Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Isolering af humane ventrikulære kardiomyocytter fra Vibratome-Cut Myocardial Slices

Published: May 10, 2020 doi: 10.3791/61167
Automatic Translation
1, 1,2, 1,2
1Institute of Cellular and Molecular Physiology, Friedrich-Alexander University Erlangen-Nürnberg, 2Muscle Research Center Erlangen (MURCE), Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

Summary

Præsenteret er en protokol for isolering af menneskelige og animalske ventrikulære kardiomyocytter fra vibratom-cut myokardie skiver. Høje udbytter af calciumtolerante celler (op til 200 celler/mg) kan opnås fra små mængder væv (<50 mg). Protokollen gælder for myokardiet, der udsættes for kold iskæmi i op til 36 timer.

Abstract

Isolering af ventrikulære hjerte myocytter fra dyr og menneskelige hjerter er en grundlæggende metode i hjerteforskning. Animal cardiomyocytes er almindeligt isoleret af koronar perfusion med fordøjelsesenzymer. Men, isolere menneskelige kardiomyocytter er udfordrende, fordi menneskelige myokardieprøver normalt ikke giver mulighed for koronar perfusion, og alternative isolation protokoller resultere i dårlige udbytter af levedygtige celler. Desuden er humane myokardieprøver sjældne og kun regelmæssigt tilgængelige på institutioner med hjertekirurgi på stedet. Dette hæmmer oversættelsen af resultater fra dyr til menneskelige kardiomyocytter. Beskrevet her er en pålidelig protokol, der muliggør effektiv isolering af ventrikulære myocytter fra menneskers og dyr myokardi. For at øge overflade-til-volumen forholdet og samtidig minimere celleskader, myokardievæv skiver 300 μm tyk genereres fra myokardieprøver med en vibratom. Væv skiver er derefter fordøjet med protease og kollagenase. Rat myokardi blev brugt til at etablere protokollen og kvantificere udbytter af levedygtige, calcium-tolerante myocytter ved flow-cytometrisk celletælling. Sammenligning med den almindeligt anvendte vævs-chunk-metode viste signifikant højere udbytter af stangformede kardiomyocytter (41,5 ± 11,9 vs. 7,89 ± 3,6 %, p < 0,05). Protokollen blev oversat til svigtende og ikke-svigtende humant myokardi, hvor udbyttet var ens som i rotte myokardiet og igen markant højere end med væv-chunk metode (45,0 ± 15,0 vs 6,87 ± 5,23 celler / mg, p < 0,05). Især, med den fremlagte protokol er det muligt at isolere et rimeligt antal levedygtige humane kardiomyocytter (9-200 celler / mg) fra minimale mængder af væv (<50 mg). Således er metoden gælder for sunde og svigtende myokardi fra både menneskelige og animalske hjerter. Desuden er det muligt at isolere overgearet og kontraktile myocytter fra humane vævsprøver, der er opbevaret i op til 36 timer i kold kardioplegisk opløsning, hvilket gør metoden særlig nyttig for laboratorier på institutioner uden hjertekirurgi på stedet.

Introduction

En skelsættende teknik, der har banet vejen for vigtige indsigter i cardiomyocyte fysiologi er isolering af levende ventrikulære kardiomyocytter fra intakte hjerter1. Isolerede kardiomyocytter kan bruges til at studere normal cellulær struktur og funktion, eller konsekvenserne af in vivo eksperimenter; for eksempel at vurdere ændringer i cellulær elektrofysiologi eller excitation-sammentrækningskobling i dyremodeller af hjertesygdom. Derudover kan isolerede kardiomyocytter bruges til cellekultur, farmakologiske indgreb, genoverførsel, vævsteknik og mange andre anvendelser. Derfor er effektive metoder til kardiomyocytisolering af grundlæggende værdi for grundlæggende og translationel hjerteforskning.

Kardiomyocytter fra små pattedyr, såsom gnavere, og fra større pattedyr, såsom svin eller hunde, er almindeligvis isoleret af koronar perfusion af hjertet med opløsninger, der indeholder rå collagenases og / eller proteaser. Dette er blevet beskrevet som "guld standard" metode til kardiomyocyt isolation, hvilket resulterer i udbytter på op til 70% af levedygtige celler2. Fremgangsmåden er også blevet brugt med menneskelige hjerter, hvilket resulterer i acceptable kardiomyocyte udbytter3,4,5. Men fordi koronar perfusion kun er muligt, hvis det intakte hjerte eller en stor myokardiekile, der indeholder en koronararteriegren, er tilgængelige, er de fleste humane hjerteprøver ikke egnede til denne fremgangsmåde på grund af deres lille størrelse og mangel på passende vaskulatur. Derfor er isolering af menneskelige kardiomyocytter udfordrende.

Humane myokardieprøver består for det meste af vævsstykker af variabel størrelse (ca. 0,5 x 0,5 x 0,5 cm til 2 x 2 x 2 cm), fremstillet gennem endomyocardiale biopsier6, septale myectomies7, VAD implantationer8eller fra udplantede hjerter9. De mest almindelige procedurer for kardiomyocyt isolation starte med hakning vævet ved hjælp af en saks eller en skalpel. Celle-til-celle kontakter afbrydes derefter ved nedsænkning i calcium-fri eller lav-calcium buffere. Dette efterfølges af flere fordøjelsestrin med rå enzymekstrakter eller rensede enzymer som proteaser (f.eks trypsin), kollagenase, hyaluronidase eller elastase, hvilket resulterer i en opløsning af den ekstracellulære matrix og befrielse af kardiomyocytter. I et sidste, kritisk skridt, en fysiologisk calcium koncentration skal omhyggeligt genoprettes, eller cellulære skader kan forekomme på grund af calcium-paradoks10,11,12. Denne isolation tilgang er praktisk, men normalt ineffektiv. For eksempel viste en undersøgelse, at næsten 1 g myokardievæv var påkrævet for at opnå et tilstrækkeligt antal kardiomyocytter, der var egnet til efterfølgende forsøg13. En mulig årsag til lave udbytter er den relativt barske metode til hakning af vævet. Dette kan især skade kardiomyocytter placeret ved luns kanter selv om disse myocytter er mest tilbøjelige til at blive frigivet af enzymatisk fordøjelse.

Et andet aspekt, der kan påvirke isolation effektivitet og kvaliteten af celler fremstillet af menneskelige prøver er varigheden af væv iskæmi. De fleste protokoller nævner korte transporttider til laboratoriet som en forudsætning for gode resultater. Dette begrænser studiet af menneskelige ventrikulære kardiomyocytter til laboratorier med nærliggende hjertekirurgi faciliteter. Tilsammen hæmmer disse restriktioner kontrollen af vigtige resultater fra dyremodeller i humane kardiomyocytter. Forbedrede isolationsprotokoller, der giver mulighed for høje kardiomyocytudbytter fra små mængder væv, helst uden alvorlige skader efter længere transporttider, er derfor ønskelige.

Beskrevet her er en isolation protokol baseret på enzymatisk fordøjelse af tynde myokardievæv skiver genereret med en vibratom14,15. Vi viser, at isolering fra vævsskiver er langt mere effektiv end fra vævsstykker hakket med en saks. Den beskrevne metode giver ikke kun mulighed for høje udbytter af levedygtige humane kardiomyocytter fra små mængder myokardievæv, men gælder også for prøver, der opbevares eller transporteres i kold kardioplegisk opløsning i op til 36 timer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle forsøg med rotter blev godkendt af Animal Care and Use Committee Mittelfranken, Bayern, Tyskland. Indsamling og anvendelse af humane hjertevævsprøver blev godkendt af institutional review boards ved Universitetet i Erlangen-Nürnberg og Ruhr-Universitetet Bochum. Undersøgelserne blev gennemført i overensstemmelse med Helsinki-erklæringen. Patienterne gav deres skriftlige informerede samtykke forud for vævsindsamlingen.

Hun wistar rotter (150-200 g) blev kommercielt opnået, bedøvet ved indsprøjtning 100 mg/kg thiopental-natrium intraperitoneally, og aflivet af cervikal dislokation efterfulgt af thoracotomy og excision af hjertet. Humane hjertevæv prøver blev indsamlet fra venstre-ventrikel apical kerne under implantation af mekaniske hjælpeanordninger, fra septal myektomi, fra tetralogi af Fallot korrigerende kirurgi, eller fra den frie venstre-ventrikel væg af udrettede hjerter. Følgende protokol beskriver isoleringen fra humant ventrikelvæv. Isoleringen af rottekardiomyocytter blev udført i overensstemmelse hermed, men med forskellige enzymer (se Tabel over materialer). En skematisk arbejdsgang for protokollen er illustreret i figur 1.

1. Fremstilling af buffere, opløsninger og enzymer

  1. Klargør buffere og løsninger som anført i tabel 1.
  2. Varm opløsningerne 1, 2, 3 og den modificerede Tyrods opløsning op til 37 °C. Skæreopløsningen opbevares ved 4 °C, indtil den er i brug.
    BEMÆRK: For 1-2 myokardieskiver kræves der i alt ca. 15 ml, 8 ml og 5 ml opløsning 1, 2 og 3 til isolering i en 35 mm vævskulturskål. Skaler op i overensstemmelse hermed for samtidige myocyte isolationer i flere retter. Skæreopløsningen kan fryses og opbevares ved -20 °C i flere måneder.
  3. 1 mg proteinase XXIV (se materialetabel)vejes i et forskudt 15 ml centrifugerør og opbevares på is indtil brug. Dette er til behandling af en prøve. Skaler beløbet op i overensstemmelse hermed. Bland ikke proteinase og kollagenase.
  4. 8 mg kollagenase CLSI (se materialetabel)vejes i et forskudt 15 ml centrifugerør og opbevares på is indtil brug. Dette er til behandling af en prøve. Skaler beløbet op i overensstemmelse hermed. Bland ikke proteinase og kollagenase.
    FORSIGTIG: Bær en ansigtsmaske eller arbejde under en røghætte for at undgå indånding af enzympulver.
    BEMÆRK: Enzymaktiviteten kan variere i forskellige partier. Derfor kan den optimale koncentration variere og bestemmes med hvert nykøbtenzym 16.

2. Opbevaring og transport af myokardievæv

  1. Opbevares og transporteres humane hjerteprøver i afkølet, 4 °C skæreopløsning (Tabel 1).
  2. Brug den samme opløsning til yderligere vævsbehandling og vibratomskæring.
    BEMÆRK: Biopsier og kirurgiske hjerteprøver skal straks overføres til skæreopløsningen ved 4 °C og kan derefter opbevares eller transporteres ved 4 °C i højst 36 timer før anvendelsen af denne protokol.

3. Forarbejdning og udskæring af vævet

BEMÆRK: Protokollen for vævsudskæring følger Fischer et al.15.

  1. Afpudsning af vævsblokken
    FORSIGTIG: Humant hjertevæv er potentielt smitsomt. Brug altid beskyttelsesslid og følg sikkerhedsreglerne på din institution. Håndter omhyggeligt brugte knive og kassér dem i sikkerhedsbeholdere.
    1. Prøven sættes i en 100 mm vævskulturskål fyldt med 20 ml koldsk skæreopløsning og opbevares på en afkølet 4 °C plade.
    2. Fjern overskydende fibrotisk væv og epiardiel fedt med en skalpel. I tilfælde af en transmural prøve fjernes trabeculae- og vævslag nær endocardium.
      BEMÆRK: Fibrotisk væv er stiv og fremstår hvidt. Fedt er typisk blødt og ser hvidt ud til gult. Trabeculae og endocardiale vævslag kan identificeres ud fra deres løse vævssammensætning og en alliancefri fiberorientering sammenlignet med myokardiet af de episkeardielag
    3. For optimal vibratom behandling, skære rektangulære væv blokke på ca 8 mm x 8 mm x 8 mm med en skalpel fra en større vævsprøve. For mindre biopsier springe dette trin og flytte til agarose indlejring.
  2. Indlejring af hjertevæv i lavt smeltepunkt agarose
    1. Kog 400 mg lavt smeltepunkt agarose i 10 ml skæreopløsning i et glasbæger.
      FORSIGTIG: Bær handsker og sikkerhedsbriller for at undgå forbrændinger. Håndter kun varmt glas med varmebeskyttelsesslid.
    2. Fyld en 10 ml sprøjte med den varme, opløste agarosegel. Sprøjten forsegles, og agarosen skal være ligevægt i et 37 °C vandbad i mindst 15 minutter.
    3. Brug hændel til at placere den trimmede hjerteprøve eller biopsi i en ren 35 mm vævskulturskål med epicardium vendt nedad og fjern overskydende væske med en steril podepind.
    4. Det ligevægtede agarose (trin 3.2.2) hældes over vævet ved at tømme sprøjten. Fastgør vævet mod bevægelse med stænde, mens du hælder agarose. Sørg for, at vævet er helt nedsænket i agarose.
    5. Læg straks skålen på is og lad agarose størkne i 10 minutter.
  3. Udskæring af myokardiet
    1. Monter et nyt barberblad på klingeholderen på vibren, og kalibrer vibrektomien ved at justere klingens z-afbøjning, hvis det er muligt.
      BEMÆRK: Denne protokol bruger en vibratom med en infrarød-assisteret kalibreringsanordning til at justere klingen i vandret position med minimal z-afbøjning (målt afbøjning <0,1 μm).
    2. Brug en skalpel til punktafgifter en agarose-væv blok, der passer til prøven indehaveren af vibratome. For at sikre stabilitet skal du sørge for, at vævet stadig er tilstrækkeligt nedsænket i agarose (agarosemargener ≥ 8 mm).
    3. Agaroseblokken fastgøres til prøveholderen med et tyndt lag cyanoacrylatlim og forsigtigt tryk.
    4. Prøveholderen med vævet sættes ind i vibratomebadet. Fyld badet med skæreopløsning og hold ved 4-6 °C under hele forarbejdningen med knust is, fyldt i den ydre køletank af vibratome.
    5. Der genereres 300 μm tykke skiver med en fremrykkende hastighed på ≤0,1 mm/s, en oscillerende frekvens på 80 Hz, en lateral amplitude på 1,5 mm og en klingevinkel på 15°. Ved håndtering af skiver, holde agarose i stedet for selve vævet for at undgå vævsskader. Skiverne opbevares i skæreopløsningen ved 4 °C i højst 2 timer, hvis det er nødvendigt.
      BEMÆRK: Kardiomyocytter er orienteret parallelt med epicardium. Derfor er det vigtigt at skære parallelt med epicardium for at undgå overdreven myocyte skader. Det anbefales at kassere de første 1-3 skiver, da der kun anvendes ensartede skiver af konstant tykkelse til isolering. For små vævsbiopsier skal du dog kun kassere den første skive.
    6. Kontroller kardiomyocytjustering under et standard lysmikroskop med en forstørrelse på 40-100x.

4. Vævsfordring

  1. Varmpladen på laboratorieryseren sættes på og opvarmes til 37 °C. Start lab shaker på 65 rpm.
  2. Proteinase (fremstillet i trin 1.3) opløses i 2 ml opløsning 1 (trin 1.1 og 1.2) og inkuberes ved 37 °C indtil brug. Bland ikke proteinase og kollagenase.
  3. Kollagenase (fremstillet i trin 1.4) opløses i 2 ml opløsning 1 (trin 1.1 og 1.2) og inkuberes ved 37 °C indtil brug. Bland ikke proteinase og kollagenase.
    FORSIGTIG: Bær beskyttelsesbriller og handsker, da opløste enzymer kan forårsage hud- og øjenskader.
  4. Calciumchlorid (CaCl2) til kollagenholdigen (fremstillet i trin 4.3) til en endelig koncentration på 5 μM.
  5. Brug hæceser til at overføre en vævsskive fra vibratomebadet til en ren 60 mm vævskulturskål fyldt med 5 ml forskudt skæreopløsning (trin 1.1 og 1.2) og opbevares på is.
  6. Fjern forsigtigt agarose fra myokardievæv med klinge eller saftræn.
    BEMÆRK: Undgå overskydende spænding og forskydningsbelastning på myokardieskiverne, da de kan beskadige kardiomyocytterne.
  7. For at udføre den første vask, placere en ren 35 mm væv kultur parabol på varmepladen og fylde den med 2 ml forvarmet (37 °C) opløsning 1. Overfør 1-2 myokardieskiver til den forberedte skål med scef. Aspirere opløsningen med en 1 ml pipette, og udfør vasketrinnene 2x for at fjerne rester af skæreopløsning.
    BEMÆRK: Hjerteskiverne må ikke aspirere. Opløsningerne og skiverne skal forblive ved en konstant temperatur på 35 °C på den omrørte varmeplade. Juster varmepladens temperatur, hvis det er nødvendigt.
  8. Opløsning 1 fjernes fra skålen, og der tilsættes 2 ml proteinaseopløsning (trin 4.2). Inkuber i 12 min på varmepladen ved 65 omdrejninger i minuttet.
  9. 2x vaskes med 2 ml forvarmet opløsning 1 (37 °C).
  10. Opløsning 1 fjernes fra skålen, og der tilsættes 2 ml kollagenopløsning (trin 4.3 og 4.4). Inkuber mindst 30 min på varmepladen ved 65 omdrejninger i minuttet.
  11. Kontroller gratis individuelle myocytter på 30, 35, 40 min, osv., ved at placere fadet under et let mikroskop. Arbejd hurtigt for at undgå betydelig afkøling af opløsningen.
    BEMÆRK: Den nødvendige fordøjelsestid kan variere afhængigt af vævs constitution og graden af fibrose. Så snart vævet bliver synligt blødt og dissociates let, når forsigtigt trukket, den optimale fordøjelse tid er nået. Hvis nok væv er til rådighed, flere skiver kan fordøjes parallelt med varierende fordøjelse gange.
  12. Når vævet fordøjes, og de enkelte myocytter er synlige (trin 4.11), vaskes 2x med 2 ml forvarmet opløsning 2 (37 °C) og fyldes igen med 2 ml.

5. Vævssenering

  1. Dissociate den fordøjede væv skiver med skrænt ved omhyggeligt at trække fibrene fra hinanden.
  2. Pipetter forsigtigt flere gange med en pasteurpipette til engangsbrug (åbningsdiameter >2 mm).
    BEMÆRK: Brug af kraftbepind og pipettering kan fremkalde mekanisk stress og forårsage kardiomyocytskader. Men det er et afgørende skridt for adskillelse af cellerne. Brug fine kraftræbere til at minimere celleskader og disskrive skiverne forsigtigt til mindre stykker.
  3. Kontroller for de befriede stangformede kardiomyocytter under det lette mikroskop.

6. Genindførelse af fysiologisk calciumkoncentration

  1. Opsøg langsomt calciumkoncentrationen fra 5 μM til 1,5 mM, mens den omrører ved 35 °C på varmepladen. Brug 10 mM og 100 mM CaCl2 lagerløsninger. Anbefalede trin: 20, 40, 80, 100, 150, 200, 400, 800, 1.200, 1.500 μM. Lad cellerne tilpasse sig de forhøjede calciumniveauer i 5 min inkubationsintervaller mellem hvert trin.
  2. Fjern ufordøjet vævsstykker omhyggeligt med scener, eller filtrer cellesuspensionen gennem et nylonnet med 180 μm porestørrelse for enden af calciumforøgelsen.

7. Fjernelse af mekanisk frakoblingsmiddel

  1. Stop omrøring og fjern langsomt en tredjedel af opløsningen (~700 μL) fra toppen med en 1.000 μL pipette. Undgå aspiration af kardiomyocytter.
    BEMÆRK: Hvis ufordøjet væv blev fjernet, vil kardiomyocytterne ophobes i midten af skålen, hvilket letter aspirationen af cellefri opløsning. Hvis ikke, overføres celleopløsningen til et 15 ml centrifugerør, og cellerne i det mindste sedimenteres i 10 minutter ved 35 °C, derefter aspireres 700 μL af supernatanten og kasseres, cellerne skal resuspendres, overføre dem tilbage til en 35 mm vævskulturskål og fortsætte med trin 7.2.
  2. Der tilsættes 700 μL opløsning 3 til cellerne, genoptag omrøring på varmepladen og inkuber i 10 min.
  3. Gentag trin 7.1 og 7.2.
  4. Opløsningen overføres til et 15 ml centrifugerør, og kardiomyocytterne i mindst 10 min. og højst 30 min ved stuetemperatur eller drejes ved 50 x g i 1 min. Fjern supernatanten helt, og resuspend i modificeret Tyrods opløsning eller den ønskede eksperimentbuffer.
    BEMÆRK: Kardiomyocytter kan opbevares i modificeret Tyrods opløsning (tabel 1) i flere timer ved 37 °C og 5% CO2 før brug.
  5. Kontroller cellekvaliteten med et standardlymikroskop ved 40x og 200x forstørrelse.
    BEMÆRK: Omkring 30-50% af kardiomyocytterne skal være stangformede, glatte uden membransnære, og vise klare tværgående riller. Kun 5-10% af de levedygtige celler bør vise spontane sammentrækninger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For at kontrollere isolationseffektiviteten blev protokollen anvendt med rotteneokardi, og det deraf følgende antal levedygtige myocytter blev sammenlignet med de tal, der opnås ved isolering via koronarperfusion og ved isolering fra små vævsstykker (chunk isolation, Figur 2). Chunk isolation og isolation fra væv skiver blev udført fra samme hjerter. For isolation via koronar perfusion, dog, hele hjertet blev brugt. Koronar perfusion gav overvejende stangformede og tværtribede kardiomyocytter. Med isolationer fra myokardieskiver blev der observeret en lavere andel af stangformede celler, men det samlede antal var stadig højt. I modsætning hertil blev kun få stangformede celler, efter isolation fra vævsstykker, genfundet (Figur 2A). Flowcytometri blev brugt til at sammenligne resultaterne kvantitativt. På grund af deres relativt store størrelse og cross-rillation, kardiomyocytter typisk viser store værdier for både frem og side scatter. Disse egenskaber blev brugt til at tælle stangformede myocytter med en flow-cytometrisk celleanalysator, der anvender en simpel gating ordning, der diskriminerede stangformet fra hypercontracted og afrundede kardiomyocytter. (Supplerende figur 1). Repræsentative prikkeplots er afbildet i Figur 2B. Statistisk analyse viste markant højere tal i kardiomyocytporten CM1 for isolering fra skiver end fra vævsstykker (41,5 ± 11,9 vs. 7,89 ± 3,6%; n =3 isolationer; p < 0.05, paired two-tailed t-test). As expected from visual inspection, coronary perfusion yielded the highest counts, with 71.0 ± 9.4% (n = 3 isolations; p < 0.05, unpaired two-tailed t-test) (Figur 2C). Således er isolering af kardiomyocytter fra væv skiver ikke når udbyttet opnået ved koronar perfusion, men resulterer i et betydeligt større antal stangformede myocytter end isolation fra væv stykker, giver nok celler til efterfølgende eksperimenter. Ud over celletal blev strukturelle parametre for rottekardiomyocytter kvantificeret. Cellelængde, cellebredde og sarkomerlængde var ikke forskellige i celler, der var isoleret ved perfusion eller fra vævsskiver (længde = 110,0 ± 5,4 μm vs. 99,4 ± 3,2 μm, p > 0,05; bredde = 33,9 ± 1,9 μm vs. 30,6 ± 1,2 μm, p > 0,05, for henholdsvis n = 19 og n = 21 celler; sarkomerlængde = 1,62 ± 0,04 μm vs. 1,68 ± 0,04 μm, p = 0,28, n = 24 og n = 23 celler) (Supplerende figur 2A-C). Brug af Fluo-4-lastet myocytter, der udsættes for elektrisk feltstimulering17 funktionelle parametre blev også vurderet (Supplerende figur 2D–F). Gennemsnitlig aktiveringstid (27,5 ± 1,5 vs. 23,6 ± 2,5 ms, n = 100 vs. n = 31 celler; perfusion vs. skive, p > 0,05) (Supplerende figur 2D) og relativ afkortning (12,2 ± 1,1 vs. 11,3 ± 2,5%, n = 42 vs. n= 7 celler, perfusion vs. skive, p > 0,05) (Supplerende figur 2F) af kardiomyocytter, der reagerede på stimulering, var ikke signifikant forskellige mellem de to grupper. Calciumtransientenlylitud (maksimal normaliseret Ca2., F/F0) (Supplerende figur 2E) blev let forøget i kardiomyocytter isoleret fra skiver sammenlignet med kardiomyocytter isoleret ved perfusion (4,9 ± 0,2 vs. 5,7 ± 0,3, n = 104 vs. n = 25 celler, perfusion vs. skive, p. < 0.05). Although the fraction of rod-shaped cardiomyocytes responding to electrical stimulation was approximately 15% higher in preparations obtained by perfusion, the majority of cells was also excitable in preparations from tissue slices (74.3 ± 4.2% vs. 62.1 ± 2.9%, perfusion vs. slice, p < 0.05, ten fields of view, 452 vs. 276 counted cells, respectively) (Supplerende figur 2G). For at vurdere cellekvaliteten efter dyrkning blev procentdelen af myocytter, der blev indgået som reaktion på elektrisk feltstimulering efter 48 timer i cellekultur, bestemt17. Andelen af responderende celler blev reduceret med ca. halvdelen i begge grupper (41,9 ± 3,6 % vs. 31,5 ± 2,3 %, perfusion vs. skive, p < 0.05, 10 fields of view, n = 371 vs. n = 329 counted cells, respectively) (Supplerende figur 2H).

Dernæst blev protokollen anvendt på humant myokardi. Antallet af stangformede og levedygtige isolerede humane ventrikulære kardiomyocytter fremstillet af vævsskiver blev sammenlignet parvis med det antal, der fremkomes fra vævsstykker af de samme myokardieprøver (Figur 3). Vi fandt, at isolationen fra myokardieskiver gav en stor andel af stangformede og kun en lille andel af afrundede kardiomyocytter (figur 3A). Vi talte stangformede myocytter fra wide-field billeder og normaliseret deres antal ved væv våd vægt, der anvendes til isolering. Kvantificeringen viste, at isolering fra myokardieskiver resulterede i et påfaldende højere antal stangformede myocytter end isolering fra vævsstykker (45,0 ± 15,0 vs. 6,87 ± 5,23 celler/mg, n = 7 isolationer, p < 0,05, parret to-tailed t-test) (Figur 3B). Desuden blev rentabiliteten vurderet med en MTT levedygtighedsanalyse14, hvilket normaliserede den fotometriske formazan absorption til den samlede mængde protein i cellen lysatet. Den fotometriske kvantificering bekræftede en væsentligt højere myocyt levedygtighed efter isolering fra myokardie skiver (4,76 ± 0,47 vs 1,09 ± 0,18 AU, n = 3 isolationer, p < 0,05, parret to-tailed t-test) (Figur 3C).

I alt blev metoden anvendt på myokardieprøver fra 30 menneskelige hjerter med transporttider på op til 36 timer. Fra 23 af de 30 prøvers levedygtige celler blev opnået til efterfølgende forsøg (se også supplerende tabel 1). Et eksempel på et mislykket eksperiment (dvs. <100 celler pr. skål) vises i supplerende figur 3. Her tolererede de fleste celler ikke højt ekstracellulært calcium og hypercontracted. Vi vurderede kontraktilitet i myocytter fra 14 isolationer, og i to tilfælde reagerede cellerne ikke på elektrisk stimulation. Bemærk, at teknikken ikke kun fungerede med store prøver fra voksne hjerter, men også med små biopsier (så lidt som 40 mg) fra børns hjerter (supplerende figur 4).

For at påvise, at humane celler, der er isoleret med den beskrevne protokol, kan underkastes strukturel analyse, blev de bejdset med alfa-actinin, EF-koblingsproteinerne L-type calciumkanal (LTCC) og ryanodinreceptor (RyR) samt cellemembranen og kernerne, efter en farvningsmetode, der for nylig er beskrevet i rotte myocytes17 (Figur 4). Alpha-actinin farvning afslørede et tæt, regelmæssigt z-line mønster og en gennemsnitlig sarcomere længde på 1,92 ± 0,06 μm i hvilende kardiomyocytter (n = 4, figur 4A). LTCC og RyR viste klare klynger og blev som forventet colocalized nær cellemembranen og t-tubuli (Figur 4B).

Det potentiometriske farvestof FluoVolt18 og det calciumfølsomme farvestof Fluo-417 blev anvendt til at påvise, at humane kardiomyocytter, der var isoleret med den beskrevne protokol, varovergearbareog kunne anvendes til undersøgelser af cellulær elektrofysiologi eller excitation-sammentrækningskobling ( Figur 5 ). Ap-form og varighed (Action Potential) blev analyseret (Figur 5A,B). Værdierne på 50 % og 90 % APD50: 400,6 ± 41,1 ms, APD90: 748,9 ± 56,6 ms, n = 10 celler) var i det område, som andre rapporterede for ventrikulære kardiomyocytter fra svigtende menneskelige hjerter4,6,7,9. De calciumtransienter, der blev registreret ved konfokal linjescanning af Fluo4-belastede celler (Figur 5C,D) viste et tydeligt opsvømning efter stimulering og et acceptabelt signal-støj-forhold. Calciumtransientenlylituden (højst F/F0) var 2,9 ± 0,5 (n = 31 celler). Kardiomyocyt afkortning ved sammentrækning kan ses i eksemplet fra afbøjningen af den nederste cellegrænse, som havde et gennemsnit på 4,6 ± 0,8% (n = 31 celler).

Figure 1
Figur 1: Arbejdsgang af isolationsprotokollen fra skær til humant hjertevæv. Vævsblokke eller biopsier fra humant myokardie (øverst til venstre) er indlejret i lavt smeltepunkt agarose og 300 μm tykke skiver genereres med oscillerende klinge af en vibratome (øverst i midten). Skiverne overføres til en kulturskål og fjernes fra det omgivende agarose (øverst til højre). Vævsfordømmelse udføres ved ~ 35 °C og 65 omdr./min. på en opvarmet og ophidset plade (i midten, venstre) og omfatter: (trin 4.8) Inkubation i nominelt calciumfri opløsning suppleret med proteinase (trin 4.10) Fordøjelse af den ekstracellulære matrix med kollagenase (trin 5) Dissociation og befrielse af individuelle kardiomyytter med kraft og rør. (trin 6) Langsom stigning i den ekstracellulære calciumkoncentration fra 5 μM til 1,5 mM i intervaller på 5 min. (trin 7) Trinvis fjernelse af den mekaniske uncoupler 2,3-butanedione monoxime (BDM). Rod-formede og cross-tværstribede menneskelige kardiomyocytter hentes. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Kardiomyocyt udbytter af myokardie skive, perfusion, og luns isolation. aA) Repræsentative lysmikrografer af rottekardiomyocyter, der er isoleret enten via koronarperfusion (Perfusion), fra vibratomskåret væv (myokardieskiver) eller fra hakket væv (vævsstykker). (B) Respektive repræsentative flowcytometridceller fra kardiomyocytisolationer, der er beskrevet i A. Side scatter område (SSC-Area) og fremad scatter område (FSC-Area) blev brugt som indikatorer for cellulære granularitet og størrelse, henholdsvis. Den gating ordningen af porten CM1 for kardiomyocytter er angivet med den sorte linje og de respektive fraktioner af samlede antal i procent vises. (C) Gennemsnitlig ± standardfejl af de kardiomyocytter (CM1), der vurderes ved flowcytometrisk analyse som beskrevet i B fra n = 3 celleisolationer pr. gruppe. Isoleringen fra myokardieskiver og vævsstykker blev udført fra de samme hjerter (parret tosidet t-test). Isolation ved perfusion blev udført fra hele hjerter af forskellige dyr og sammenlignet med den uparerede tosidede t-test. *p < 0,05 efter flere sammenligningskorrektioner. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Sammenligning af udbytte og levedygtighed af humane kardiomyocytter efter isolering fra myokardieskiver og hakkede vævsstykker. aA) Repræsentativt billede af calciumtolerante humane ventrikulære kardiomyocytter efter isolering fra vævsskiver. Rod-formede og striated cardiomyocytes er fremherskende (sort pil), med kun få afrundede og hypercontracted celler (hvid pil). (B)Kvantificering af calciumtolerante, stangformede myocytter, der er isoleret parallelt, enten fra myokardieskiver eller vævsstykker, der er talt fra store mikrografer og normaliseret til inputmaterialets våde vægt (i milligram) fra n = 7 parrede isolationer. c) Kvantificering af kardiomyocyts levedygtighed ved fotometrisk måling af formazan farveabsorbereabsorbering efter MTT-analyse. Absorbans blev normaliseret til den samlede protein mængde, vurderet ved BCA assay fra n = 3 parret isolationer. *p < 0,05, **p < 0,01 (parret tosidet t-test). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Mikrostrukturel karakterisering af humane kardiomyocytter efter isolation. (A)Repræsentativ konfokal mikroskopisk billede efter immunstaining af alfa-actinin (grøn) og nuklear plet med 4',6-diamidin-2-phenylindol (DAPI, blå). Sarkomerlængden var 1,92 ± 0,06 μm (n = 4 myocytter), bestemt ved analyse af Fourier-spektret. (B)Repræsentative konfokale mikroskopiske billeder af en fast human ventrikulær kardiomyocyt coimmunostained for L-type calciumkanal (LTCC) og hjerte-ryanodinreceptor (RyR). Overlejringen af RyR og LTCC (overlay) og farvning af den ekstracellulære matrix med hvedekim agglutinin (WGA, magenta) er også vist. Kerner blev plettet med DAPI (blå). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Virkningspotentiale og intracellulær calciumtransient i humane ventrikulære myocytter. (A) To-dimensionelle konfokale billede af en isoleret human kardiomyocyte fyldt med potentiometriske farvestof FluoVolt (grøn, 488 nm excitation bølgelængde). Den røde boks angiver et element i det t-rørformede system, der blev målt med en hurtig linjescanning under elektrisk feltstimulering ved 0,5 Hz. (B) Gennemsnitlig og baseline-normaliseret FluoVolt fluorescens (F/F0) med fem på hinanden følgende handlingspotentialer opnået ved konfokal billeddannelse som beskrevet i A. (C)Linjescanningsbillede af en isoleret human kardiomyocyt, der er fyldt med det calciumfølsomme farvestof Fluo-4 AM (488 nm excitation wavelength) langs cellens længdecelleakse. Fluorescensintensiteten vises med grå værdier [AU], og de blå prikker angiver den maksimale stigning i fluorescensintensiteten (dF/dtmax)for hver pixel langs den scannede linje. Samplinghastigheden var 529 Hz.(D) Calciumtransient opnået ved gennemsnit at fluorescere for hver pixel langs den scannede linje fra billedet i C og normalisering til baselineværdier før stimulering (F/F0). Alle eksperimenter blev udført ved stuetemperatur.. Klik her for at se en større version af dette tal.

Navn Sammensætning i mmol/L Kosttilskud Ph Påkrævet lydstyrke i ml
Løsning 1 20 KCl, 10 KH2PO4, 10 MgCl2, 10 glukose, 70 glutaminsyre, 20 taurin, 10 beta-hydroxybutyrat, 30 BDM 2 mg/ml kvæg serum albumin 7.3 med KOH 300
Løsning 2 20 KCl, 10 KH2PO4, 10 MgCl2, 10 glukose, 70 glutaminsyre, 20 taurin, 10 beta-hydroxybutyrat, 0,005 CaCl2, 30 BDM 10 mg/ml kvæg serumalbumin 7.3 med KOH 300
Løsning 3 20 KCl, 10 KH2PO4, 10 MgCl2, 10 glukose, 70 glutaminsyre, 20 taurin, 10 beta-hydroxybutyrat, 1,5 CaCl2 10 mg/ml kvæg serumalbumin 7.3 med KOH 300
Ændret Tyrods løsning 130 NaCl, 0,4 NaH2PO4, 5,8 NaHCO3, 5,4 KCl, 0,5 MgCl2, 1,5 CaCl2, 25 HEPES, 22 glucose 2 mg/ml kvæg serum albumin 7.3 med NaOH ved 5 % CO2 100
Skæreløsning 138 NaCl, 0,33 NaH2PO4, 5,4 KCl, 2 MgCl2, 0,5 CaCl2, 10 HEPES, 10 glukose, 30 BDM 7.3 med NaOH 500

Tabel 1: Buffere og løsninger. Sammensætningen af de nødvendige buffere og løsninger.

Supplerende figur 1: Validering af kardiomyocytordningen (CM1). Dot-observationsområder fra flowcytometri, måling af frem- og sidespredningsområde (FSC-A, SSC-A), der angiver de påviste cellers størrelse og granularitet i en kontrolprøve (CTRL) fra perfusionsiserede rottekardiomyocytter og efter inkubation af kardiomyocytter fra samme præparat i 15 min ved 37 °C i modificeret Tyrods opløsning indeholdende 100 mM calcium (calcium). Det høje ekstracellulære calcium forårsager hyperkontingent og afrunding af stangformede kardiomyocytter, hvilket resulterer i en reduktion af celler (87,6% vs. 6,00%) i den definerede port (CM1). Klik her for at downloade dette tal.

Supplerende figur 2: Kardiomyocytegenskaber isoleret ved perfusion eller fra skiver. Cellelængde (A) og cellebredde (B) blev bestemt ud fra rottekardiomyocytter, der blev fastsat direkte efter isolering via perfusion eller fra myokardieskiver ved mikroskopi (n = 19 og n = 21 celler). Sarkomeretlængden (C) blev bestemt ud fra mikroskopiske billeder efter immunstaining med alfa-actinin og Fourier-analyse (henholdsvis n = 24 og n = 23 celler). Den gennemsnitlige aktiveringstid (D), den maksimale F/F0 (E) og den relative afkortning (F) blev vurderet fra Fluo-4-belastede kardiomyocytter isoleret ved perfusion eller myokardieskiver og reagerer på elektrisk stimulation (n = 100/31 myocytter i D n = 104/25 myocytter i E og n = 42/7 myocytter i F). Den fraktion af stangformede kardiomyocytter (G), der blev indgået kontrakt ved elektrisk stimulation, vurderet ved at tælle det samlede antal stangformede celler og kontraktile celler i ti synsfelter ved 200x forstørrelse i et standard lysmikroskop, blev vurderet for henholdsvis perfusion og skiveisolering (n = 452/276 celler). HH) Analyse som udført i G, men efter 48 timers dyrkning (n = henholdsvis 371/329 celler). Klik her for at downloade dette tal.

Supplerende figur 3: Human kardiomyocyt isolation med lavt udbytte. Repræsentativt lysmikroskopbillede af myocytter fra en isolation med overvejende hypercontracted (blå) eller afrundede celler (sort) og kun få stangformede og strierede celler (hvid). Klik her for at downloade dette tal.

Supplerende figur 4: Kardiomyocyt isolation fra spædbarn hjerte biopsier. aA) Billede af en endomyocardial biopsi (vådvægt ca. 40 mg) opnået under korrigerende operation for tetralogi af Fallot hos et spædbarn. (B) Myokardieskive fra det væv, der er vist i A, indlejret i agarose. (C) Cardiomyocytes isoleret fra en myokardie skive som vist i B. Klik her for at downloade dette tal.

Supplerende tabel 1: Data om menneskelige patienter. Der gives en liste over antallet af prøver fra humane patienter, der indgår i denne undersøgelse. Prøver blev kategoriseret efter kirurgi typer, alder, sygdom ætiologi, og transport tid, med det respektive samlede antal prøver og antallet af vellykkede myocyte isolationer. Klik her for at downloade denne tabel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Selv om isoleringen af levende kardiomyocytter blev etableret for mere end 40 år siden og stadig er en forudsætning for mange eksperimentelle tilgange i hjerteforskning, er det stadig en vanskelig teknik med uforudsigelige resultater. Kardiomyocyt isolation via perfusion af kranspulsårerne med enzymopløsning er almindeligt anvendt til hjerter af små dyr og giver et stort antal levedygtige celler. Dette kræver imidlertid et relativt komplekst system og ekspertise. Desuden er de fleste humane vævsprøver ikke egnet til denne metode, på grund af deres lille størrelse eller fraværet af koronararteriegrene, hvilket gør nye metoder til isolering af humane kardiomyocytter ønskelige. Den protokol, der er beskrevet her, er baseret på den atraumatiske generation af tynde hjertevævsskiver, som derefter udsættes for enzymatisk fordøjelse. Det kan anvendes på myokardieprøver fra dyrehjerter og humant myokardie såsom apikale kerner fra venstre-ventrikulær hjælpe-enhed implantation, endomyocardial biopsier fra septal myektomi, eller explanted hjerter (se supplerende tabel 1), og pålideligt producerer tilstrækkelige mængder af levedygtige, calcium-tolerante kardiomyocytter, der kan bruges til efterfølgende eksperimenter, ligesom cardiomyocytedyrkning 17.

En væsentlig årsag til højere udbytter af myocytter fra vibratom-cut væv skiver end fra hakket væv stykker kan være en lavere grad af myocyt skader under udskæring. Når koronar perfusion ikke er mulig, udskæring eller hakning af vævsprøven er nødvendig for at øge kontaktfladen for fordøje enzymer. Skivemål på ca. 8 mm x 8 mm x 0,3 mm giver god adgang til enzymer på grund af et relativt stort overflade-til-volumen-forhold (~7 mm-1). Ved hjælp af en saks kan der opnås et lignende overflade-til-volumen-forhold (~6 mm-1) ved at hakke prøverne i små stykker på ca. 1 mm x 1 mm x 1 mm. Selv om myocyt skader i skiver og hakkede stykker før enzymatisk fordøjelse ikke blev kvantificeret, udskæring på en vibratome sandsynligvis forårsager betydeligt mindre skade, fordi det muliggør blid skæring i fiber retning. Faktisk blev det anslået, at i vibratome-cut skiver færre end 5% af myocytter er beskadiget19. Resultaterne viser, at humane kardiomyocytter kan isoleres meget effektivt med den forfølgende protokol, med en langt højere andel af levedygtige celler sammenlignet med vævsstykker. Dette er i overensstemmelse med en protokol, der brugte skiver fra atrievæv20. Vores metode giver op til 200 calcium-tolerante ventrikulære myocytter pr milligram væv og giver mulighed for at gemme eller transportere hjertevæv i op til 36 timer før isolation. Dette gør protokollen anvendelig for laboratorier uden hjertekirurgi på stedet og udvider dermed mulighederne for samarbejde.

Kritiske trin i protokollen er den korrekte behandling af myokardiet til skiver på en vibratome og deres fordøjelse samt de sidste trin i calcium-genindførelse og udvaskning af BDM. I modsætning til andremetoder 19,21, er hjertevævet indlejret i agarose med en lav smeltetemperatur for at undgå bevægelse under udskæringsproceduren14,15. Dette var nødvendigt for at stabilisere vævsblokken og generere ensartede skiver. Ved indlejring af vævet skal agarose stadig være flydende, men temperaturen bør ikke overstige 37-38 °C for at undgå celleskader ved hypertermi. Omvendt, hvis agarose er for koldt (<35 °C), det ikke binder godt til væv blok og kan bryde under udskæringen. For at teste for myocyt levedygtighed efter vibratome behandling, en simpel MTT analyse, der giver mulighed for hurtig evaluering af cellernes levedygtighed ved lys mikroskopi og også for kvantificering ved fotometrisk analyse foreslås14,22. Kardiomyocytskader kan også opstå under genindførelse af ekstracellulært calcium efter en inkubationsperiode i calciumfri opløsning23,24. Dette calcium paradoks fænomen i isolerede celler kan afbødes ved en langsom, trinvis stigning i calcium niveauer at tillade kardiomyocytter at tilpasse sig. Dette trin skal udføres omhyggeligt under kontinuerlig omrøring ved 35 °C og med intervaller på 5 min. Let hypotermi (21 °C) øger calciumtolerancen for rottekardiomyocytter under genindførelse, hvilket er i overensstemmelse med tidligere rapporter25. Humane kardiomyocytter viste imidlertid ikke større forskelle i calciumtolerance ved 35 °C eller 21 °C. Brugen af BDM under opskæring, fordøjelse, og genindførelse af calcium forhindrer myocyte sammentrækning og cellulære energiforbrug samt hypercontraction og er derfor beskyttende. Men for efterfølgende forsøg med at vurdere hjertekontraktilitet eller excitation-sammentrækning kobling, BDM skal fjernes26. En gradvis udvaskning blev anvendt for at minimere spontane hyperkontingenter. BDM kan udelades, men dette vil markant øge mængden af hypercontracted myocytter, som observeret i tidligere forsøg og undersøgelser6.

Den beskrevne protokol bruger en opløsning, der indeholder højt kalium og kun spor af natrium til fordøjelsen. Denne løsning gav det højeste udbytte af stangformede, tværtribede kardiomyocytter. For enzymatisk fordøjelse krævede det imidlertid en højere koncentration af kollagenase (4 mg/ml) sammenlignet med fordøjelsen i normal Tyrods opløsning (1,5 mg/ml). Høj ekstracellulær natrium kan føre til intracellulær natrium overbelastning, forværrer de negative virkninger af calcium paradoks, hvilket reducerer celle udbytter27. Derfor foreslås det at anvende opløsninger med højt kalium og lavt natrium. En høj ekstracellulær magnesiumkoncentration anvendes ofte i kardiomyocytisolationsprotokol3,28og har vist sig at reducere iskæmi-reperfusionsskade29,30 og forbedre hjertefunktionen efter længere perioder med kold iskæmi31. Derfor indeholder den opløsning, der anvendes her, også en høj koncentration af magnesium (10 mM). Det blev dog vist, at ophidselse, sammentrækningskraft og ledningshastighed kan reduceres ved høje magnesiumkoncentrationer32. Selv om disse virkninger viste sig at være reversibel, kan virkninger på isolerede kardiomyocytter ikke udelukkes. Således, ved hjælp af magnesium ved fysiologiske koncentrationer (1-2 mM), kan resultere i en lavere samlet celle udbytte, men forbedre ophidselse.

Den optimale fordøjelsestid er ret varierende, da mængden af ekstracellulær matrix eller fibrose kan variere betydeligt i menneskelig mangel myokardi. Skulle vævet stadig være solidt forbundet på tidspunktet for dissociation, med kun få levedygtige myocytter frigivet, øge fordøjelsestiden i trin på 5 min og regelmæssigt kontrol for gratis myocytter og teksturen af skiver anbefales. Hvis vævet forbliver ufordøjet efter længere perioder (>45 min.), anbefales det at øge koncentrationen af kollagenase i trin på 1 mg/ml eller teste et andet enzymbat16. De respektive værdier, der præsenteres i dette arbejde, kan tjene som primer for en robust isolering af kardiomyocytter, men betingelserne for optimalt udbytte og levedygtighed kan raffineres i hvert laboratorium under hensyntagen til den store variation af enzymaktiviteter og vævsfastfatninger. En fordel ved metoden er, at på grund af de små mængder af nødvendige væv og den enkle arbejdsgang i små partier, kan flere tests udføres parallelt. Således kan en optimal protokol opnås hurtigt.

Generation af myokardieskiver af høj kvalitet kræver en højpræcisions vibratom. Behovet for en høj præcision væv pålægsværktøj eller vibratom er en mulig ulempe ved metoden, fordi det ikke er let tilgængelige på hvert laboratorium. Den anordning, der anvendes til denne undersøgelse, er beskrevet mere detaljeretandetsteds 14,15. Forskellige enheder er blevet brugt til at generere myokardieudsnit af andregrupper 33,34,35. Hvis indstillingerne for fremrykkende hastighed, klingeamplitude og svingningsfrekvens kan opfyldes, og der er mulighed for en vandret klingeretning med en z-afbøjning under 0,1 μm, bør vellykket udskæring og isolering være mulig med andre vibratomer. Desuden er vævsudskæringen omfattende og forlænger protokollens varighed betydeligt (ca. 1-2 timer). Brugen af BDM som et mekanisk afkoblingsmiddel har beskyttende virkninger ved at reducere cellulær energieksponering, iskæmisk skade og hyperkontingent26,36,37. Selv om BDM's negative inotropiske virkning viste sig hurtigt at være reversibelefterudvaskning 38,39, er det ikke klart , om BDM kan have ukendte konsekvenser for kardiomyocytfunktion40. Denne undersøgelse viser, at celler kan isoleres med høje udbytter efter vævslagringstider på op til 36 timer, og at humane kardiomyocytter kan dyrkes i op til tre dage efter isolation med denne metode17. Vi lagde ikke mærke til funktionelle eller strukturelle forskelle mellem myocytter med korte og lange opbevaringstider. Dette blev imidlertid ikke vurderet systematisk. På den anden side, for hele kanin hjerter, blev det vist, at funktionelle forskelle mellem friske hjerter og hjerter udsat for kold iskæmi i ekstracellulær opløsning, der indeholder 30 mM BDM varubetydelig 31, og det samme kan være tilfældet i dette tilfælde.

Den præsenterede protokol giver et solidt grundlag for alle former for eksperimenter med isolerede ventrikulære kardiomyocytter og kan være særligt værdifulde for forskning i humane myokardieprøver. Med nogle tilpasninger, isolering af andre hjerteceller, såsom fibroblaster eller endotelceller synes også muligt41. Da det kun kræver små mængder væv, der kan sendes i kølebeholderopløsning fra andre laboratorier, kan anvendelsen af protokollen reducere antallet af ofre laboratoriedyr. Faktisk er protokollen blevet anvendt med succes på kanin og svin hjertevæv. Desuden, som forsøg med langtidsdyrkede myokardievæv skiverstige 21,33,42 oger konstant forbedret for at give optimale kulturbetingelser 15,43,44, metoden kan let anvendes efter skive dyrkning. Enkeltcelleisolering fra dyrket myokardi kan derfor bidrage til at karakterisere ændringer i kardiomyocytter efter farmakologiske eller fysiske indgreb in vitro.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi vil gerne takke Andreas Dendorfer fra Walter-Brendel-Centre of Experimental Medicine, LMU München, for at have hjælp til udskæringsprotokollen. For at give menneskelige myokardievævsprøver vil vi gerne takke Ghazali Minabari og Christian Heim fra Institut for Hjertekirurgi, University Hospital Erlangen, Hendrik Milting fra Erich & Hanna Klessmann Institute, Ruhr-University Bochum og Muhannad Alkassar fra Institut for Pædiatrisk Kardiologi, University Hospital Erlangen. For støtte med flow cytometri vil vi gerne takke Simon Völkl og kolleger fra translationel forskningscenter (TRC), University Hospital Erlangen. Vi vil også gerne takke Lorenz McCargo og Celine Grüninger fra Institut for Cellulær og Molekylær Fysiologi Erlangen for fremragende teknisk support.

Dette arbejde blev støttet af DZHK (det tyske center for hjerte-kar-forskning) af Det Tværfaglige Center for Klinisk Forskning (IZKF) ved Universitetshospitalet ved Universitetet i Erlangen-Nürnberg og Universitätsbund Erlangen-Nürnberg.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
2,3-butanedionemonoxime Carl Roth 3494.1 Purity>99%
Bovine serum albumin Carl Roth 163.2
CaCl2 Carl Roth 5239.2
Creatine monohydrate Alfa Aesar B250009
Glucose Merck 50-99-7
HEPES Carl Roth 9105.3
KCl Carl Roth P017.1
KH2PO4 Carl Roth 3904.2
L-glutamic acid Fluka Biochemica 49450
Low melting-point agarose Carl Roth 6351.5
MgCl2 x 6H2O Carl Roth A537.1
MgSO4 Sigma Aldrich M-7506
NaCl Carl Roth 9265.1
NaHCO3 Carl Roth 8551.2
Paraformaldehyde Sigma Aldrich P6148
Taurine Sigma Aldrich T8691
Dyes
Di-8-ANEPPS Thermo Fisher Scientific D3167
Fluo-4 AM Thermo Fisher Scientific F14201
FluoVolt Thermo Fisher Scientific F10488
Enzymes
Collagenase CLS type I Worthington LS004196 Used for human tissue at 4 mg/mL
(activity: 280 U/mg)
Collagenase CLS type II Worthington LS004176 Used for rat tissue at 1.5 mg/mL
(activity 330 U/mg)
Protease XIV Sigma Aldrich P8038 Used for rat tissue at 0.5 mg/mL
(activity ≥ 3.5 U/mg)
Proteinase XXIV Sigma Aldrich P5147 Used for human tissue at 0.5 mg/mL
(activity: 7-14 U/mg)
Material
Cell analyzer (LSR Fortessa) BD Bioscience 649225
Centrifuge tube, 15 mL Corning 430790
Centrifuge tube, 50 mL Corning 430829
Compact shaker Edmund Bühler KS-15 B control Agitation direction: horizontal
Disposable plastic pasteur-pipettes Carl Roth EA65.1 For cell trituration use only pipettes with an inner tip diameter ≥2 mm
Forceps FST 11271-30
Heatblock VWR BARN88880030
Nylon net filter, 180 µm Merck NY8H04700
TC Dish 100, Standard Sarstedt 83.3902
TC Dish 35, Standard Sarstedt 83.3900
TC Dish 60, Standard Sarstedt 83.3901
Vibratome (VT1200S) Leica 1491200S001 Includes VibroCheck for infrared-assisted correction of z-deflection

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Powell, T., Twist, V. W. A rapid technique for the isolation and purification of adult cardiac muscle cells having respiratory control and a tolerance to calcium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 13, 258-283 (1976).
  2. Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51, 288-298 (2011).
  3. Isenberg, G., Klockner, U. Calcium Tolerant Ventricular Myocytes Prepared by preincubation in a KB Medium. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 395, 6-18 (1982).
  4. Beuckelmann, D. J., Näbauer, M., Erdmann, E. Intracellular calcium handling in isolated ventricular myocytes from patients with terminal heart failure. Circulation. 85, 1046-1055 (1992).
  5. Brixius, K., Hoischen, S., Reuter, H., Lasek, K., Schwinger, R. H. G. Force/shortening-frequency relationship in multicellular muscle strips and single cardiomyocytes of human failing and nonfailing hearts. Journal of Cardiac Failure. 7, 335-341 (2001).
  6. Peeters, G. A., et al. Method for isolation of human ventricular myocytes from single endocardial and epicardial biopsies. The American Journal of Physiology. 268, 1757-1764 (1995).
  7. Coppini, R., et al. Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples. Journal of Visualized Experiments. (86), e51116 (2014).
  8. Seidel, T., et al. Sheet-Like Remodeling of the Transverse Tubular System in Human Heart Failure Impairs Excitation-Contraction Coupling and Functional Recovery by Mechanical Unloading. Circulation. 135, 1632-1645 (2017).
  9. Hartmann, N., et al. Antiarrhythmic effects of dantrolene in human diseased cardiomyocytes. Heart Rhythm. 14, 412-419 (2017).
  10. Bkaily, G., Sperelakis, N., Doane, J. A new method for preparation of isolated single adult myocytes. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 247, 1018-1026 (1984).
  11. Trube, G. Enzymatic Dispersion of Heart and Other Tissues. Single-Channel Recording. Sakmann, B., Neher, E. , Springer. Boston, MA. 69-76 (1983).
  12. Schlüter, K. D., Schreiber, D. Adult Ventricular Cardiomyocytes. Basic Cell Culture Protocols. 290, 305-314 (2004).
  13. Del Monte, F., et al. Restoration of contractile function in isolated cardiomyocytes from failing human hearts by gene transfer of SERCA2a. Circulation. 100, 2308-2311 (1999).
  14. Brandenburger, M., et al. Organotypic slice culture from human adult ventricular myocardium. Cardiovascular Research. 93, 50-59 (2012).
  15. Fischer, C., et al. Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro. Nature Communications. 10, (2019).
  16. Worthington-Biochemical. Worthington Tissue Dissociation Guide. , Available from: http://www.worthington-biochem.com/tissuedissociation/default.html (2019).
  17. Seidel, T., et al. Glucocorticoids preserve the t-tubular system in ventricular cardiomyocytes by upregulation of autophagic flux. Basic Research in Cardiology. 114 (6), 47 (2019).
  18. Lipsett, D. B., et al. Cardiomyocyte substructure reverts to an immature phenotype during heart failure. Journal of Physiology. 597, 1833-1853 (2019).
  19. Watson, S. A., et al. Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals. Nature Protocols. 12, 2623-2639 (2017).
  20. Guo, G. R., et al. A modified method for isolation of human cardiomyocytes to model cardiac diseases. Journal of Translational Medicine. 16, 1-9 (2018).
  21. Kang, C., et al. Human Organotypic Cultured Cardiac Slices: New Platform For High Throughput Preclinical Human Trials. Scientific Reports. 6, 1-13 (2016).
  22. Gomez, L. A., Alekseev, A. E., Aleksandrova, L. A., Brady, P. A., Terzic, A. Use of the MTT assay in adult ventricular cardiomyocytes to assess viability: Effects of adenosine and potassium on cellular survival. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 29, 1255-1266 (1997).
  23. Zimmerman, A. N. E., Hülsmann, W. C. Paradoxical influence of calcium ions on the permeability of the cell membranes of the isolated rat heart. Nature. 211, 646-647 (1966).
  24. Piper, H. M. The calcium paradox revisited An artefact of great heuristic value. Cardiovascular Research. 45, 123-127 (2000).
  25. Boink, A. B. T. J., Ruigrok, T. J. C., de Moes, D., Maas, A. H. J., Zimmerman, A. N. E. The effect of hypothermia on the occurrence of the calcium paradox. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 385, 105-109 (1980).
  26. Mulieri, L. A., Hasenfuss, G., Ittleman, F., Blanchard, E. M., Alpert, N. R. Protection of human left ventricular myocardium from cutting injury with 2,3-butanedione monoxime. Circulation Research. 65, 1441-1444 (1989).
  27. Busselen, P. Effects of sodium on the calcium paradox in rat hearts. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 408, 458-464 (1987).
  28. Voigt, N., Zhou, X. B., Dobrev, D. Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+Transients and Membrane Currents. Journal of Visualized Experiments. (77), e50235 (2013).
  29. Leor, J., Kloner, R. An Experimental Model Examining the Role of Magnesium in the Therapy of Acute Myocardial Infarction. The American Journal of Cardiology. 75, 1292-1293 (1995).
  30. Herzog, W. R., et al. Timing of Magnesium Therapy Affects Experimental Infarct Size. Circulation. 92, 2622-2626 (1995).
  31. Stringham, J. C., Paulsen, K. L., Southard, J. H., Mentzer, R. M., Belzer, F. O. Forty-hour preservation of the rabbit heart: Optimal osmolarity, [Mg2+], and pH of a modified UW solution. The Annals of Thoracic Surgery. 58, 7-13 (1994).
  32. Hall, S. K., Fry, C. H. Magnesium affects excitation, conduction, and contraction of isolated mammalian cardiac muscle. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 263 (2), Pt 2 622-633 (1992).
  33. Bussek, A., et al. Tissue Slices from Adult Mammalian Hearts as a Model for Pharmacological Drug Testing. Cellular Physiology and Biochemistry. 24, (2009).
  34. Wang, K., et al. Living cardiac tissue slices: An organotypic pseudo two-dimensional model for cardiac biophysics research. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 115, 314-327 (2014).
  35. Thomas, R. C., et al. A Myocardial Slice Culture Model Reveals Alpha-1A-Adrenergic Receptor Signaling in the Human Heart. Journal of the American College of Cardiology: Basic to Translational Science. 1, 155-167 (2016).
  36. Perreault, C. L., et al. Cellular basis of negative inotropic effect of 2,3-butanedione monoxime in human myocardium. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 263, 503-510 (1992).
  37. Vahl, C. F., Bonz, A., Hagl, C., Hagl, S. Reversible desensitization of the myocardial contractile apparatus forcalcium: A new concept for improving tolerance to cold ischemia in human myocardium. European Journal of Cardio-thoracic Surgery. 8, 370-378 (1994).
  38. Horiuti, K., et al. Mechanism of action of 2, 3-butanedione 2-monoxime on contraction of frog skeletal muscle fibres. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 9, 156-164 (1988).
  39. Li, T., Sperelakis, N., Teneick, R. E., Solaro, R. J. Effects of diacetyl monoxime on cardiac excitation-contraction coupling. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 232, 688-695 (1985).
  40. Sellin, L. C., Mcardle, J. J. Multiple Effects of 2,3 Butanedione Monoxime. Pharmacology and Toxicology. 74, 305-313 (1993).
  41. Eghbali-Webb, M., Agocha, A. E. A simple method for preparation of cultured cardiac fibroblasts from adult human ventricular tissue. Novel Methods in Molecular and Cellular Biochemistry of Muscle. Pierce, G. N., Claycomb, W. C. , Springer US. 195-198 (1997).
  42. Camelliti, P., et al. Adult human heart slices are a multicellular system suitable for electrophysiological and pharmacological studies. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51, 390-398 (2011).
  43. Watson, S. A., et al. Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro. Nature Communications. 10, 2168 (2019).
  44. Watson, S. A., Terracciano, C. M., Perbellini, F. Myocardial Slices: an Intermediate Complexity Platform for Translational Cardiovascular Research. Cardiovascular Drugs and Therapy. 33, 239-244 (2019).

Tags

Biologi human hjertesvigt myokardie skiver cardiomyocyte isolation vibratome kontraktile myocytter calcium billeddannelse hjerte excitation-sammentrækning kobling
Isolering af humane ventrikulære kardiomyocytter fra Vibratome-Cut Myocardial Slices
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fiegle, D. J., Volk, T., Seidel, T.… More

Fiegle, D. J., Volk, T., Seidel, T. Isolation of Human Ventricular Cardiomyocytes from Vibratome-Cut Myocardial Slices. J. Vis. Exp. (159), e61167, doi:10.3791/61167 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter