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Biology

Isolamento dei cardiomiociti ventricolari umani dalle fette miocardici Vibratome-Cut

Published: May 10, 2020 doi: 10.3791/61167
Automatic Translation
1, 1,2, 1,2
1Institute of Cellular and Molecular Physiology, Friedrich-Alexander University Erlangen-Nürnberg, 2Muscle Research Center Erlangen (MURCE), Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

Summary

Presentato è un protocollo per l'isolamento dei cardiomiociti ventricolari umani e animali da fette miocardici tagliate con vibratome. È possibile ottenere rese elevate di cellule tolleranti al calcio (fino a 200 cellule/mg) da piccole quantità di tessuto (<50 mg). Il protocollo è applicabile al miocardio esposto all'ischemia fredda fino a 36 h.

Abstract

L'isolamento dei miociti cardiaci ventricolari dai cuori animali e umani è un metodo fondamentale nella ricerca cardiaca. I cardiomiociti animali sono comunemente isolati dalla perfusione coronarica con enzimi digestivi. Tuttavia, isolare i cardiomiociti umani è difficile perché gli esemplari miocardici umani di solito non consentono la perfusione coronarica e protocolli di isolamento alternativi producono scarse rese di cellule vitali. Inoltre, gli esemplari miocardiali umani sono rari e regolarmente disponibili presso le istituzioni con cardiochirurgia in loco. Ciò ostacola la traduzione dei risultati dai cardiomiociti animali a quello umano. Descritto qui è un protocollo affidabile che consente l'isolamento efficiente dei miociti ventricolari dal miocardio umano e animale. Per aumentare il rapporto superficie-volume riducendo al minimo i danni alle cellule, le fette di tessuto miocardiale di 300 m di spessore vengono generate da campioni miocardici con un vibrato. Le fette di tessuto vengono poi digerito con proteasi e collagenasi. Il miocardio del ratto è stato utilizzato per stabilire il protocollo e quantificare le rese dei miociti vitali e tolleranti al calcio mediante il conteggio delle cellule citometriche di flusso. Il confronto con il metodo di parti di tessuto comunemente usato ha mostrato rese significativamente più elevate di cardiomiociti a forma di asta (41,5 x 11,9 contro 7,89 x 3,6%, p < 0,05). Il protocollo è stato tradotto in miocardio umano in mancanza e non in mancanza, dove le rese erano simili a quelle del miocardio di ratto e, ancora una volta, nettamente più elevate rispetto al metodo del pezzo di tessuto (45,0 x 15,0 contro 6,87 : 5,23 cellule/mg, p < 0,05). In particolare, con il protocollo presentato è possibile isolare un numero ragionevole di cardiomiociti umani vitali (9-200 cellule/mg) da quantità minime di tessuto (<50 mg). Così, il metodo è applicabile al miocardio sano e in mancanza da cuori umani e animali. Inoltre, è possibile isolare i miociti eccitabili e contrattili da campioni di tessuto umano conservati fino a 36 h in soluzione cardioplegica fredda, rendendo il metodo particolarmente utile per i laboratori presso le istituzioni senza cardiochirurgia in loco.

Introduction

Una tecnica seminale che ha spianato la strada a importanti approfondimenti sulla fisiologia cardiomiocite è l'isolamento dei cardiomiociti ventricolari viventi dai cuori intatti1. I cardiomiociti isolati possono essere utilizzati per studiare la normale struttura cellulare e la funzione, o le conseguenze degli esperimenti in vivo; ad esempio, per valutare i cambiamenti nell'elettrofisiologia cellulare o nell'accoppiamento eccitazione-contrazione nei modelli animali di malattia cardiaca. Inoltre, cardiomiociti isolati possono essere utilizzati per la coltura cellulare, interventi farmacologici, trasferimento genico, ingegneria tissunte, e molte altre applicazioni. Pertanto, metodi efficienti per l'isolamento cardiomiocato sono di fondamentale importanza per la ricerca cardiaca di base e traslazionale.

I cardiomiociti di piccoli mammiferi, come i roditori, e da mammiferi più grandi, come maiali o cani, sono comunemente isolati dalla perfusione coronarica del cuore con soluzioni contenenti collagene grezze e/o proteasi. Questo è stato descritto come il metodo "gold standard" per l'isolamento cardiomiocato, con conseguente resa fino al 70% delle cellule vitali2. L'approccio è stato utilizzato anche con i cuori umani, con conseguente cardiomiocazione accettabile produce3,4,5. Tuttavia, poiché la perfusione coronarica è fattibile solo se il cuore intatto o un grande cuneo miocardiale contenente un ramo dell'arteria coronaria è disponibile, la maggior parte degli esemplari cardiaci umani non sono adatti a questo approccio a causa delle loro piccole dimensioni e della mancanza di una vascolatura appropriata. Pertanto, l'isolamento dei cardiomiociti umani è impegnativo.

I campioni miocardali umani sono per lo più costituiti da blocchi di tessuto di dimensioni variabili (circa 0,5 x 0,5 x 0,5 cm a 2 x 2 x 2 cm), ottenuti attraverso biopsie endomiocardali6, miectomie setttiva7, impianti VAD8, o da cuori espiantati9. Le procedure più comuni per l'isolamento cardiomiocato iniziano con l'amatare il tessuto utilizzando forbici o un bisturi. I contatti tra cellule vengono poi interrotti dall'immersione nei tamponi senza calcio o a basso contenuto di calcio. Questo è seguito da più passaggi di digestione con estratti di enzimi grezzi o enzimi purificati come proteasi (ad esempio, trypsina), collagenasi, ialuronidae, o elastase, con conseguente disintegrazione della matrice extracellulare e liberazione dei cardiomiociti. In una fase finale, critica, una concentrazione fisiologica di calcio deve essere accuratamente ripristinata, o il danno cellulare può verificarsi a causa del calcio-paradosso10,11,12. Questo approccio di isolamento è conveniente, ma in genere inefficiente. Per esempio, uno studio ha scoperto che quasi 1 g di tessuto miocardiale era necessario per ottenere un numero sufficiente di cardiomiociti adatti per esperimenti successivi13. Una possibile ragione per basse rese è il metodo relativamente duro di macinare il tessuto. Questo può danneggiare in particolare i cardiomiociti situati ai bordi del pezzo anche se questi miociti sono più probabilità di essere rilasciato dalla digestione ezimatica.

Un altro aspetto che può influenzare l'efficienza di isolamento e la qualità delle cellule ottenute da campioni umani è la durata dell'ischemia del tessuto. La maggior parte dei protocolli menzionano i tempi di trasporto brevi al laboratorio come prerequisito per buoni risultati. Questo limita lo studio dei cardiomiociti ventricolari umani ai laboratori con strutture di cardiochirurgia nelle vicinanze. Insieme, queste restrizioni ostacolano la verifica di importanti risultati da modelli animali nei cardiomiociti umani. Sono quindi auspicabili protocolli di isolamento migliorati che consentono rese elevate di cardiomiocazione da piccole quantità di tessuto, preferibilmente senza gravi danni dopo lunghi tempi di trasporto.

Descritto qui è un protocollo di isolamento basato sulla digestione ezimatica di sottili fette di tessuto miocardiale generate con un vibratome14,15. Dimostriamo che l'isolamento dalle fette di tessuto è molto più efficiente di quello dei pezzi di tessuto macinati con le forbici. Il metodo descritto non solo consente elevate rese di cardiomiociti umani vitali da piccole quantità di tessuto miocardico, ma è applicabile anche ai campioni immagazzinati o trasportati in soluzione cardioplegica fredda per un massimo di 36 h.

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Protocol

Tutti gli esperimenti con i ratti sono stati approvati dal Comitato per la cura e l'uso degli animali Mittelfranken, Baviera, Germania. La raccolta e l'uso di campioni di tessuto cardiaco umano è stato approvato dagli Institutional Review Boards dell'Università di Erlangen-Nornberg e della Ruhr-University Bochum. Gli studi sono stati condotti secondo le linee guida della Dichiarazione di Helsinki. I pazienti hanno dato il loro consenso informato scritto prima della raccolta dei tessuti.

I ratti Wistar femminili (150-200 g) sono stati ottenuti commercialmente, anetitizzati iniettando 100 mg/kg di tiopentale-sodio intraperitonealmente, ed eutanasia dalla lussazione cervicale seguita da toracacotomia ed escissione del cuore. I campioni di tessuto cardiaco umano sono stati raccolti dal nucleo apico sinistro-ventricolare durante l'impianto di dispositivi di assistenza meccanica, dalla myectomia settica, dalla tetralogia della chirurgia correttiva di Fallot o dalla parete libera sinistra-ventricolare dei cuori espiantati. Il seguente protocollo descrive l'isolamento dal tessuto ventricolare umano. L'isolamento dei cardiomiociti del ratto è stato eseguito di conseguenza, ma con diversi enzimi (vedi Tabella dei Materiali). Un flusso di lavoro schematico del protocollo è illustrato nella Figura 1.

1. Preparazione di buffer, soluzioni ed enzimi

  1. Preparare i buffer e le soluzioni come elencato nella tabella 1.
  2. Soluzioni di riscaldamento 1, 2, 3 e la soluzione di Tyrode modificata a 37 gradi centigradi. Conservare la soluzione di taglio a 4 gradi centigradi fino all'uso.
    NOTA: per 1–2 fette miocardali sono necessarie per un totale di circa 15 mL, 8 mL e 5 mL di soluzioni 1, 2 e 3 sono necessari per l'isolamento in un piatto di coltura tissure da 35 mm. Scalare di conseguenza per gli isolamenti miociti simultanei in più piatti. La soluzione di taglio può essere congelata e mantenuta a -20 gradi centigradi per diversi mesi.
  3. Pesare 1 mg di proteinasi XXIV (vedi Tabella dei materiali) in un tubo di centrifugazione prechilled di 15 mL e conservare sul ghiaccio fino all'uso. Questo è per l'elaborazione di un campione. Aumentare l'importo di conseguenza. Non mescolare la proteinasi e il collagene.
  4. Pesare 8 mg di CLSI collagenase (vedi Tabella dei Materiali) in un tubo di centrifugamento prechilled 15 mL e conservare sul ghiaccio fino all'uso. Questo è per l'elaborazione di un campione. Aumentare l'importo di conseguenza. Non mescolare la proteinasi e il collagene.
    CAUTION: Indossare una maschera per il viso o lavorare sotto un cappuccio di fumi per evitare l'inalazione di polvere enzimatica.
    NOTA: L'attività enzimatica può variare in lotti diversi. Pertanto, la concentrazione ottimale può differire e deve essere determinata con ogni enzima appena acquistato16.

2. Stoccaggio e trasporto di tessuto miocardiale

  1. Conservare e trasportare campioni cardiaci umani in soluzione di taglio raffreddata a 4 gradi centigradi (Tabella 1).
  2. Utilizzare la stessa soluzione per un'ulteriore lavorazione dei tessuti e affettatura vibrato.
    NOTA: Le biopsie e i campioni di cuore chirurgico devono essere trasferiti immediatamente alla soluzione di taglio a 4 gradi centigradi e possono quindi essere conservati o trasportati a 4 gradi centigradi per un massimo di 36 h prima dell'applicazione del presente protocollo.

3. Lavorazione e sezionamento del tessuto

NOTA: Il protocollo per il sezionamento dei tessuti segue Fischer et al.15.

  1. Taglio del blocco di tessuto
    CAUTION: Il tessuto cardiaco umano è potenzialmente infettivo. Utilizzare sempre l'usura protettiva e seguire le norme di sicurezza del vostro istituto. Maneggiare con attenzione le lame usate e scartare nei contenitori di sicurezza.
    1. Mettere il campione in un piatto di coltura tissunte da 100 mm riempito con una soluzione di taglio a freddo da 20 mL e conservarlo su una piastra raffreddata di 4 gradi centigradi.
    2. Rimuovere il tessuto fibrotico in eccesso e il grasso epicardiale con un bisturi. In caso di campione transmurale, rimuovere gli strati di trabeculae e tessuti vicino all'endocardio.
      NOTA: Il tessuto fibrotico è rigido e appare bianco. Il grasso è tipicamente morbido e appare da bianco a giallo. Gli strati di tessuto trabeculae ed endocardili possono essere identificati dalla loro composizione di tessuto sciolto e da un orientamento della fibra non allineato rispetto al miocardio degli strati epicardiali
    3. Per una lavorazione ottimale del vibratome, tagliare blocchi di tessuto rettangolari di circa 8 mm x 8 mm x 8 mm con un bisturi da un campione di tessuto più grande. Per le biopsie più piccole saltare questo passaggio e passare all'incorporamento di agarose.
  2. Incorporare il tessuto cardiaco nell'agarose a basso punto di fusione
    1. Far bollire 400 mg di agarose a basso punto di fusione in 10 mL di soluzione di taglio in un bicchiere di vetro.
      CAUTION: Indossare guanti e occhiali di sicurezza per evitare ustioni. Maneggiare vetreria calda solo con usura di protezione termica.
    2. Riempire una siringa da 10 mL con il gel agarose caldo e disciolto. Sigillare la siringa e lasciare che l'agarose sia equilibrato in un bagno d'acqua di 37 gradi centigradi per almeno 15 minuti.
    3. Utilizzare le forcelle per posizionare il campione cardiaco tagliato o la biopsia in un piatto pulito di coltura tissutale da 35 mm con l'epicentro rivolto verso il basso e rimuovere il liquido in eccesso con un tampone sterile.
    4. Versare l'agarose equilibrata (punto 3.2.2) sul tessuto svuotando la siringa. Fissare il tessuto contro il movimento con le forcelle mentre versa l'agarose. Assicurarsi che il tessuto sia completamente immerso nell'agarose.
    5. Posizionare immediatamente il piatto sul ghiaccio e lasciare che l'agarose solidifica per 10 min.
  3. Affettare il miocardio
    1. Montare una nuova lama di rasoio sul supporto della lama del vibratome e calibrare il vibratomo regolando la deflessione z della lama, se possibile.
      NOTA: questo protocollo utilizza un vibratome con un dispositivo di calibrazione a infrarossi per allineare la lama in posizione orizzontale con una minima deviazione z (deflessione misurata <0,1 m).
    2. Utilizzare un bisturi per accisa su un blocco di tessuto agarose che si adatta al supporto del campione del vibratome. Per garantire la stabilità, assicurarsi che il tessuto sia ancora sufficientemente immerso nell'agarose (margini di agarose - 8 mm).
    3. Fissare il blocco di agarose al supporto del campione con un sottile strato di colla cianoacrilato e pressione delicata.
    4. Posizionare il supporto del campione con il tessuto nel bagno vibratome. Riempire il bagno con la soluzione di taglio e tenere a 4-6 gradi centigradi per tutta la lavorazione con ghiaccio tritato, riempito nel serbatoio di raffreddamento esterno del vibratome.
    5. Generare fette spesse 300 m con una velocità di avanzamento di 0,1 mm/s, una frequenza oscillante di 80 Hz, un'ampiezza laterale di 1,5 mm e un angolo di lama di 15 gradi. Quando si maneggiano le fette, tenere l'agarose invece del tessuto stesso per evitare danni ai tessuti. Conservare le fette nella soluzione di taglio a 4 gradi centigradi per un massimo di 2 h, se necessario.
      NOTA: I cardiomiociti sono orientati in parallelo all'epicardio. Pertanto, è importante tagliare in parallelo all'epicardio per evitare danni eccessivi di miocita. Si consiglia di scartare le prime 1-3 fette, in quanto solo le fette uniformi di spessore costante devono essere utilizzate per l'isolamento. Per le piccole biopsie tissu/tessuto, tuttavia, scartare solo la prima fetta.
    6. Controllare l'allineamento dei cardiomiocti sotto un microscopio leggero standard con un ingrandimento di 40-100x.

4. Digestione dei tessuti

  1. Posizionare la piastra di calore sullo shaker di laboratorio e riscaldarla a 37 gradi centigradi. Avviare lo shaker di laboratorio a 65 giri/min.
  2. Sciogliere la proteinasi (preparata al punto 1.3) in 2 mL della soluzione 1 (passo 1.1 e 1.2) e incubare a 37 gradi centigradi fino all'uso. Non mescolare la proteinasi e il collagene.
  3. Sciogliere il collagene (preparato al punto 1.4) in 2 mL della soluzione 1 (passo 1.1 e 1.2) e incubare a 37 gradi centigradi fino all'uso. Non mescolare la proteinasi e il collagene.
    CAUTION: Indossare occhiali protettivi e guanti, perché gli enzimi disciolti possono causare lesioni cutanee e oculari.
  4. Aggiungere il cloruro di calcio (CaCl2) alla soluzione contenente collagenasi (preparata al punto 4.3) ad una concentrazione finale di 5 M.
  5. Utilizzare le forcelle per trasferire una fetta di tessuto dal bagno vibratomo a un piatto pulito di coltura tissutale da 60 mm riempito con 5 mL di soluzione di taglio prechilled (passo 1.1 e 1.2) e tenere sul ghiaccio.
  6. Rimuovere con cura l'agarose dal tessuto miocardiale con lama o forcelle.
    NOTA: Evitare l'eccesso di tensione e lo stress da taglio sulle fette miocardici, perché possono danneggiare i cardiomiociti.
  7. Per eseguire il lavaggio iniziale, posizionare un piatto pulito di coltura del tessuto di 35 mm sulla piastra di calore e riempirlo con 2 mL di soluzione preriscaldato (37 gradi centigradi) 1. Trasferire 1-2 fette miocardali sul piatto preparato con le forpe. Aspirare la soluzione con una pipetta da 1 mL ed eseguire i passaggi di lavaggio 2x per rimuovere i resti della soluzione di taglio.
    NOTA: Non aspirare le fette cardiache. Le soluzioni e le fette devono rimanere ad una temperatura costante di 35 gradi centigradi sulla piastra di calore agitata. Se necessario, regolare la temperatura della piastra di calore.
  8. Rimuovere la soluzione 1 dal piatto e aggiungere 2 mL della soluzione proteinasi (punto 4.2). Incubare per 12 minuti sulla piastra di calore a 65 rpm.
  9. Lavare 2x con 2 mL di soluzione preriguermata 1 (37 gradi centigradi).
  10. Rimuovere la soluzione 1 dal piatto e aggiungere 2 mL di soluzione di collagenase (punti 4.3 e 4.4). Incubare almeno 30 min sulla piastra di calore a 65 rpm.
  11. Controllare i miociti individuali gratuiti a 30, 35, 40 min, ecc., mettendo il piatto sotto un microscopio leggero. Lavorate rapidamente per evitare un raffreddamento significativo della soluzione.
    NOTA: Il tempo di digestione richiesto può variare a seconda della costituzione dei tessuti e del grado di fibrosi. Non appena il tessuto diventa visibilmente morbido e si dissocia facilmente quando viene tirato delicatamente, è stato raggiunto il tempo di digestione ottimale. Se è disponibile un tessuto sufficiente, diverse fette possono essere digeriti in parallelo con tempi di digestione variabili.
  12. Quando il tessuto viene digerito e i singoli miociti sono visibili (punto 4.11), lavare 2x con 2 mL di soluzione preriguerrata 2 (37 gradi centigradi) e riempire nuovamente con 2 mL.

5. Dissociazione dei tessuti

  1. Dissociare le fette di tessuto digerito con le forcate tirando con attenzione le fibre a parte.
  2. Pipetta con attenzione più volte con una pipetta Pasteur monoioio (diametro di apertura >2 mm).
    NOTA: L'uso di forcette e pipettamento può indurre stress meccanico e causare danni da cardiomiocite. Tuttavia, è un passo cruciale per la separazione delle cellule. Utilizzare le forcepi fini per ridurre al minimo i danni alle cellule e dissociare attentamente le fette in pezzi più piccoli.
  3. Controllare i cardiomiociti a forma di asta liberati al microscopio leggero.

6. Reintroduzione della concentrazione fisiologica di calcio

  1. Aumentare lentamente la concentrazione di calcio da 5 M a 1,5 mM mentre si agita a 35 gradi centigradi sulla piastra di calore. Utilizzare soluzioni di stock CaCl2 da 10 mM e 100 mM. Passaggi consigliati: 20, 40, 80, 100, 150, 200, 400, 800, 1.200, 1.500 M. Consentire alle cellule di adattarsi ai livelli di calcio aumentati in intervalli di incubazione di 5 minuti tra ogni passaggio.
  2. Rimuovere i pezzi di tessuto non digeriti con attenzione con le fopate o filtrare le sospensioni cellulari attraverso una rete di nylon con dimensioni di poro di 180 m alla fine dell'aumento del calcio.

7. Rimozione dell'agente disaccoppiamento meccanico

  1. Fermare l'agitazione e rimuovere lentamente un terzo della soluzione (700 L) dall'alto con una pipetta da 1.000 L. Evitare l'aspirazione dei cardiomiociti.
    NOTA: Se il tessuto non digerito è stato rimosso, i cardiomiociti si accumulano al centro del piatto, il che facilita l'aspirazione di una soluzione senza cellule. In caso contrario, trasferire la soluzione cellulare in un tubo di centrifuga di 15 mL e consentire alle cellule di sedimentarsi per 10 min a 35 gradi centigradi, quindi aspirare 700 L del supernante e scartare, risospendere le cellule, trasferirle in un piatto di coltura velico di 35 mm e procedere con il punto 7.2.
  2. Aggiungere 700 L della soluzione 3 alle cellule, riprendere l'agitazione sulla piastra di calore e incubare per 10 min.
  3. Ripetere i passaggi 7.1 e 7.2.
  4. Trasferire la soluzione in un tubo di centrifuga di 15 mL e lasciare che i cardiomiociti si sedimentino per un minimo di 10 min e un massimo di 30 min a temperatura ambiente o girare a 50 x g per 1 min. Rimuovere completamente il supernatant e risuspendere nella soluzione di Tyrode modificata o nel buffer di sperimentazione desiderato.
    NOTA: i cardiomiociti possono essere conservati nella soluzione di Tyrode modificata(Tabella 1) per diverse ore a 37 gradi centigradi e 5% di CO2 prima dell'uso.
  5. Verificare la qualità delle cellule con un microscopio leggero standard con ingrandimento 40x e 200x.
    NOTA: Circa il 30-50% dei cardiomiociti deve essere a forma di asta, liscio senza bleb di membrana e visualizzare chiare striature incrociate. Solo il 5-10% delle cellule vitali dovrebbe mostrare contrazioni spontanee.

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Representative Results

Per verificare l'efficienza dell'isolamento, il protocollo è stato utilizzato con il miocardio di ratto e il numero risultante di miociti vitali è stato confrontato con i numeri ottenuti dall'isolamento tramite perfusione coronarica e dall'isolamento da piccoli blocchi di tessuto (isolamento dei blocchi, Figura 2). L'isolamento dei blocchi e l'isolamento dalle fette di tessuto sono stati eseguiti dagli stessi cuori. Per l'isolamento tramite perfusione coronarica, tuttavia, è stato utilizzato tutto il cuore. La perfusione coronarica ha prodotto cardiomiociti prevalentemente a forma di asta e incrociati. Con gli isolamenti dalle fette miocardali è stata osservata una percentuale inferiore di cellule a forma di asta, ma il numero totale era ancora alto. Al contrario, dopo l'isolamento dai pezzi di tessuto, sono state recuperate solo poche cellule a forma di asta (Figura 2A). La citometria di flusso è stata utilizzata per confrontare quantitativamente i risultati. A causa delle loro dimensioni relativamente grandi e della striazione incrociata, i cardiomiociti mostrano in genere valori elevati sia per la dispersione in avanti che per la dispersione laterale. Queste proprietà sono state utilizzate per contare i miociti a forma di asta con un analizzatore di cellule ciclo-citometrico, applicando un semplice schema di gating che discrimina a forma di asta da cardiomiociti iperconteniti e arrotondati. (Figura supplementare 1). I grafici a punti rappresentativi sono raffigurati in Figura 2B. L'analisi statistica ha mostrato conteggi distintivamente più elevati nel cancello cm1 del cardiomiocato per l'isolamento dalle fette rispetto ai blocchi di tessuto (rispettivamente 41,5 x 11,9 contro 7,89 e 3,6%, n < 0.05, paired two-tailed t-test). As expected from visual inspection, coronary perfusion yielded the highest counts, with 71.0 ± 9.4% (n = 3 isolations; p < 0.05, unpaired two-tailed t-test) (Figura 2C). Così, l'isolamento dei cardiomiociti dalle fette di tessuto non raggiunge la resa ottenuta dalla perfusione coronarica, ma si traduce in un numero notevolmente maggiore di miociti a forma di asta rispetto all'isolamento dai pezzi di tessuto, fornendo abbastanza cellule per esperimenti successivi. Oltre al numero di cellule, sono stati quantificati i parametri strutturali dei cardiomiociti del ratto. La lunghezza delle celle, la larghezza delle celle e la lunghezza del sarcomere non erano diverse nelle celle isolate per perfusione o da fette di tessuto (lunghezza : 110,0 , 5,4 m contro 99,4 , 3,2 m, p > 0,05; larghezza 33,9 x 1,9 m vs. 30,6 x 1,2 m, p > 0,05, per n , rispettivamente 19 e n , 21 celle; lunghezza sarcomere , 1,62 , 0,04 m contro 1,68 , 0,04 m, p , 0,28, n , 24 e n , rispettivamente, 23 celle (Figura supplementare 2A–C). Utilizzo di miociti caricati Fluo-4 sottoposti a stimolazione del campo elettrico17 sono stati valutati anche i parametri funzionali (Figura supplementare 2D–F). Tempo medio di attivazione (27,5 x 1,5 contro 23,6 x 2,5 ms, n x 100 vs. n - 31 celle; perfusione vs slice, p > 0,05) (Figura supplementare 2D) e accorciamento relativo (12,2 x 1,1 contro 1,1 contro 11,3 , 2,5%, n , 42 contro n. 7 cellule, perfusione contro slice, p > 0,05) (Figura supplementare 2F) dei cardiomiociti che hanno risposto alla stimolazione non differivano in modo significativo tra i due gruppi. L'ampiezza transitoria del calcio (massima normalizzata Ca2 anni, F/F0) (Figura supplementare 2E) è stato leggermente aumentato nei cardiomiociti isolati dalle fette rispetto ai cardiomiociti isolati per perfusione (4,9 x 0,2 contro 5,7 x 0,3, n - 104 contro n < 0.05). Although the fraction of rod-shaped cardiomyocytes responding to electrical stimulation was approximately 15% higher in preparations obtained by perfusion, the majority of cells was also excitable in preparations from tissue slices (74.3 ± 4.2% vs. 62.1 ± 2.9%, perfusion vs. slice, p < 0.05, ten fields of view, 452 vs. 276 counted cells, respectively) (Figura supplementare 2G). Per valutare la qualità delle cellule dopo la coltivazione, è stata determinata la percentuale di miociti che si contrae in risposta alla stimolazione del campo elettrico dopo 48 h nella coltura cellulare17. La frazione di cellule che rispondevano è stata ridotta di circa la metà in entrambi i gruppi (41,9 x 3,6% contro 31,5 - 2,3%, perfusione contro slice, p < 0.05, 10 fields of view, n = 371 vs. n = 329 counted cells, respectively) (Figura supplementare 2H).

Successivamente, il protocollo è stato applicato al miocardio umano. Il numero di cardiomiociti ventricolari isolati a forma di asta e praticabili ottenuti da fette di tessuto è stato confrontato in modo accoppiato con il numero ottenuto da pezzi di tessuto degli stessi campioni miocardici (Figura 3). Abbiamo scoperto che l'isolamento dalle fette miocardali produceva una grande percentuale di cardiomiociti arrotondati e solo una piccola percentuale di cardiomiociti arrotondati (Figura 3A). Abbiamo contato i miociti a forma di asta da immagini a campo largo e normalizzato il loro numero dal peso bagnato del tessuto utilizzato per l'isolamento. La quantificazione ha mostrato che l'isolamento dalle fette miocardiali ha portato a un numero sorprendentemente più elevato di miociti a forma di asta rispetto all'isolamento dai blocchi di tessuto (45,0 x 15,0 contro 6,87 , 5,23 cellule/mg, n - 7 isolazioni, p < 0,05, test t a due code) (Figura 3B). Inoltre, la fattibilità è stata valutata con un'analisi di fattibilità MTT14, normalizzando l'assorbimento di formazan fotometrico alla quantità totale di proteine nel lisato cellulare. La quantificazione fotometrica ha confermato una redditività miocita notevolmente più elevata dopo l'isolamento dalle fette miocardiali (4,76 x 0,47 contro 1,09 e 0,18 AU, n - 3 isolazioni, p < 0,05, test t a due code)(Figura 3C).

In totale, il metodo è stato applicato agli esemplari miocardiali da 30 cuori umani con tempi di trasporto fino a 36 h. Da 23 delle 30 cellule vitali dei campioni sono state ottenute per esperimenti successivi (c'è anche la tabella supplementare 1). Un esempio di esperimento non riuscito (ad esempio, <100 celle per piatto) è illustrato nella Figura 3 . Qui, la maggior parte delle cellule non tollerava calcio extracellulare elevato e ipercontenito. Abbiamo valutato la contrattilità nei miociti da 14 isolazioni, e in due casi le cellule non hanno risposto alla stimolazione elettrica. Si noti che la tecnica non solo ha funzionato con grandi campioni ottenuti da cuori adulti, ma anche con piccole biopsie (appena 40 mg) da cuori di bambino (Figura supplementare 4).

Per dimostrare che le cellule umane isolate con il protocollo descritto possono essere sottoposte ad analisi strutturali, sono state macchiate di alfa-actinin, le proteine di accoppiamento CE del canale di calcio di tipo L (LTCC) e il recettore di ryanodina (RyR), nonché la membrana cellulare e i nuclei, secondo un metodo di colorazione descritto di recente nei miocitidi ratto 17 (Figura 4). La colorazione alfa-actinin ha rivelato un modello di linea z densa e regolare e una lunghezza media del sarcomere di 1,92 x 0,06 m nei cardiomiociti a riposo (n - 4, Figura 4A). LTCC e RyR hanno mostrato ammassi chiari e sono stati, come previsto, colocalizzati vicino alla membrana cellulare e ai t-tubules (Figura 4B).

Il colorante potente FluoVolt18 e il colorante sensibile al calcio Fluo-417 sono stati utilizzati per dimostrare che i cardiomiociti umani isolati con il protocollo descritto erano eccitabili e potevano essere utilizzati per studi sull'elettrofisiologia cellulare o sull'accoppiamento tra l'eccitazione e l'eccitazione(Figura 5). Sono state analizzate la forma e la durata del potenziale di azione (AP) (Figura 5A,B). I valori di 50% e 90% di durata DELL'AP (APD50: 400,6 x 41,1 ms, APD90: 748,9 x 56,6 ms, n - 10 cellule) erano nell'intervallo riportato da altri per cardiomiociti ventricolari da cuori umani in mancanza4,6,7,9.9 I transitori di calcio registrati dalla scansione confocale della linea delle cellule caricate da Fluo4 (Figura 5C,D) hanno mostrato un chiaro upstroke dopo la stimolazione e un rapporto segnale-rumore accettabile. L'ampiezza transitoria del calcio (massimo F/F0) è stata di 2,9 x 0,5 (n - 31 cellule). L'accorciamento cardiomiocato per contrazione può essere visto nell'esempio dalla deflessione del bordo inferiore della cella, che aveva una media di 4,6 x 0,8% (n - 31 cellule).

Figure 1
Figura 1: flusso di lavoro del protocollo di isolamento da fette di tessuto cardiaco umano. Blocchi di tessuto o biopsie da miocardio umano (in alto a sinistra) sono incorporati in agarose a basso punto di fusione e 300 fette spesse 300 m sono generate con la lama oscillante di un vibratome (in alto al centro). Le fette vengono trasferite in un piatto di coltura e rimosse dall'agarose circostante (in alto a destra). La digestione dei tessuti viene effettuata a 35 gradi centigradi e 65 giri su una piastra riscaldata e agitata (al centro, a sinistra) e comprende: (passaggio 4.8) Incubazione in soluzione nominalmente priva di calcio integrata con proteinasia, (fase 4.10) Digestione della matrice extracellulare con collagene, (fase 5) Dissociazione e liberazione dei cardiomiociti individuali con forza e tubazioni. (passaggio 6) Lento aumento della concentrazione extracellulare di calcio da 5 M a 1,5 mM in intervalli di 5 min. (passaggio 7) Rimozione graduale del monoxima disaccoppiatore meccanico 2,3-butanedione (BDM). Vengono recuperati cardiomiociti umani a forma di asta e incrociati. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: La cardiomiocazione produce la fetta miocardica, la perfusione e l'isolamento dei blocchi. (A) Micrografi leggeri rappresentativi di cardiomiociti di ratto isolati sia tramite perfusione coronarica (Perfusione), da tessuto taglio vibratome (fette miocardali), sia da tessuto macinato (pezzi di tessuto). (B) Rispettivo flusso rappresentativo tramezzo a punti da isolamenti cardiomiocito descritti in A. L'area di dispersione laterale (SSC-Area) e l'area di dispersione in avanti (FSC-Area) sono stati utilizzati come indicatori rispettivamente di granularità e dimensioni cellulari. Lo schema di gating del cancello CM1 per i cardiomiociti è indicato dalla linea nera e vengono visualizzate le rispettive frazioni dei conteggi totali in percentuale. (C) Media - errore standard delle frazioni di cardiomiociti (CM1) valutate dall'analisi flusso-citometrica, come descritto in B da n - 3 isolazioni cellulari per gruppo. L'isolamento dalle fette miocardali e dai pezzi di tessuto è stato eseguito dagli stessi cuori (test t a due code accoppiati). L'isolamento per perfusione è stato eseguito da cuori interi di animali diversi e confrontato con il test t a due code non accoppiato. < 0,05, dopo la correzione di confronto multiplo. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Confronto tra resa e vitalità dei cardiomiociti umani dopo l'isolamento dalle fette miocardiali e dai pezzi di tessuto macinato. (A) Immagine rappresentativa dei cardiomiociti ventricolari umani tolleranti al calcio dopo l'isolamento dalle fette di tessuto. I cardiomiociti a forma di asta e striati sono predominanti (freccia nera), con solo poche cellule arrotondate e ipercontenite (freccia bianca). (B) Quantificazione dei miociti a forma di asta, tolleranti al calcio, isolati in parallelo, sia da fette miocardiali o pezzi di tessuto contati da micrografi di campo largo e normalizzati al peso bagnato del materiale di input (in milligrammi) da n - 7 isolamenti accoppiati. (C) Quantificazione della fattibilità cardiomiocite misurando l'assorbimento del colorante formazan dopo il saggio MTT. L'assorbimento è stato normalizzato alla quantità totale di proteine, valutata dal saggio BCA da n - 3 isolazioni accoppiate. < 0,05, p < 0,01 (test t a due code accoppiato). Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Caratterizzazione microstrutturale dei cardiomiociti umani dopo l'isolamento. (A) Immagine microscopica confocale rappresentativa dopo l'immunita' dell'alfa-actinina (verde) e della macchia nucleare con 4,6-diamidin-2-phenylindol (DAPI, blu). La lunghezza del sarcomere era di 1,92 x 0,06 m (n - 4 miociti), determinata analizzando lo spettro di Fourier. (B) Immagini microscopiche confocali rappresentative di un cardiomiocite ventricolare umano fisso coimmunostained per il canale di calcio di tipo L (LTCC) e il recettore di ryanodina cardiaco (RyR). Viene mostrata anche la sovrapposizione di RyR e LTCC (sovrapposizione) e la colorazione della matrice extracellulare con agglutinina germe di grano (WGA, magenta). Nuclei erano macchiati di DAPI (blu). Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Potenziale d'azione e transitorio intracellulare del calcio nei miociti ventricolari umani. (A) Immagine confocale bidimensionale di un cardiomiocite umano isolato caricato con il colorante potente FluoVolt (verde, lunghezza d'onda di eccitazione 488 nm). La casella rossa indica un elemento del sistema tubolare t che è stato misurato con una scansione della linea veloce durante la stimolazione del campo elettrico a 0,5 Hz. (B) Media e fluorescence FluoVolt normalizzata alla linea di base (F/F0) di cinque potenziali di azione consecutivi ottenuti dall'imaging confocale come descritto in A. (C) Immagine di scansione della linea di un cardiomiocito umano isolato caricato con il colorante sensibile al calcio Fluo-4 AM (lunghezza d'onda di eccitazione 488 nm) lungo l'asse delle cellule longitudinali. L'intensità della fluorescenza è mostrata in valori grigi [AU] e i punti blu indicano l'aumento massimo dell'intensità della fluorescenza (dF/dtmax) di ogni pixel lungo la linea scansionata. La frequenza di campionamento era di 529 Hz. (D) Transitorio di calcio ottenuto con una media della fluorescenza di ogni pixel lungo la linea acquisita dall'immagine in C e normalizzazione ai valori di base prima della stimolazione (F/F0). Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti a temperatura ambiente. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Nome Composizione in mmol/L Supplementi Ph Volume richiesto in mL
Soluzione 1 20 KCl, 10 KH2PO4, 10 MgCl2, 10 glucosio, 70 acido glutamico, 20 taurin, 10 beta-idrossibutyrate, 30 BDM 2 mg/ml di albumina di siero bovino 7.3 con KOH 300
Soluzione 2 20 KCl, 10 KH2PO4, 10 MgCl2, 10 glucosio, 70 acido glutamico, 20 taurin, 10 beta-idrossibutyrate, 0,005 CaCl2, 30 BDM 10 mg/ml di albumina di siero bovino 7.3 con KOH 300
Soluzione 3 20 KCl, 10 KH2PO4, 10 MgCl2, 10 glucosio, 70 acido glutamico, 20 taurin, 10 beta-idrossibutyrate, 1.5 CaCl2 10 mg/ml di albumina di siero bovino 7.3 con KOH 300
La soluzione di Tyrode modificata 130 NaCl, 0.4 NaH2PO4, 5.8 NaHCO3, 5.4 KCl, 0.5 MgCl2, 1.5 CaCl2, 25 HEPES, 22 glucosio 2 mg/ml di albumina di siero bovino 7.3 con NaOH al 5 % CO2 100
Soluzione di taglio 138 NaCl, 0.33 NaH2PO4, 5.4 KCl, 2 MgCl2, 0.5 CaCl2, 10 HEPES, 10 glucosio, 30 BDM 7.3 con NaOH 500

Tabella 1: Buffer e soluzioni. Composizione dei buffer e delle soluzioni necessari.

Figura supplementare 1: Convalida dello schema di gating cardiomiocato (CM1). Grafici a punti dalla citometria di flusso, misurando l'area di dispersione laterale e in avanti (FSC-A, SSC-A) che indica le dimensioni e la granularità delle cellule rilevate in un campione di controllo (CTRL) dai cardiomiociti del ratto isolati dalla perfusione e dopo l'incubazione di cardiomiociti dalla stessa preparazione per 15 min a 37 minuti nella soluzione di Tyrode modificata contenente 100 m di calcio di calcio (overdose di calcio). L'elevato calcio extracellulare provoca ipercontociazione e arrotondamento di cardiomiociti a forma di asta, con conseguente riduzione delle cellule (87,6% contro 6,00%) nel cancello definito (CM1). Si prega di fare clic qui per scaricare questa figura.

Figura supplementare 2: Caratteristiche cardiomiocato isolate per perfusione o da fette. La lunghezza delle celle (A) e la larghezza delle cellule (B) sono state determinate dai cardiomiociti del ratto fissati direttamente dopo l'isolamento tramite perfusione o da fette miocardiali per microscopia (rispettivamente n - 19 e n - 21 cellule). La lunghezza del sarcomere (C) è stata determinata da immagini microscopiche dopo l'immunita' con l'analisi alfa-actinin e fourier (rispettivamente 24 e n - 23 cellule). Il tempo medio di attivazione (D), il tempo massimo F/F0 (E) e l'accorciamento relativo (F) sono stati valutati dai cardiomiociti caricati Fluo-4 isolati per perfusione o da fette miocardali e reattivi alla stimolazione elettrica (n - 100/31 miociti in D, n - 104/25 miociti in E e n - 42/7 miociti in F). La frazione di cardiomiociti a forma di asta (G) che si contrae in seguito alla stimolazione elettrica, valutata contando il numero totale di cellule a forma di asta e le cellule contraenti in dieci campi di vista a 200x di ingrandimento in un microscopio leggero standard è stata valutata per la perfusione e l'isolamento delle fette (rispettivamente 452/276 cellule). (H) Analisi come eseguita in G, ma dopo 48 h di coltivazione (n - 371/329 cellule, rispettivamente). Si prega di fare clic qui per scaricare questa figura.

Figura supplementare 3: Isolamento cardiomiocato umano con bassa resa. Immagine rappresentativa al microscopio leggero dei miociti da un isolamento con cellule prevalentemente ipercontenite (blu) o arrotondate (nero) e solo poche cellule a forma di asta e striate (bianco). Si prega di fare clic qui per scaricare questa figura.

Figura supplementare 4: Isolamento cardiomiocato da biopsie cardiache infantili. (A) Immagine di una biopsia endomiocardica (peso bagnato di circa 40 mg) ottenuta durante la chirurgia correttiva per la tetralogia di Fallot in un neonato. (B) Sezione miocardiale dal tessuto mostrato in A, incorporato in agarose. (C) Cardiomiociti isolati da una sezione miocardia, come mostrato nella B. Si prega di fare clic qui per scaricare questa figura.

Tabella supplementare 1: Dati dei pazienti umani. Viene fornito un elenco del numero di campioni di pazienti umani inclusi in questo studio. I campioni sono stati classificati in base ai tipi di chirurgia, all'età, all'eziologia della malattia e al tempo di trasporto, con il rispettivo numero totale di campioni e il numero di isolamenti miociti di successo. Clicca qui per scaricare questa tabella.

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Discussion

Anche se l'isolamento dei cardiomiociti viventi è stato stabilito più di 40 anni fa ed è ancora un prerequisito per molti approcci sperimentali nella ricerca cardiaca, rimane una tecnica difficile con esiti imprevedibili. L'isolamento dei cardiomiocite tramite perfusione delle arterie coronarie con soluzione enzimatica è comunemente usato per i cuori di piccoli animali e produce un gran numero di cellule vitali. Tuttavia, ciò richiede un sistema e una competenza relativamente complessi. Inoltre, la maggior parte dei campioni di tessuto umano non sono adatti per questo metodo, a causa delle loro piccole dimensioni o dell'assenza di rami dell'arteria coronaria, il che rende desiderabili nuovi metodi per l'isolamento dei cardiomiociti umani. Il protocollo qui descritto si basa sulla generazione araumatica di sottili fette di tessuto cardiaco, che vengono poi sottoposte a digestione ezimatica. Può essere applicato a campioni miocardici da cuori animali e miocardio umano come nuclei ambici da impianto assist-dispositivo di assistenza a sinistra-ventricolare, biopsie endomiocardiche da myectomia settica, o cuori espiantati (vedi Tabella supplementare 1), e produce in modo affidabile quantità sufficienti di cardiomiociti vitali, tolleranti al calcio che possono essere utilizzati per esperimenti successivi, come la coltivazione cardiomiocite17.

Una delle principali ragioni per rese più elevate di miociti da fette di tessuto taglio vibratome rispetto a pezzi di tessuto macinato potrebbe essere un grado inferiore di danno miocita durante il taglio. Quando la perfusione coronarica non è possibile, affettare o macinare il campione di tessuto è necessario per aumentare la superficie di contatto per digerire gli enzimi. Le dimensioni delle fette di circa 8 mm x 8 mm x 0,3 mm consentono un buon accesso agli enzimi a causa di un rapporto superficie-volume relativamente grande (7 mm-1). Utilizzando le forbici, un rapporto superficie-volume simile (6 mm-1) può essere ottenuto macinando i campioni in piccoli pezzi di circa 1 mm x 1 mm x 1 mm. Anche se i danni al miocito nelle fette e nei pezzi tritati prima che la digestione ezimatica non fosse quantificata, tagliare su un vibratomo probabilmente causa danni notevolmente inferiori perché consente un taglio delicato nella direzione della fibra. Infatti, si stima che nelle fette tagliate con vibratome meno del 5% dei miociti sia danneggiato19. I risultati mostrano che i cardiomiociti umani possono essere isolati in modo molto efficiente con il protocollo fornito, con una percentuale molto più alta di cellule vitali rispetto ai blocchi di tessuto. Questo è in conformità con un protocollo che ha utilizzato fette da tessuto atriale20. Il nostro metodo produce fino a 200 miociti ventricolari tolleranti al calcio per milligrammo di tessuto e offre la possibilità di immagazzinare o trasportare tessuto cardiaco fino a 36 h prima dell'isolamento. Questo rende il protocollo applicabile per i laboratori senza cardiochirurgia in loco e quindi estende le possibilità di collaborazioni.

I passaggi critici del protocollo sono la corretta elaborazione del miocardio a fette su un vibratome e la loro digestione, nonché le fasi finali della reintroduzione del calcio e del lavaggio del BDM. A differenza di altri metodi19,21, il tessuto cardiaco è incorporato in agarose con una bassa temperatura di fusione per evitare il movimento durante la procedura di affettatura14,15. Ciò era necessario per stabilizzare il blocco tissu tessuto e generare fette uniformi. Quando si incorpora il tessuto, l'agarose dovrebbe essere ancora liquido, ma la temperatura non deve superare i 37-38 gradi centigradi per evitare danni alle cellule da ipertermia. Al contrario, se l'agarose è troppo freddo (<35 gradi centigradi), non si lega bene al blocco di tessuto e può rompersi durante il taglio. Per testare la fattibilità del miocito dopo l'elaborazione del vibratome, viene suggerito un semplice saggio MTT che consente una rapida valutazione della vitalità cellulare mediante microscopia leggera e anche per la quantificazione mediante analisi fotometrica14,22. I danni da cardiomiocati possono verificarsi anche durante la reintroduzione del calcio extracellulare dopo un periodo di incubazione nella soluzione senzacalcio 23,24. Questo fenomeno del paradosso del calcio nelle cellule isolate può essere mitigato da un lento e graduale aumento dei livelli di calcio per consentire ai cardiomiociti di adattarsi. Questo passaggio deve essere eseguito con attenzione durante l'agitazione continua a 35 gradi centigradi e con intervalli di 5 min. Una leggera ipotermia (21 gradi centigradi) aumenta la tolleranza al calcio dei cardiomiociti del ratto durante la reintroduzione, che è conforme alle precedenti relazioni25. Tuttavia, i cardiomiociti umani non hanno mostrato grandi differenze nella tolleranza al calcio a 35 gradi centigradi o 21 gradi centigradi. L'uso di BDM durante il taglio, la digestione e la reintroduzione del calcio previene la contrazione della miocita e il dispendio energetico cellulare, nonché l'ipercontrodiazione ed è quindi protettivo. Tuttavia, per gli esperimenti successivi che valutano la contrarità cardiaca o l'accoppiamento eccitazione-contrazione, BDM deve essere rimosso26. È stato applicato un lavaggio graduale per ridurre al minimo le ipercontenizioni spontanee. BDM può essere omesso, ma questo aumenterà notevolmente la quantità di miociti iperconteniti, come osservato negli esperimenti e negli studi precedenti6.

Il protocollo descritto utilizza una soluzione che contiene potassio elevato e solo tracce di sodio per la digestione. Questa soluzione ha dato le più alte rese di cardiomiociti a forma di asta e incrociati. Per la digestione ezimatica, tuttavia, è necessaria una maggiore concentrazione di collagenasi (4 mg/mL) rispetto alla digestione nella soluzione normale di Tyrode (1,5 mg/mL). L'elevato sodio extracellulare può portare a un sovraccarico intracellulare di sodio, esacerbando gli effetti negativi del paradosso del calcio, riducendo così la resa cellulare27. Pertanto, si consiglia di utilizzare soluzioni con alto potassio e basso sodio. Un'elevata concentrazione di magnesio extracellulare è spesso impiegata nei protocolli di isolamento cardiomiocite3,28, ed è stato indicato per ridurre la lesione ischemia-reperfusione29,30 e migliorare la funzione cardiaca dopo lunghi periodi di ischemia fredda31. Pertanto, la soluzione applicata qui contiene anche un'alta concentrazione di magnesio (10 mM). Tuttavia, è stato dimostrato che l'eccitabilità, la forza di contrazione e la velocità di conduzione possono essere ridotte da alte concentrazioni di magnesio32. Anche se questi effetti sono stati indicati per essere reversibile, gli effetti sui cardiomiociti isolati non possono essere esclusi. Così, utilizzando il magnesio a concentrazioni fisiologiche (1-2 mM), potrebbe provocare una minore resa complessiva delle cellule, ma migliorare l'eccitabilità.

Il tempo di digestione ottimale è abbastanza variabile, in quanto la quantità di matrice extracellulare o fibrosi può variare notevolmente nel miocardio di fallimento umano. Se il tessuto è ancora saldamente collegato al momento della dissociazione, con solo pochi miociti vitali rilasciati, aumentando il tempo di digestione in gradini di 5 min e controllando regolarmente i miociti liberi e si raccomanda la consistenza delle fette. Se il tessuto rimane non digerito dopo periodi prolungati (>45 min), si raccomanda di aumentare la concentrazione di collagenasi nelle fasi di 1 mg/mL o di testare un lotto di enzimidiverso 16. I rispettivi valori presentati in questo lavoro possono servire da primer per un robusto isolamento dei cardiomiociti, ma le condizioni per una resa e una redditività ottimali possono essere perfezionate in ogni laboratorio, tenendo conto della grande variabilità delle attività enzimatiche e delle costituzioni dei tessuti. Un vantaggio del metodo è che a causa delle piccole quantità di tessuto richiesto e del semplice flusso di lavoro in piccoli lotti, diversi test possono essere eseguiti in parallelo. In questo modo, è possibile ottenere rapidamente un protocollo ottimale.

La generazione di fette miocardali di alta qualità richiede un vibratome di alta precisione. La necessità di un affettatrice o vibratoma di tessuto ad alta precisione è un possibile inconveniente del metodo, perché non è facilmente disponibile in ogni laboratorio. Il dispositivo utilizzato per questo studio è descritto in modo più dettagliato altrove14,15. Diversi dispositivi sono stati utilizzati con successo per generare sezioni miocardali da altri gruppi33,34,35. Di conseguenza, se le impostazioni di velocità di avanzamento, ampiezza della lama e frequenza di oscillazione possono essere soddisfatte e un orientamento orizzontale della lama con una deviazione z inferiore a 0,1 m è disponibile, il taglio e l'isolamento di successo dovrebbero essere fattibili con altri vibratomi. Inoltre, il sezionamento del tessuto è elaborato e prolunga significativamente la durata del protocollo (circa 1-2 h). L'uso di BDM come agente di disaccoppiamento meccanico ha effetti protettivi riducendo l'esposizione all'energia cellulare, la lesione ischemica e l'ipercontrazione26,36,37. Anche se l'effetto inotropico negativo di BDM è stato dimostrato di essere rapidamente reversibile dopo il lavaggio38,39, non è chiaro se BDM può avere conseguenze sconosciute sulla funzione cardiomiocite40. Questo studio mostra che le cellule possono essere isolate con rese elevate dopo tempi di stoccaggio dei tessuti fino a 36 ore e che i cardiomiociti umani possono essere colture fino a tre giorni dopo l'isolamento con questometodo 17. Non abbiamo notato differenze funzionali o strutturali tra miociti con tempi di conservazione brevi e lunghi. Tuttavia, ciò non è stato valutato sistematicamente. D'altra parte, per interi cuori di coniglio, è stato dimostrato che le differenze funzionali tra cuori freschi e cuori esposti a ischemia fredda in soluzione extracellulare contenente 30 mM BDM erano trascurabili31, e lo stesso può essere vero in questo caso.

Il protocollo presentato fornisce una solida base per tutti i tipi di esperimenti con cardiomiociti ventricolari isolati e potrebbe essere particolarmente utile per la ricerca su campioni miocardici umani. Con alcuni adattamenti, l'isolamento di altre cellule cardiache, come fibroblasti o cellule endoteliali sembra anche possibile41. Poiché richiede solo piccole quantità di tessuto che possono essere spediti in soluzione di stoccaggio a freddo da altri laboratori, l'applicazione del protocollo può ridurre il numero di animali da laboratorio sacrificati. Infatti, il protocollo è stato applicato con successo al tessuto cardiaco di coniglio e porcina. Inoltre, man mano che gli esperimenti con fette di tessuto miocardiale coltivate a lungotermine aumentano 21,33,42 e sono costantemente migliorati per fornire condizioni dicoltura ottimali 15,43,44, il metodo può essere facilmente applicato dopo la coltivazione delle fette. L'isolamento a singola cellula dal miocardio coltivato può quindi contribuire a caratterizzare i cambiamenti nei cardiomiociti dopo interventi farmacologici o fisici in vitro.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Ringraziamo Andreas Dendorfer del Walter-Brendel-Centre of Experimental Medicine di LMU Monaco di Baviera per l'aiuto con il protocollo di affettatura. Per fornire campioni di tessuto miocardico umano vorremmo ringraziare Ghazali Minabari e Christian Heim del Dipartimento di Chirurgia Cardiaca, Dell'Ospedale Universitario Erlangen, Hendrik Milting dell'Istituto Erich & Hanna Klessmann, Ruhr-University Bochum e Muhannad Alkassar del Dipartimento di Cardiologia Pediatrica, Ospedale Universitario Erlangen. Per il supporto con la citometria di flusso vorremmo ringraziare Simon V'lkl e colleghi del centro di ricerca trassedizionale (TRC), University Hospital Erlangen. Ringraziamo anche Lorenz McCargo e Celine Gràninger dell'Istituto di Fisiologia Cellulare e Molecolare Erlangen per un eccellente supporto tecnico.

Questo lavoro è stato sostenuto dal D-HK (Centro tedesco per la ricerca cardiovascolare), dal Centro interdisciplinare per la ricerca clinica (I-KF) presso l'Ospedale Universitario dell'Università di Erlangen-N'rnberg, e l'Università Erlangen-N'rnberg.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
2,3-butanedionemonoxime Carl Roth 3494.1 Purity>99%
Bovine serum albumin Carl Roth 163.2
CaCl2 Carl Roth 5239.2
Creatine monohydrate Alfa Aesar B250009
Glucose Merck 50-99-7
HEPES Carl Roth 9105.3
KCl Carl Roth P017.1
KH2PO4 Carl Roth 3904.2
L-glutamic acid Fluka Biochemica 49450
Low melting-point agarose Carl Roth 6351.5
MgCl2 x 6H2O Carl Roth A537.1
MgSO4 Sigma Aldrich M-7506
NaCl Carl Roth 9265.1
NaHCO3 Carl Roth 8551.2
Paraformaldehyde Sigma Aldrich P6148
Taurine Sigma Aldrich T8691
Dyes
Di-8-ANEPPS Thermo Fisher Scientific D3167
Fluo-4 AM Thermo Fisher Scientific F14201
FluoVolt Thermo Fisher Scientific F10488
Enzymes
Collagenase CLS type I Worthington LS004196 Used for human tissue at 4 mg/mL
(activity: 280 U/mg)
Collagenase CLS type II Worthington LS004176 Used for rat tissue at 1.5 mg/mL
(activity 330 U/mg)
Protease XIV Sigma Aldrich P8038 Used for rat tissue at 0.5 mg/mL
(activity ≥ 3.5 U/mg)
Proteinase XXIV Sigma Aldrich P5147 Used for human tissue at 0.5 mg/mL
(activity: 7-14 U/mg)
Material
Cell analyzer (LSR Fortessa) BD Bioscience 649225
Centrifuge tube, 15 mL Corning 430790
Centrifuge tube, 50 mL Corning 430829
Compact shaker Edmund Bühler KS-15 B control Agitation direction: horizontal
Disposable plastic pasteur-pipettes Carl Roth EA65.1 For cell trituration use only pipettes with an inner tip diameter ≥2 mm
Forceps FST 11271-30
Heatblock VWR BARN88880030
Nylon net filter, 180 µm Merck NY8H04700
TC Dish 100, Standard Sarstedt 83.3902
TC Dish 35, Standard Sarstedt 83.3900
TC Dish 60, Standard Sarstedt 83.3901
Vibratome (VT1200S) Leica 1491200S001 Includes VibroCheck for infrared-assisted correction of z-deflection

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References

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Isolamento dei cardiomiociti ventricolari umani dalle fette miocardici Vibratome-Cut
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Fiegle, D. J., Volk, T., Seidel, T.… More

Fiegle, D. J., Volk, T., Seidel, T. Isolation of Human Ventricular Cardiomyocytes from Vibratome-Cut Myocardial Slices. J. Vis. Exp. (159), e61167, doi:10.3791/61167 (2020).

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