטים בצורת מוט מתמונות שדה רחב ונורמלנו את מספרם על ידי הרקמה הרטובה ששימשה לבידוד. הכימות הראה כי בידוד מפרוסות שריר הלב הביא למספר גבוה להפליא של מיוציטים בצורת מוט מאשר בידוד מחתיכות רקמות (45.0 ± 15.0 לעומת 6.87 ± 5.23 תאים/מ"ג, n = 7 בידודים, p < 0.05, מזווג שני זנבות t-test)(איור 3B). יתר על כן, הכדאיות הוערכה עם אסייגת הכדאיות של MTT14- מנרמלת את ספיגת הפוטומטריה לכמות הכוללת של החלבון בתא. הכימות הפותומטרית אישרה קתנות מיוצייט גבוהה משמעותית לאחר בידוד מפרוסות שריר הלב (4.76 ± 0.47 לעומת 1.09 ± 0.18 AU, n = 3 בידודים, p < 0.05, מזווג t-test)(איור 3C).

בסך הכל, השיטה הוחלה על דגימות שריר הלב מ-30 לבבות אנושיים עם זמני הובלה של עד 36 שעות. מתוך 23 מתוך 30 התאים הניתנים לדגימות הושגו לניסויים הבאים (ראה גם טבלה משלימה 1). דוגמה לניסוי כושל (כלומר, <100 תאים לצלחת) מוצגת באיור משלים 3. כאן, רוב התאים לא סבלו סידן חוץ תאי גבוה וקבלנות יתר. הערכנו את ההתכווצות במיוציטים מ-14 בידודים, ובדו מקרים התאים לא הגיבו לגירוי חשמלי. שימו לב כי הטכניקה לא רק עבדה עם דגימות גדולות שהתקבלו מלבבות בוגרים, אלא גם עם ביופסיות קטנות (פחות מ-40 מ"ג) מלבבות ילדים(איור משלים 4).

כדי להוכיח כי תאים אנושיים מבודדים עם הפרוטוקול המתואר יכול להיות נתון לניתוח מבני, הם היו מוכתמים אלפא-אקטינין, EC צימוד חלבונים L-סוג סידן ערוץ (LTCC) ו קולטן ryanodine (RyR), כמו גם קרום התא וגרעין, על פי שיטת כתמים שתוארה לאחרונה מיוציטיםחולדה 17 (איור 4). כתמי אלפא-actinin חשף צפוף, דפוס z-line רגיל ואורך sarcomere ממוצע של 1.92 ± 0.06 μm במנוחה cardiomyocytes (n = 4, איור 4A). LTCC ו- RyR הראו אשכולות ברורים, כצפוי, colocalized ליד קרום התא t-tubules(איור 4B).

הצבע הפוטנציומטרי FluoVolt18 והצבע הרגיש לסידן Fluo-417 שימשו כדי להוכיח כי cardiomyocytes אנושי מבודד עם הפרוטוקול המתואר היו מרגשים, יכול לשמש מחקרים על אלקטרופיזיולוגיה תאית או צימוד התכווצות-רגש(איור 5). צורה ומשך פעולה פוטנציאליים (AP) נותחו (איור 5A,B). הערכים של 50% ו 90% משך AP (APD50: 400.6 ± 41.1 ms, APD90: 748.9 ± 56.6 ms, n = 10 תאים) היו בטווח שדווח על ידי אחרים עבור cardiomyocytes חדרי הלבהכושלים 4,6,7,9. ארעי הסידן שתועדו על ידי סריקת קו confocal של תאים טעונים Fluo4(איור 5C,D)הראו תפרה ברורה לאחר גירוי ויחס אות לרעש מקובל. משרעת ארעי סידן (מרבי F / F0)היה 2.9 ± 0.5 (n = 31 תאים). התכווצות Cardiomyocyte על ידי התכווצות ניתן לראות בדוגמה מן הסטיה של גבול התא התחתון, אשר היה ממוצע של 4.6 ± 0.8% (n = 31 תאים).

Figure 1
איור 1: זרימת עבודה של פרוטוקול הבידוד מפרוסות רקמת לב אנושית. בלוקי רקמות או ביופסיות של שריר הלב האנושי (למעלה משמאל) מוטבעים באגרוז בנקודת התכה נמוכה ופרוסות בעובי 300 μm נוצרות עם הלהב המתנדנד של ויברטום (אמצע עליון). הפרוסות מועברות לצלחת תרבות ויוסרו מהאגרוז שמסביב (מימין למעלה). עיכול רקמות מתבצע ב ~ 35 ° C ו 65 סל"ד על צלחת מחוממת ונסערת (באמצע, משמאל) וכולל: (שלב 4.8) דגירה בתמיסה ללא סידן נומינלי בתוספת חלבונים, (שלב 4.10) עיכול של המטריצה החוץ-תאית עם קולגן, (שלב 5) דיסוציאציה ושחרור של קרדיומיוציטים בודדים עם מפלצות וצינורות. (שלב 6) עלייה איטית של ריכוז הסידן החוץ תאי מ 5 μM ל 1.5 mM במרווחים של 5 דקות (שלב 7) הסרת Stepwise של uncoupler מכני 2,3-butanedione monoxime (BDM). קרדיומיוציטים אנושיים בצורת מוט וחוצים מאוחזרים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: תפוקת Cardiomyocyte של פרוסת שריר הלב, התזת ובידוד נתחים. (א)מיקרוגרפים אור מייצג של קרדיומיוציטים חולדה מבודדים או באמצעות עירוי כלילית (עירוי), מרקמות חיתוך ויברוט (פרוסות שריר הלב), או מרקמות טחון (נתחי רקמות). (ב)חלקות נקודה זרימה מייצגות בהתאמה מבידודי cardiomyocyte המתוארים ב- A. אזור פיזור צד (אזור SSC) ואזור פיזור קדמי (FSC-Area) שימשו כאינדיקטורים של גרגריות וגודל תאיים, בהתאמה. ערכת gating של שער CM1 עבור cardiomyocytes מסומן על ידי הקו השחור ואת השברים המתאימים של ספירות סה"כ באחוזים מוצגים. (ג)ממוצע ± שגיאה סטנדרטית של השברים של cardiomyocytes (CM1) מוערך על ידי ניתוח זרימה-ציטוטמטרי כמתואר ב- B מ n = 3 בידודים תאים לכל קבוצה. הבידוד מפרוסות שריר הלב ונתחי רקמות בוצע מאותם לבבות (מבחן t דו-זנבי). הבידוד על ידי זחול בוצע מלבבות שלמים של בעלי חיים שונים ובהשוואה על ידי t-זנב לא משולם מבחן. *p < 0.05, לאחר תיקון השוואה מרובה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: השוואה של תשואה וכדאיות של cardiomyocytes אנושי לאחר בידוד מפרוסות שריר הלב ונתחי רקמה טחון. (א)תמונה מייצגת של קרדיומיוציטים אנושיים סובלניים סידן בחדר לאחר בידוד מפרוסות רקמות. קרדיומיוציטים בצורת מוט וקווי הם דומיננטיים (חץ שחור), עם תאים מעוגלים בלבד וקבלנים יתר (חץ לבן). (ב)כימות של מיוציטים סובלניים בסידן, בצורת מוט מבודדים במקביל, בין אם מפרוסות שריר הלב או נתחי רקמות נספרו ממיקרוגרפים שדה רחב ומנורמל למשקל הרטוב של חומר הקלט (במיליגרם) מ n = 7 בידודים מזווגים. (ג)כימות הכדאיות cardiomyocyte על ידי מדידה פוטומטרית של ספיגת צבע formazan לאחר אסייג MTT. הספיגה הייתה מנורמלת לכמות החלבון הכוללת, הוערכה על ידי BCA assay מ n = 3 בידודים מזווגים. *p < 0.05, **p < 0.01 (מבחן t דו-זנבי מזווג). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: אפיון מיקרו-סטרוקטואלי של קרדיומיוקיטים אנושיים לאחר הבידוד. (A)תמונה מיקרוסקופית confocal נציג לאחר immunostaining של אלפא-actinin (ירוק) וכתם גרעיני עם 4′,6-diamidin-2-פנילינדול (DAPI, כחול). אורך sarcomere היה 1.92 ± 0.06 μm (n = 4 myocytes), נקבע על ידי ניתוח ספקטרום פורייה. (ב)תמונות מיקרוסקופיות קונפוזיות מייצגות של קוימונוציט קרדיומיוציט אנושי קבוע coimmunostained עבור L-סוג סידן ערוץ (LTCC) קולטן ריאנודין לב (RyR). כיסוי של RyR ו LTCC (כיסוי) ואת הכתמים של המטריצה extraular עם נבט חיטה agglutinin (WGA, מג'טנטה) מוצג גם. גרעין היו מוכתם DAPI (כחול). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 5
איור 5: פוטנציאל פעולה וסידן תאי ארעי במיאוציטים חדריים אנושיים. (A)תמונה דו מימדית של cardiomyocyte אנושי מבודד טעון בצבע פוטנציומטרי FluoVolt (ירוק, 488 נאר"מ אורך גל). התיבה האדומה מציינת רכיב של מערכת t-tubular שנמדד עם סריקת קו מהיר במהלך גירוי שדה חשמלי ב- 0.5 הרץ. (ב)פלואורסצנטי FluoVolt ממוצע ומנורמל בסיסית (F/F 0) של חמישהפוטנציאלי פעולה רצופיםשהושגו על-ידי הדמיה קונפוקל כמתואר ב- A. (ג)תמונת סריקת קו של cardiomyocyte אנושי מבודד טעון עם צבע רגיש סידן Fluo-4 AM (488 ננ"מ אורך גל excitation) לאורך ציר התא האורך. עוצמת הפלואורסצנט מוצגת בערכים אפורים [AU] והנקודות הכחולות מצביעות על העלייה המקסימלית של עוצמת הפלואורסצנט (dF/dtmax)של כל פיקסל לאורך הקו הסרוק. קצב הדגימה היה 529 הרץ.(D)סידן ארעי שהושג על ידי ממוצע הפלואורסצנציה של כל פיקסל לאורך הקו הסרוק מהתמונה ב- C ונורמליזציה לערכי בסיס לפני גירוי (F/F0). כל הניסויים בוצעו בטמפרטורת החדר. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

שם הרכב ב mmol / L תוספי Ph אמצעי אחסון נדרש ב- mL
פתרון 1 20 KCl, 10 KH2PO4, 10 MgCl2, 10 גלוקוז, 70 חומצה גלוטמית, 20 טאורין, 10 בטא הידרוקסיבוטיראט, 30 BDM 2 אלבומין סרום של 2 מ"ג ל-ml 7.3 עם קו 300
פתרון 2 20 KCl, 10 KH2PO4, 10 MgCl2, 10 גלוקוז, 70 חומצה גלוטמית, 20 טאורין, 10 בטא הידרוקסיבוטיראט, 0.005 CaCl2, 30 BDM 10 מ"ג/מ"ל אלבומין סרום של נק' 7.3 עם קו 300
פתרון 3 20 KCl, 10 KH2PO4, 10 MgCl2, 10 גלוקוז, 70 חומצה גלוטמית, 20 טאורין, 10 בטא הידרוקסיבוטיראט, 1.5 CaCl2 10 מ"ג/מ"ל אלבומין סרום של נק' 7.3 עם קו 300
שונה הפתרון של Tyrode 130 NaCl, 0.4 NaH2ת.ד. 4, 5.8 NaHCO3, 5.4 KCl, 0.5 מ"ג2, 1.5 CaCl2, 25 HEPES, 22 גלוקוז 2 אלבומין סרום של 2 מ"ג ל-ml 7.3 עם NaOH ב- 5% CO2 100
פתרון חיתוך 138 NaCl, 0.33 NaH2ת.ד. 4, 5.4 KCl, 2 MgCl2, 0.5 CaCl2, 10 HEPES, 10 גלוקוז, 30 BDM 7.3 עם נאוה 500

טבלה 1: מאגרים ופתרונות. הרכב המאגרים והפתרונות הנדרשים.

איור משלים 1: אימות של ערכת קרדיומיוציט (CM1). נקודות חלקות מציטומיה זרימה, מדידת אזור פיזור קדימה וצד (FSC-A, SSC-A) המציין גודל וגרגריות של התאים שזוהו במדגמת בקרה (CTRL) מקרדיומיוציטים חולדה מבודדת perfusion ולאחר דגירה של קרדיומיוציטים מאותה הכנה במשך 15 דקות ב 37 ° C בתמיסה של Tyrode שונה המכיל סידן 100 מ '(מנת יתר של סידן). הסידן החוץ-תאי הגבוה גורם לפרפר-קונסטרציה ולעיגול של קרדיומיוציטים בצורת מוט, וכתוצאה מכך הפחתה של תאים (87.6% לעומת 6.00%) בשער המוגדר (CM1). אנא לחץ כאן כדי להוריד דמות זו.

איור משלים 2: מאפייני Cardiomyocyte מבודד על ידי עירוי או מפרוסות. אורךהתא( A ) ורוחבהתא (B)נקבעו מקרדיומיוקיטים חולדה קבוע ישירות לאחר הבידוד באמצעות עירוי או מפרוסות שריר הלב על ידי מיקרוסקופ (n = 19 ו n = 21 תאים, בהתאמה). אורך sarcomere(C)נקבע מתמונות מיקרוסקופיות לאחר אימונוסטין עם אלפא-actinin וניתוח פורייה (n = 24 ו n = 23 תאים, בהתאמה). זמן ההפעלה ממוצע(D),F/F0 המרבי(E)וקיצור יחסי(F)הוערכו מפלו-4 קרדיומיוציטים טעונים מבודד על ידי עירוי או מפרוסות שריר הלב ומגיב לגירוי חשמלי (n = 100/31 myocytes ב D, n = 104/25 מיוציטים ב- E ו- n = 42/7 מיוציטים ב- F). השבר של cardiomyocytes בצורתמוט (G)כי התכווצו על גירוי חשמלי, הוערך על ידי ספירת המספר הכולל של תאים בצורת מוט ואת התאים מתכווץ בעשרה שדות תצוגה ב 200x הגדלה במיקרוסקופ אור סטנדרטי הוערך עבור זינג ובידוד פרוסה (n = 452/276 תאים, בהתאמה). (H)ניתוח כפי שבוצע ב G אבל לאחר 48 שעות של טיפוח (n = 371/329 תאים, בהתאמה). אנא לחץ כאן כדי להוריד דמות זו.

איור משלים 3: בידוד קרדיומיוציט אנושי עם תשואה נמוכה. תמונת מיקרוסקופ אור מייצגת של מיוציטים מבידוד עם תאים בקבלנות יתר (כחולה) או מעוגלת (שחור) ורק תאים מעטים בצורת מוט ותאי מקופלים (לבן). אנא לחץ כאן כדי להוריד דמות זו.

איור משלים 4: בידוד לב-ריאה מביופסיות לב של תינוקות. (א)תמונה של ביופסיה אנדומיוקרדיאלית (משקל רטוב כ 40 מ"ג) שהושגה במהלך ניתוח מתקן עבור טטרולוגיה של Fallot בתינוק. (ב)פרוסת שריר הלב מהרקמות המוצגות ב- A,משובצת באגרוז. (ג)קרדיומיוציטים מבודדים מפרוסת שריר הלב כפי שממוצג ב- B. אנא לחץ כאן כדי להוריד דמות זו.

טבלה משלימה 1: נתוני מטופלים אנושיים. רשימה של מספר הדגימות מחולים אנושיים הכלולים במחקר זה ניתנת. הדגימות סווגו על פי סוגי ניתוחים, גיל, אטיולוגיה של מחלות וזמן הובלה, עם המספר הכולל של הדגימות ומספר הבידודים המיוציטים המוצלחים. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

למרות הבידוד של cardiomyocytes חיים הוקמה לפני יותר מ 40 שנים והוא עדיין תנאי מוקדם עבור גישות ניסיוניות רבות במחקר לב, זה נשאר טכניקה קשה עם תוצאות בלתי צפויות. בידוד Cardiomyocyte באמצעות שאיפה של העורקים הכליליים עם תמיסת אנזים משמש בדרך כלל עבור לבבות של בעלי חיים קטנים ומניב מספר גדול של תאים קיימא. עם זאת, זה דורש מערכת מורכבת יחסית ומומחיות. יתר על כן, רוב דגימות רקמה אנושית אינם מתאימים לשיטה זו, בשל גודלם הקטן או היעדר ענפי עורקים כליליים, מה שהופך שיטות חדשות לבידוד של cardiomyocytes אנושי רצוי. הפרוטוקול המתואר כאן מבוסס על הדור הטראומטי של פרוסות רקמת לב דקות, אשר לאחר מכן נתונים לעיכול אנזימטי. זה יכול להיות מיושם על דגימות שריר הלב מלבבות בעלי חיים ומיו ריר הלב אנושי כגון ליבות apical מהשתלת מכשיר סיוע בחדר השמאלי, ביופסיות אנדומיוקרדיאליות מתוך כריתת מיסטומיה מחיצתית, או לבבות שנשתלו (ראה טבלה משלימה 1), ומייצרת באופן אמיןכמויות מספיקות של קרדיומיוציטים סובלניים בסידן שניתן להשתמש בהם לניסויים הבאים, כמו טיפוח cardiomyocyte17.

סיבה עיקרית לתשואות גבוהות יותר של מיוציטים מפרוסות רקמה חתוכות ברוטציות מאשר מחתיכות רקמה טחון עשוי להיות רמה נמוכה יותר של נזק myocyte במהלך החיתוך. כאשר זינגה כלילית אינה אפשרית, חיתוך או טחינה דגימת הרקמה יש צורך להגדיל את פני השטח של מגע לעיכול אנזימים. ממדי פרוסה של כ 8 מ"מ x 8 מ"מ x 0.3 מ"מ מאפשרים גישה טובה של אנזימים בשל יחס משטח-נפח גדול יחסית (כ-7 מ"מ-1). באמצעות מספריים, ניתן להשיג יחס דומה של משטח לנפח (כ-6מ"מ -1)על-ידי טחינה של הדגימות לחתיכות קטנות של כ-1 מ"מ x 1 מ"מ x 1 מ"מ. למרות נזק myocyte פרוסות נתחים טחון לפני העיכול אנזימטי לא היה לכמת, חיתוך על vibratome כנראה גורם הרבה פחות נזק כי זה מאפשר חיתוך עדין בכיוון הסיבים. למעשה, ההערכה היא כי בפרוסות חיתוך ויברטט פחות מ 5% של myocytes פגומים19. התוצאות מראות כי cardiomyocytes אנושי יכול להיות מבודד ביעילות רבה עם הפרוטוקול שסופק, עם שיעור גבוה בהרבה של תאים קיימא בהשוואה לחתיכות רקמות. זאת בהתאם לפרוטוקול שהשתמש בפרוסות מרקמות תפלה20. השיטה שלנו מניבה עד 200 מיוציטים חדריים סובלניים סידן לכל מיליגרם של רקמה ומספק את האפשרות לאחסן או להעביר רקמת לב עד 36 שעות לפני הבידוד. זה הופך את הפרוטוקול ישים עבור מעבדות ללא ניתוח לב באתר ובכך מרחיב את האפשרויות לשיתופי פעולה.

צעדים קריטיים בפרוטוקול הם העיבוד הנכון של שריר הלב לפרוסות על רטט והעיכול שלהם, כמו גם את השלבים האחרונים של סידן-reintroduction ושטיפה של BDM. בניגוד לשיטות אחרות19,21, רקמת הלב מוטבעת agarose עם טמפרטורת התכה נמוכה כדי למנוע תנועהבמהלך הליך החיתוך 14,15. זה היה הכרחי כדי לייצב את בלוק הרקמה וליצור פרוסות אחידות. בעת הטבעת הרקמה, agarose עדיין צריך להיות נוזלי, אבל הטמפרטורה לא צריכה לעלות על 37-38 ° C כדי למנוע נזק לתא על ידי היפרתרמיה. לעומת זאת, אם agarose קר מדי (<35 °C), זה לא נקשר היטב לבלוק הרקמה עלול להישבר במהלך החיתוך. כדי לבדוק את הכדאיות myocyte לאחר עיבוד vibratome, אסייג MTT פשוט המאפשר הערכה מהירה של הכדאיות בתא על ידי מיקרוסקופקל וגם לכמת על ידי ניתוח פוטומטרי מוצע14,22. נזק Cardiomyocyte יכול להתרחש גם במהלך פירוק מחדש של סידן חוץ תאי לאחר תקופה של דגירהבתמיסה ללא סידן 23,24. תופעת פרדוקס סידן זה בתאים מבודדים ניתן למתן על ידי עלייה איטית, צעד צעד של רמות הסידן כדי לאפשר cardiomyocytes להסתגל. שלב זה צריך להתבצע בזהירות במהלך תסיסה מתמשכת ב 35 °C ועם מרווחים של 5 דקות. היפותרמיה קלה (21 °C) מגבירה את עמידות הסידן של קרדיומיוציטים חולדה במהלך reintroduction, אשר בהתאם לדיווחיםקודמים 25. עם זאת, cardiomyocytes אנושי לא הראה הבדלים גדולים בסובלנות סידן ב 35 ° C או 21 ° C. השימוש BDM במהלך חיתוך, עיכול, והפעלה מחדש של סידן מונע התכווצות myocyte והוצאות אנרגיה סלולרית, כמו גם היפר-סתירה ולכן הוא מגן. עם זאת, עבור ניסויים הבאים הערכת התכווצות לב או צימוד התכווצות-התכווצות, BDM צריך להסיר26. שטיפה הדרגתית הוחלה כדי למזער contraction ספונטני. BDM ניתן להשמיט, אבל זה יגדיל במידה ניכרת את כמות myocytes hypercontracted, כפי שנצפה בניסויים קודמיםומחקרים 6.

הפרוטוקול המתואר משתמש בתמיסה המכילה אשלגן גבוה ורק עקבות של נתרן לעיכול. פתרון זה נתן את התשואות הגבוהות ביותר של קרדיומיוציטים בצורת מוט, קרוס-striated. לעיכול אנזימטי, עם זאת, זה דרש ריכוז גבוה יותר של קולגנאז (4 מ"ג / מ"ל) לעומת העיכול בתמיסה של טירוד נורמלי (1.5 מ"ג / מ"ל). נתרן חוץ תאי גבוה עלול להוביל עומס יתר נתרן תאי, החריף את ההשפעות השליליות של פרדוקס הסידן, ובכך להפחית את תפוקת התא27. לכן, מומלץ להשתמש בפתרונות עם אשלגן גבוה ונתרן נמוך. ריכוז מגנזיום חוץ תאי גבוה מועסק לעתים קרובות בפרוטוקולים בידוד cardiomyocyte 3,28, והוכח להפחית את הפציעה איסכמיה-reperfusion29,30 ולשפר את תפקוד הלב לאחרתקופותממושכות של איסכמיה קרה31. לכן, הפתרון המיושם כאן מכיל גם ריכוז גבוה של מגנזיום (10 מ"ר). עם זאת, הוכח כי ריכוזי התכווצות, כוח התכווצות ומהירות מוליך עשויים להיות מופחתים על ידי ריכוזי מגנזיום גבוהים32. למרות תופעות אלה הוצגו להיות הפיך, השפעות על cardiomyocytes מבודד לא ניתן לשלול. לכן, שימוש במגנזיום בריכוזים פיזיולוגיים (1-2 מ"מ), עלול לגרום לתפוקה נמוכה יותר של התא הכללי אך לשפר את ההתרגשות.

זמן העיכול האופטימלי הוא די משתנה, כמו כמות מטריצה אוטולרית או פיברוזיס יכול להשתנות במידה ניכרת שריר הלב האנושי נכשל. אם הרקמה עדיין להיות מחובר תקיף בזמן הדיסוציאציה, עם רק כמה myocytes קיימא שוחרר, הגדלת זמן העיכול בשלבים של 5 דקות ובאופן קבוע לבדוק מיוציטים חינם ואת המרקם של הפרוסות מומלץ. אם הרקמה נשארת מעוקלת לאחר תקופות ממושכות (>45 דקות), הגדלת הריכוז של קולגנאז בשלבים של 1 מ"ג/מ"ל או בדיקת אצווה אנזיםשונה מומלץ 16. הערכים המתאימים המוצגים בעבודה זו יכולים לשמש פריימר לבידוד חזק של cardiomyocytes, אבל התנאים לתשואה אופטימלית וכדאיות עשויים להיות מעודנים בכל מעבדה, תוך מתן בחשבון את השונות הגדולה של פעילויות אנזימים וחוקות רקמות. יתרון של השיטה הוא כי בשל כמויות קטנות של רקמה נדרשת זרימת עבודה פשוטה בקבוצות קטנות, מספר בדיקות ניתן לבצע במקביל. לכן, פרוטוקול אופטימלי ניתן להשיג במהירות.

הדור של פרוסות שריר הלב באיכות גבוהה דורש ויברטום דיוק גבוה. הצורך בכלי רקמות או ויברטום מדויקים הוא חסרון אפשרי של השיטה, כי הוא לא זמין בקלות בכל מעבדה. המכשיר המשמש למחקר זה מתואר ביתני יותר במקום אחר14,15. התקנים שונים שימשו בהצלחה ליצירת פרוסות שריר הלב על-ידי קבוצותאחרות 33,34,35. לפיכך, אם ניתן לעמוד בהגדרות של מהירות מתקדמת, משרעת להב ותדר תנודות וכיוון להב אופקי עם הטיית z מתחת ל-0.1 μm, חיתוך מוצלח ובידוד צריכים להיות אפשריים עם ויברטום אחר. בנוסף, חיתוך הרקמה הוא משוכלל ומאריך באופן משמעותי את משך הפרוטוקול (כ 1-2 שעות). השימוש BDM כסוכן מכני ניתוק יש השפעות מגן על ידי הפחתת חשיפה לאנרגיה תאית, פגיעה איסכמית, ו hypercontraction26,,36,37. למרות ההשפעה השלילית inotropic של BDM הוצג במהירות הפיכה לאחרשטיפה 38,39, לא ברור אם BDM עשויות להיות השלכות לא ידועות על תפקוד cardiomyocyte40. מחקר זה מראה כי תאים יכולים להיות מבודדים עם תשואות גבוהות לאחר זמני אחסון רקמות של עד 36 שעות, כי cardiomyocytes אנושי יכול להיות תרבותי עד שלושה ימים לאחר הבידוד עםשיטה זו 17. לא שמנו לב להבדלים פונקציונליים או מבניים בין מיוציטים עם זמני אחסון קצרים וארוך. עם זאת, זה לא הוערך באופן שיטתי. מצד שני, עבור לבבות ארנב שלמים, הראו כי הבדלים פונקציונליים בין לבבות טריים ולבבות שנחשפו לאיסכמיה קרה בתמיסה חוץ תאית המכילה 30 mM BDM היוזניחים 31, ואותו הדבר עשוי להיות נכון במקרה זה.

הפרוטוקול המוצג מספק בסיס מוצק לכל מיני ניסויים עם קרדיומיוציטים חדריים מבודדים, עשוי להיות בעל ערך רב במיוחד למחקר על דגימות שריר הלב האנושי. עם כמה התאמות, הבידוד של תאי לב אחרים, כגון פיברובלסטים או תאים אנדותל גם נראה אפשרי41. מכיוון שזה דורש רק כמויות קטנות של רקמות שניתן לשלוח בתמיסת אחסון קר ממעבדות אחרות, יישום הפרוטוקול עשוי להפחית את מספר חיות המעבדה שהוקרבו. למעשה, הפרוטוקול הוחל בהצלחה על רקמת לב ארנבת וארנבת. יתר על כן, כמו ניסויים עם פרוסות רקמת שריר הלב מעובד לטווח ארוך להגדיל21,33,42 ומשופרים כל הזמן כדי לספק תנאי תרבותאופטימליים 15,43,44 ,44, השיטה ניתן להחיל בקלות לאחר טיפוח פרוסה. בידוד תא יחיד ממשיקרדיום מעובד ולכן עשוי לעזור לאפיין שינויים cardiomyocytes לאחר התערבויות תרופתיות או פיזיות במבחנה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

לסופרים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

ברצוננו להודות לאנדראס דנדורפר ממרכז וולטר-ברנדל לרפואה ניסיונית, LMU מינכן, על העזרה בפרוטוקול החיתוך. על מתן דגימות רקמת שריר הלב האנושית ברצוננו להודות Ghazali Minabari וכריסטיאן היים מהמחלקה לכירורגיית לב, בית החולים האוניברסיטאי Erlangen, הנדריק Milting מן אריך & חנה קלסמן מכון, Ruhr-אוניברסיטת בוכום מוהנד Alkassar מהמחלקה לקרדיולוגיה ילדים, בית החולים האוניברסיטאי Erlangen. לתמיכה עם ציתום זרימה ברצוננו להודות סיימון Völkl ועמיתיו ממרכז המחקר תרגום (TRC), בית החולים האוניברסיטאי Erlangen. ברצוננו גם להודות לורנץ מקארגו וסלין גרינינגר מהמכון לפיזיולוגיה תאית ומולקולרית ארנגן על תמיכה טכנית מצוינת.

עבודה זו נתמכה על ידי DZHK (המרכז הגרמני לחקר לב וכלי דם), על ידי המרכז הבינתחומי למחקר קליני (IZKF) בבית החולים האוניברסיטאי של אוניברסיטת Erlangen-Nürnberg, ואוניברסיטת Erlangen-Nürnberg.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
2,3-butanedionemonoxime Carl Roth 3494.1 Purity>99%
Bovine serum albumin Carl Roth 163.2
CaCl2 Carl Roth 5239.2
Creatine monohydrate Alfa Aesar B250009
Glucose Merck 50-99-7
HEPES Carl Roth 9105.3
KCl Carl Roth P017.1
KH2PO4 Carl Roth 3904.2
L-glutamic acid Fluka Biochemica 49450
Low melting-point agarose Carl Roth 6351.5
MgCl2 x 6H2O Carl Roth A537.1
MgSO4 Sigma Aldrich M-7506
NaCl Carl Roth 9265.1
NaHCO3 Carl Roth 8551.2
Paraformaldehyde Sigma Aldrich P6148
Taurine Sigma Aldrich T8691
Dyes
Di-8-ANEPPS Thermo Fisher Scientific D3167
Fluo-4 AM Thermo Fisher Scientific F14201
FluoVolt Thermo Fisher Scientific F10488
Enzymes
Collagenase CLS type I Worthington LS004196 Used for human tissue at 4 mg/mL
(activity: 280 U/mg)
Collagenase CLS type II Worthington LS004176 Used for rat tissue at 1.5 mg/mL
(activity 330 U/mg)
Protease XIV Sigma Aldrich P8038 Used for rat tissue at 0.5 mg/mL
(activity ≥ 3.5 U/mg)
Proteinase XXIV Sigma Aldrich P5147 Used for human tissue at 0.5 mg/mL
(activity: 7-14 U/mg)
Material
Cell analyzer (LSR Fortessa) BD Bioscience 649225
Centrifuge tube, 15 mL Corning 430790
Centrifuge tube, 50 mL Corning 430829
Compact shaker Edmund Bühler KS-15 B control Agitation direction: horizontal
Disposable plastic pasteur-pipettes Carl Roth EA65.1 For cell trituration use only pipettes with an inner tip diameter ≥2 mm
Forceps FST 11271-30
Heatblock VWR BARN88880030
Nylon net filter, 180 µm Merck NY8H04700
TC Dish 100, Standard Sarstedt 83.3902
TC Dish 35, Standard Sarstedt 83.3900
TC Dish 60, Standard Sarstedt 83.3901
Vibratome (VT1200S) Leica 1491200S001 Includes VibroCheck for infrared-assisted correction of z-deflection

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Powell, T., Twist, V. W. A rapid technique for the isolation and purification of adult cardiac muscle cells having respiratory control and a tolerance to calcium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 13, 258-283 (1976).
  2. Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51, 288-298 (2011).
  3. Isenberg, G., Klockner, U. Calcium Tolerant Ventricular Myocytes Prepared by preincubation in a KB Medium. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 395, 6-18 (1982).
  4. Beuckelmann, D. J., Näbauer, M., Erdmann, E. Intracellular calcium handling in isolated ventricular myocytes from patients with terminal heart failure. Circulation. 85, 1046-1055 (1992).
  5. Brixius, K., Hoischen, S., Reuter, H., Lasek, K., Schwinger, R. H. G. Force/shortening-frequency relationship in multicellular muscle strips and single cardiomyocytes of human failing and nonfailing hearts. Journal of Cardiac Failure. 7, 335-341 (2001).
  6. Peeters, G. A., et al. Method for isolation of human ventricular myocytes from single endocardial and epicardial biopsies. The American Journal of Physiology. 268, 1757-1764 (1995).
  7. Coppini, R., et al. Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples. Journal of Visualized Experiments. (86), e51116 (2014).
  8. Seidel, T., et al. Sheet-Like Remodeling of the Transverse Tubular System in Human Heart Failure Impairs Excitation-Contraction Coupling and Functional Recovery by Mechanical Unloading. Circulation. 135, 1632-1645 (2017).
  9. Hartmann, N., et al. Antiarrhythmic effects of dantrolene in human diseased cardiomyocytes. Heart Rhythm. 14, 412-419 (2017).
  10. Bkaily, G., Sperelakis, N., Doane, J. A new method for preparation of isolated single adult myocytes. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 247, 1018-1026 (1984).
  11. Trube, G. Enzymatic Dispersion of Heart and Other Tissues. Single-Channel Recording. Sakmann, B., Neher, E. , Springer. Boston, MA. 69-76 (1983).
  12. Schlüter, K. D., Schreiber, D. Adult Ventricular Cardiomyocytes. Basic Cell Culture Protocols. 290, 305-314 (2004).
  13. Del Monte, F., et al. Restoration of contractile function in isolated cardiomyocytes from failing human hearts by gene transfer of SERCA2a. Circulation. 100, 2308-2311 (1999).
  14. Brandenburger, M., et al. Organotypic slice culture from human adult ventricular myocardium. Cardiovascular Research. 93, 50-59 (2012).
  15. Fischer, C., et al. Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro. Nature Communications. 10, (2019).
  16. Worthington-Biochemical. Worthington Tissue Dissociation Guide. , Available from: http://www.worthington-biochem.com/tissuedissociation/default.html (2019).
  17. Seidel, T., et al. Glucocorticoids preserve the t-tubular system in ventricular cardiomyocytes by upregulation of autophagic flux. Basic Research in Cardiology. 114 (6), 47 (2019).
  18. Lipsett, D. B., et al. Cardiomyocyte substructure reverts to an immature phenotype during heart failure. Journal of Physiology. 597, 1833-1853 (2019).
  19. Watson, S. A., et al. Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals. Nature Protocols. 12, 2623-2639 (2017).
  20. Guo, G. R., et al. A modified method for isolation of human cardiomyocytes to model cardiac diseases. Journal of Translational Medicine. 16, 1-9 (2018).
  21. Kang, C., et al. Human Organotypic Cultured Cardiac Slices: New Platform For High Throughput Preclinical Human Trials. Scientific Reports. 6, 1-13 (2016).
  22. Gomez, L. A., Alekseev, A. E., Aleksandrova, L. A., Brady, P. A., Terzic, A. Use of the MTT assay in adult ventricular cardiomyocytes to assess viability: Effects of adenosine and potassium on cellular survival. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 29, 1255-1266 (1997).
  23. Zimmerman, A. N. E., Hülsmann, W. C. Paradoxical influence of calcium ions on the permeability of the cell membranes of the isolated rat heart. Nature. 211, 646-647 (1966).
  24. Piper, H. M. The calcium paradox revisited An artefact of great heuristic value. Cardiovascular Research. 45, 123-127 (2000).
  25. Boink, A. B. T. J., Ruigrok, T. J. C., de Moes, D., Maas, A. H. J., Zimmerman, A. N. E. The effect of hypothermia on the occurrence of the calcium paradox. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 385, 105-109 (1980).
  26. Mulieri, L. A., Hasenfuss, G., Ittleman, F., Blanchard, E. M., Alpert, N. R. Protection of human left ventricular myocardium from cutting injury with 2,3-butanedione monoxime. Circulation Research. 65, 1441-1444 (1989).
  27. Busselen, P. Effects of sodium on the calcium paradox in rat hearts. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 408, 458-464 (1987).
  28. Voigt, N., Zhou, X. B., Dobrev, D. Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+Transients and Membrane Currents. Journal of Visualized Experiments. (77), e50235 (2013).
  29. Leor, J., Kloner, R. An Experimental Model Examining the Role of Magnesium in the Therapy of Acute Myocardial Infarction. The American Journal of Cardiology. 75, 1292-1293 (1995).
  30. Herzog, W. R., et al. Timing of Magnesium Therapy Affects Experimental Infarct Size. Circulation. 92, 2622-2626 (1995).
  31. Stringham, J. C., Paulsen, K. L., Southard, J. H., Mentzer, R. M., Belzer, F. O. Forty-hour preservation of the rabbit heart: Optimal osmolarity, [Mg2+], and pH of a modified UW solution. The Annals of Thoracic Surgery. 58, 7-13 (1994).
  32. Hall, S. K., Fry, C. H. Magnesium affects excitation, conduction, and contraction of isolated mammalian cardiac muscle. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 263 (2), Pt 2 622-633 (1992).
  33. Bussek, A., et al. Tissue Slices from Adult Mammalian Hearts as a Model for Pharmacological Drug Testing. Cellular Physiology and Biochemistry. 24, (2009).
  34. Wang, K., et al. Living cardiac tissue slices: An organotypic pseudo two-dimensional model for cardiac biophysics research. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 115, 314-327 (2014).
  35. Thomas, R. C., et al. A Myocardial Slice Culture Model Reveals Alpha-1A-Adrenergic Receptor Signaling in the Human Heart. Journal of the American College of Cardiology: Basic to Translational Science. 1, 155-167 (2016).
  36. Perreault, C. L., et al. Cellular basis of negative inotropic effect of 2,3-butanedione monoxime in human myocardium. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 263, 503-510 (1992).
  37. Vahl, C. F., Bonz, A., Hagl, C., Hagl, S. Reversible desensitization of the myocardial contractile apparatus forcalcium: A new concept for improving tolerance to cold ischemia in human myocardium. European Journal of Cardio-thoracic Surgery. 8, 370-378 (1994).
  38. Horiuti, K., et al. Mechanism of action of 2, 3-butanedione 2-monoxime on contraction of frog skeletal muscle fibres. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 9, 156-164 (1988).
  39. Li, T., Sperelakis, N., Teneick, R. E., Solaro, R. J. Effects of diacetyl monoxime on cardiac excitation-contraction coupling. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 232, 688-695 (1985).
  40. Sellin, L. C., Mcardle, J. J. Multiple Effects of 2,3 Butanedione Monoxime. Pharmacology and Toxicology. 74, 305-313 (1993).
  41. Eghbali-Webb, M., Agocha, A. E. A simple method for preparation of cultured cardiac fibroblasts from adult human ventricular tissue. Novel Methods in Molecular and Cellular Biochemistry of Muscle. Pierce, G. N., Claycomb, W. C. , Springer US. 195-198 (1997).
  42. Camelliti, P., et al. Adult human heart slices are a multicellular system suitable for electrophysiological and pharmacological studies. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51, 390-398 (2011).
  43. Watson, S. A., et al. Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro. Nature Communications. 10, 2168 (2019).
  44. Watson, S. A., Terracciano, C. M., Perbellini, F. Myocardial Slices: an Intermediate Complexity Platform for Translational Cardiovascular Research. Cardiovascular Drugs and Therapy. 33, 239-244 (2019).

Tags

ביולוגיה גיליון 159 אדם אי ספיקת לב פרוסות שריר הלב בידוד לב-ריר- לב ויברטוט מיוציטים מתכווץ הדמיית סידן צימוד התכווצות לב
בידוד של קרדיומיוציטים חדריים אנושיים מפרוסות שריר הלב ויסטום-לחתוך
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fiegle, D. J., Volk, T., Seidel, T.… More

Fiegle, D. J., Volk, T., Seidel, T. Isolation of Human Ventricular Cardiomyocytes from Vibratome-Cut Myocardial Slices. J. Vis. Exp. (159), e61167, doi:10.3791/61167 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter