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Biology

ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर का सर्कैडियन एनट्रेनमेंट

Published: June 3, 2020 doi: 10.3791/61176
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 1, 1, 1
1School of Biological and Chemical Sciences, University of Missouri - Kansas City, 2School of Public Health, University of Maryland

Summary

यहां, हम एक सर्कैडियन दिवस के लिए ड्रोसोफिला को सिंक्रोनाइज़ करने के तरीके का विस्तार करते हैं। यह जैविक लय और क्रोनोबायोलॉजी का अध्ययन करने के लिए आवश्यक पहला, और सबसे महत्वपूर्ण कदम है।

Abstract

जीवों के बीच लगभग सार्वभौमिक, सर्कैडियन लय सूर्य के चारों ओर पृथ्वी की कक्षा में जैविक गतिविधि का समन्वय करते हैं। इस लय को बनाने वाले कारकों की पहचान करने और परिणामस्वरूप आउटपुट को समझने के लिए, परिभाषित सर्कैडियन समय-बिंदुओं के लिए मॉडल जीवों की उत्पन्नता की आवश्यकता है। यहां हम एक परिभाषित सर्कैडियन लय के लिए कई ड्रोसोफिला को प्रशिक्षित करने के लिए एक प्रक्रिया का विस्तार करते हैं। इसके अलावा, हम इम्यूनोफ्लोरेसेंस, न्यूक्लिक एसिड, या प्रोटीन निष्कर्षण आधारित विश्लेषण के लिए नमूने तैयार करने के लिए पोस्ट-एनट्रेनमेंट चरणों का विस्तार करते हैं।

Introduction

पृथ्वी पर लगभग सभी जीवों, सबसे बड़े नीचे से एक कोशिकित तक, एक आंतरिक जैविक घड़ी है जिसमें लगभग एक दिन का चक्र होता है। यह सर्कैडियन ताल के रूप में जाना जाता है (लैटिन शब्दों से फ्रांज हैलबर्ग द्वारा 1 9 53 में गढ़ा गया = लगभग और "मर जाता है" = दिन)1। यद्यपि कोर घड़ी के घटक ज्ञात हैं और कार्य के उनके प्रारंभिक तंत्र की अवधारणा है, फिर भी यह समझने के लिए बहुत कुछ है कि पूरे शरीर में जैविक लय कैसे बनाए रखी जाती है। महत्वपूर्ण बात यह है कि जैविक लय का गलतीकरण खराब स्मृति गठन, नींद विकारों, मौसमी प्रभाव विकार, अवसाद, द्विध्रुवी विकार, मधुमेह, मोटापा, न्यूरोडिजनरेशन, और कैंसर2,,3,4,5सहित खराब स्वास्थ्य परिणामों से जुड़ा हुआ है।,,

ड्रोसोफिला सर्कैडियन जीव विज्ञान की जांच के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित मॉडल है। आनुवंशिक और जैव रासायनिक रूप से ट्रैक्टेबल, बड़ी संख्या आसानी से प्रशिक्षित होती है (जैसा कि दिखाया जाएगा)। वास्तव में, सर्कैडियन लय की खोज के लिए नोबेल पुरस्कार प्रदान करने में समर्थन के प्रमुख प्रकाशनों के रूप में उद्धृत सभी सात प्रकाशनों ने ड्रोसोफिला मॉडल 6 ,7, 8 , 9,,,10,811,1211,कीइन शक्तियों का लाभउठाया।

इसके अतिरिक्त, हम या तो इम्यूनोफ्लोरेसेंस, न्यूक्लिक एसिड, या प्रोटीन निष्कर्षण आधारित विश्लेषण के प्रयोजनों के लिए प्रशिक्षित मक्खियों को इकट्ठा करने के लिए प्रभावी रणनीतियों को दिखाते हैं। इन रणनीतियों का उपयोग करना, एक प्रक्रिया और भविष्य में विश्लेषण के लिए नमूनों की बड़ी मात्रा में स्टोर कर सकते हैं । ये विधियां बहुत फायदेदार हैं कि वे प्रजनन योग्य हैं और सैकड़ों प्रशिक्षित मक्खियों को प्राप्त कर सकते हैं जो एक बड़े डेटा पूल का हिस्सा हो सकते हैं।

Protocol

1. मक्खी खाद्य उत्पादन

  1. पानी के हर 1 एल के अनुसार, 4.69 ग्राम सूखे गुड़, 19.70 ग्राम शुष्क सक्रिय खमीर, 87.22 ग्राम मकई भोजन और 7.83 ग्राम आगर से मिलकर फ्लाई फूड तैयार करें।
  2. ऊपर सूचीबद्ध सामग्री को एक क्रॉकपॉट में मिलाएं और गर्मी को 250 डिग्री एफ में बदल दें। मिक्स के साथ-साथ सामग्री जोड़ी जाती है।
  3. फ्लाई फूड गर्म होने के साथ-साथ सामग्री को हर 10 मिनट में मिलाते हुए जब तक यह रोलिंग फोड़ा तक नहीं पहुंचता है, तब तक क्रॉकपॉट पर ढक्कन रखें। गर्मी को बंद करने से पहले रोलिंग फोड़ा को 20 मिनट तक जारी रखने की अनुमति दें।
  4. 83.60 एमएल पानी जोड़ें और भोजन ठंडा होने के साथ ही क्रॉकपॉट के ढक्कन को बंद रखें।
  5. मिश्रण और एक गिलास थर्मामीटर के साथ हर 10 मिनट भोजन के तापमान रिकॉर्ड। फिल्म की एक परत भोजन के शीर्ष पर व्यवस्थित करने से बचें ।
  6. एक बार भोजन 60 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा हो जाने के बाद, टेगोसेप्ट के 10.44 एमएल और प्रति लीटर पानी के प्रोपोनिक एसिड के 5.51 मिलियन एमएल जोड़ें (चरण 1.1 देखें)।
  7. अच्छी तरह से मिलाएं और भोजन को बहुत ठंडा होने से रोकने के लिए 60 डिग्री सेल्सियस तक गर्मी को चालू करें।
  8. ड्रोसो-फिलर का उपयोग करके आवश्यकतानुसार फ्लाई फूड पंप करें।
  9. संकीर्ण शीशियों के लिए, पंप 10 एमएल और 6 ऑउंस स्क्वायर बॉटम बोतलों के लिए 60 एमएल पंप करें।

2. परिभाषित उम्र की मक्खियों का संग्रह

  1. 5-7 दिनों के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत जंगली प्रकार मक्खियों की बोतलों की निगरानी करें जब तक कि बड़ी मात्रा में प्यूपा (लगभग 200 पिल्ला) बोतल के किनारे से जुड़े न हों। इस्तेमाल की गई बोतलें स्क्वायर बॉटम्स के साथ 6 ऑउंस ड्रोसोफिला स्टॉक की बोतलें हैं ।
  2. बोतल से मौजूदा वयस्कों को साफ़ करें। या तो वयस्कों को एक नई बोतल में टिप करें या उन्हें 70% इथेनॉल में रखें। मक्खी भोजन में किसी भी शेष वयस्कों को पुश करने के लिए एक #0 तूलिका के सुस्त अंत का उपयोग करें। उपयोग से पहले और बाद में 70% इथेनॉल के साथ पेंट ब्रश को पोंछना सुनिश्चित करें।
  3. अगली पीढ़ी को एक बंद करने के लिए अनुमति देने के लिए एक 25 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 3 दिनों के लिए बैठने के लिए मंजूरी दे दी बोतलों की अनुमति दें । ये मक्खियां 0 से 3 दिन पुरानी होंगी।

3. मक्खी जुदाई

  1. 3 दिनों के बाद, महिलाओं से पुरुषों को अलग करें और प्रत्येक लिंग के लिए वांछित संख्या एकत्र करें प्रत्येक चार समय अंक के लिए। मक्खियों को जननांग की जांच करके सेक्स से अलग किया जा सकता है; पुरुषों में अंधेरे गोल जननांग होते हैं जबकि महिलाओं में हल्का, अधिक नुकीला जननांग होता है। मादाएं भी नर मक्खियों की तुलना में बहुत बड़ी हैं।
    1. मक्खियों को प्रभावी ढंग से अलग करने और लिंगों के बीच अंतर करने के लिए सीओ2 संज्ञाहरण पैड का उपयोग करें। उन्हें मारने से बचने के लिए पेंट ब्रश के साथ मक्खियों को ले जाएं।
    2. प्रत्येक बार बिंदु के लिए 100 पुरुषों और 100 महिलाओं को इकट्ठा करें, प्रति शीशी 50 पुरुषों और प्रति शीशी 100 महिलाओं के साथ। नर अधिक आक्रामक होते हैं और उनके सामाजिक संपर्कों से बहुत अधिक मौतें होती हैं जब एक शीशी में 100 व्यक्ति होते हैं। 100 व्यक्तियों तक महिलाएं- शीशी में निहित होने के दौरान अप्रभावित होती हैं।
  2. निम्नलिखित समय बिंदुओं पर संग्रह करें: ZT1, ZT7, ZT13 और ZT19(तालिका 1)। ध्यान दें कि अंधेरे में किए गए संग्रह (ZT12-ZT24) हल्के संवेदनशील हैं जबकि ZT0-ZT11 संग्रह रोशनी के दौरान किया जाता है-समय पर और कमरे में रोशनी पर किया जा सकता है । कृपया ध्यान दें कि दो अलग-अलग इनक्यूबेटर का उपयोग 12 घंटे के प्रकाश पैटर्न के साथ किया जाता है ताकि सभी संग्रह दिन के दौरान होने की अनुमति दी जा सके और रात भर नहीं।
  3. भविष्य के एनट्रेनमेंट के लिए मक्खियों की नई बोतलें बनाने के लिए अतिरिक्त मक्खियों का उपयोग करें। प्रत्येक नई बोतल में 5-7 पुरुषों के साथ 25 महिलाओं को रखें और इनक्यूबेटर में 25 डिग्री सेल्सियस रखें।

4. फ्लाई इनक्यूबेशन

  1. मक्खियों को 3-5 दिनों के लिए हल्के विनियमित इनक्यूबेटर में रहने की अनुमति दें ताकि सर्कैडियन एनट्रेनमेंट होने दिया जा सके। सुनिश्चित करें कि इनक्यूबेटर हल्के-तंग हैं क्योंकि प्रकाश प्रदूषण की भी छोटी मात्रा एनट्रेनमेंट को परेशान करेगी।

5. इम्यूनोफ्लोरेसेंस निर्धारण

  1. प्रशिक्षण के बाद, नमूनों के लिए फिक्सेशन समाधान की नई शीशियां तैयार करें जिनका उपयोग इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए किया जाएगा। इनक्यूबेटर से मक्खियों को हटाने से पहले, 1x पीबीएस + 0.1% ट्वीन-20 में पतला 4% फॉर्मलडिहाइड के 4.8 एमएल को प्रत्येक नई संकीर्ण शीशी में प्रत्येक 100 मक्खियों के लिए जोड़ें जिन्हें उतारना है। प्रत्येक शीशी में 100 पुरुष या 100 महिला सर्कैडियन प्रशिक्षित मक्खियों का घर होगा। संकरी शीशियों को बर्फ में रखें।

6. इम्यूनोफ्लोरेसेंस संग्रह

  1. इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए इनक्यूबेटर से मक्खियों को इकट्ठा करते समय, बोतल टोपी को हटा दें और बोतल को फड़ में जल्दी से उलटा करें। मक्खियों को शीशी में मार्गदर्शन करने में मदद करने के लिए कीप के माध्यम से हल में मक्खियों को धीरे से टैप करें; एक शीशी में कुल 100 पुरुषों के लिए 50 पुरुषों की दो ट्यूबों को मिलाएं और अन्य शीशी के लिए 100 महिलाओं की एक ट्यूब का उपयोग करें।
  2. अंधेरे में ZT13 और ZT19 संग्रह प्रदर्शन; एक रेड लाइट का उपयोग क्रम में ड्रोसोफिला के रूप में देखने के लिए अभी तक कम इन प्रकाश तरंगदैर्ध्य के प्रति संवेदनशील हैं और इसलिए कम प्रकाश प्रदूषण13से ग्रस्त हैं . क्रिप्टोक्रोम प्रोटीन, विशेष रूप से, विशेष रूप से नीली रोशनी के प्रति संवेदनशील है, जिसे14से बचा जाना चाहिए।
    1. प्रकाश जोखिम को कम करने के लिए, सुनिश्चित करें कि संग्रह का कमरा प्रकाश के किसी भी स्रोत के साथ हल्का तंग है या कवर किया गया है। इन शीशियों को पन्नी में लपेटें ताकि निम्नलिखित चरण में नटेटिंग मिक्सर पर रखे जाने पर ZT13 और ZT19 मक्खियों को प्रकाश के संपर्क में न आ जाए। ZT1 और ZT7 मक्खियों प्रकाश संवेदनशील नहीं हैं और पन्नी को कवर किए बिना मिक्सर पर रखा जा सकता है।

7. अखरोट मिक्सर और भंडारण

  1. मक्खियों को एकत्र करने के बाद, बिखराव से बचने के लिए फिक्सेटिव युक्त शीशियों के शीर्ष को टेप करें और उन्हें 4 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 165 आरपीएम पर नटेटिंग मिक्सर पर रखें। इस निर्धारण चरण के बाद मक्खियों को अब प्रकाश संवेदनशील नहीं किया जाता है, इसलिए समाधान को सत्यापित करने के लिए पन्नी को हटाया जा सकता है और मक्खियों को फिक्सेटिव में जलमग्न किया जा रहा है।
  2. अखरोट मिक्सर से शीशियों युक्त मक्खी को हटाने के बाद फॉर्मेल्डिहाइड को हटा दें और प्रत्येक धोने के साथ शीशी को उलटते हुए 1x पीबीएस के 3,000 माइक्रोन के साथ तीन बार धोएं।
  3. भविष्य में इम्यूनोफ्लोरेसेंस15का इंतजार करने के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस के नमूनों को 4 डिग्री सेल्सियस पर रखने वाली शीशियों को स्टोर करें ।

8. प्रोटीन निकालने के लिए संग्रह

  1. प्रोटीन निकालने के लिए नमूनों के संरक्षण के लिए चार 50 एमएल ट्यूब और एक देवर युक्त तरल नाइट्रोजन तैयार करें
  2. प्रोटीन या न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण के लिए मक्खियों को इकट्ठा करने के लिए, बोतलों से ट्यूब में मक्खियों को चरण 6.1 के समान तरीके से स्थानांतरित करें और मक्खियों की रिहाई को रोकने के लिए ट्यूब को जल्दी से कैप करें और ट्यूब को स्नैप फ्रीज करने के लिए तरल नाइट्रोजन में रखें।

9. प्रोटीन निकालने के लिए भंडारण

  1. -80 डिग्री सेल्सियस पर प्रोटीन निकालने के लिए स्नैप जमे हुए नमूनों को स्टोर करें। इन्हें डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए उपयुक्त प्रोटीन निष्कर्षण प्रोटोकॉल के अनुसार संसाधित किया जा सकता है, जिसमें इम्यूनोब्लोटिंग16शामिल है।

Representative Results

नियंत्रित सर्कैडियन एनट्रेनमेंट शोधकर्ताओं को ZT1-ZT19 समय कार्यक्रम का उपयोग करके या आवश्यक समय-बिंदुओं को जोड़ने के लिए सर्कैडियन दिन भर में विशिष्ट समय बिंदुओं पर जीव विज्ञान की जांच करने की अनुमति देता है। यहां हम मक्खियों को सर्कैडियन चक्रों में प्रशिक्षित करने के लिए प्रकाश और अंधेरे का उपयोग करते हैं और अवधि प्रोटीन के इम्यूनोब्लोटिंग और इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण द्वारा एनट्रेनमेंट को सत्यापित करते हैं, सर्कैडियन एनट्रेनमेंट(चित्रा 1)के लिए एक मार्कर। सही एनट्रेनमेंट पर, अवधि प्रोटीन में एक विशिष्ट तीव्रता और गतिशीलता पैटर्न(चित्रा 1ए)होना चाहिए और इसे ZT1 मस्तिष्क(चित्रा 1बी)में विशिष्ट स्थानों पर दिखाई देना चाहिए। यद्यपि भोजन और तापमान सहित अन्य चर, सर्कैडियन एनट्रेनमेंट को प्रभावित कर सकते हैं,प्रकाश 17को नियंत्रित करने के लिए सबसे सरल और विश्वसनीय है। इन तरीकों के उद्देश्य से, इनक्यूबेटर तापमान को स्थिर रखा जाता है, जो सेरेब्रल क्लॉक न्यूरॉन्स पर निर्भर होता है जो18के लिए प्रकाश से प्रभावित होते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: एनट्रेनमेंट का सत्यापन। (A) एनट्रेंटेड मक्खियों के सिर से तैयार पूरे सेल अर्क की इम्यूनोब्लोटिंग से पीरियड प्रोटीन मोबिलिटी और तीव्रता19के विहित पैटर्न दिखाई देते हैं । संकेत Zeitgeber बार (ZT) में से प्रत्येक से १.४ महिला सिर एक विरोधी प्रति एंटीबॉडी का उपयोग कर विश्लेषण किया गया । (ख)जेडटी में एकत्र किए गए प्रशिक्षित दिमाग की इम्यूनोफ्लोरेसेंस, जहां अवधि प्रोटीन एक विशिष्ट पैटर्न (नीचे पैनल, हेलफ्रिच-फोर्स्टर20से निर्मित) में पाया जाता है। दिखाया गया है मस्तिष्क के विभिन्न वर्गों से ली गई छवियां, ZT1 में अवधि प्रोटीन शामिल होने की उम्मीद सभी न्यूरॉन्स पर कब्जा । स्केल बार 40 माइक्रोन है. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

ZT1 ZT7 ZT13 ZT19
सुबह 10 बजे से रात 10 बजे के बीच लाइट सुबह 10 बजे से रात 10 बजे के बीच लाइट सुबह 9 बजे से रात 9 बजे के बीच अंधेरा सुबह 9 बजे से रात 9 बजे के बीच अंधेरा
प्रकाश में 1 घंटे के बाद 11 बजे एकत्र प्रकाश में 7 घंटे के बाद 5 बजे एकत्र अंधेरे में 1 घंटे के बाद 10 बजे एकत्र अंधेरे में 7 घंटे के बाद 4 बजे एकत्र

तालिका 1: ZT1-ZT19 सर्कैडियन रिदम टाइमिंग शेड्यूल।

Discussion

शोधकर्ता इस एनट्रेनमेंट प्रोटोकॉल का उपयोग सफलता और स्थिरता के साथ करते हैं। यह प्रक्रिया एक बड़े नमूना पूल के निर्धारण की अनुमति देती है जिसे भविष्य के विश्लेषण के लिए संग्रहीत किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, यह रणनीति भविष्य की परीक्षा के लिए एनट्रेनमेंट द्वारा प्रेरित न्यूरोलॉजिकल पैटर्न को बरकरार रखती है।

भंडारण के लिए निर्धारण एनट्रेनमेंट प्रक्रिया का एक प्रमुख घटक है क्योंकि यह मस्तिष्क के ऊतकों को स्थिर करने में मदद करता है और यह डेटा पूल से प्रत्येक मस्तिष्क का विश्लेषण करने के लिए अधिक समय की अनुमति देता है इस प्रकार दिमाग से अपशिष्ट को कम करता है जो21वर्ष की आयु के कारण व्यवहार्यता खो देता है। मुख्य लक्ष्य के रूप में संभव के रूप में कई मक्खियों के रूप में सर्कैडियन entrain इतना है कि वहां लगातार सिर विच्छेदन और अंततः इम्यूनोफ्लोरेसेंस या प्रोटीन निष्कर्षण के लिए उपलब्ध है निष्कर्षों का निरीक्षण और निर्धारित अगर परिणाम उच्च विश्वास के हैं । यह सुनिश्चित करने के लिए कि सर्कैडियन एनट्रेनमेंट को निर्धारण के माध्यम से संरक्षित किया जाता है, यह अभिन्न है कि प्रकाश प्रदूषण का कोई भी स्रोत समाप्त हो जाता है। निर्धारण प्रक्रिया ड्रोसोफिला को अपने न्यूरोलॉजिकल "टाइमस्टैंप" को बनाए रखते हुए संग्रहीत करने की अनुमति देती है ताकि उन्हें बाद में विच्छेदित किया जा सके और उन मक्खियों के लिए कोई उल्लेखनीय अंतर के साथ विश्लेषण किया जा सके जो विच्छेदित होते हैं और विलोपन के तुरंत बाद इम्यूनोफ्लोरेसेंस से गुजरे हैं। इम्यूनोफ्लोरेसेंस से पहले निर्धारण के प्रयोजनों के लिए, प्रयोगशाला ने स्थिरता के साथ निर्धारित किया है कि मक्खियों कम से कम 1 महीने तक व्यवहार्य हैं। पश्चिमी दाग प्रोटीन निष्कर्षण के लिए फिक्सेशन-80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत होने पर दिमाग को अनिश्चित काल के लिए व्यवहार्य बना देता है।

एक और महत्वपूर्ण प्रोटोकॉल कदम मक्खियों की सेक्सिंग है। यह महत्वपूर्ण है कि यह कदम सही तरीके से किया जाता है क्योंकि निर्धारण से पहले एक ही शीशी में दोनों लिंगों को संभोग करना पड़ सकता है, जो नई मक्खियों को उत्पन्न करेगा जो छोटी उम्र और भ्रष्ट प्रोटीन विश्लेषण के होते हैं यदि पुरुषों की गलती से महिलाओं के बजाय जांच की जाती है या इसके विपरीत। इसके अतिरिक्त, सेक्सिंग करते समय लार्वा नमूनों को हटाना महत्वपूर्ण है जो कई बार महिलाओं से जुड़े होते हैं। यह महिला शीशी के अंदर नई संतान के विकास को रोकता है जो संभावित रूप से भ्रष्ट परिणाम दे सकता है।

एनट्रेनमेंट प्रोटोकॉल के लिए अगला कदम डेटा विश्लेषण से संबंधित वस्तुओं के साथ हो सकता है। प्रोटोकॉल का ध्यान प्रोटीन स्थानीयकरण है, लेकिन यदि अन्य चर हैं जो सर्कैडियन एनट्रेनमेंट से प्रभावित होते हैं, तो उन्हें नए रास्ते के माध्यम से पता लगाया जाना चाहिए, अक्सर प्रोटीन या न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण की आवश्यकता होती है। इसके अतिरिक्त, मस्तिष्क के अन्य प्रोटीन हैं जिनका विश्लेषण अभी भी इस प्रोटोकॉल के माध्यम से किया जा सकता है। प्रोटोकॉल से जुड़े प्रयोगों में कुछ प्रोटीन का विश्लेषण किया गया लेकिन सर्कैडियन जीव विज्ञान में भूमिका निभाने वाले जीन और प्रोटीन की सूची खत्म नहीं हुई है । प्रोटोकॉल एक सर्कैडियन लय स्थापित करने के लक्ष्य को पूरा करने में प्रभावी है, हालांकि, अनुप्रयोगों को व्यापक रूप से कर रहे हैं ।

Disclosures

कोई नहीं.

Acknowledgments

मिसौरी विश्वविद्यालय-कंसास सिटी और जेफरी एल मूल्य प्रयोगशाला के लिए विशेष धन्यवाद।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100-1000uL pipette Eppendorf ES-1000
10-100uL pipette Eppendorf ES-100
16% Paraformaldehyde Solution 15710
1X PBS Caisson Labs PBL01-6X100ML
Agar Fisher Scientific BP1423500
Anesthesia Filter Connection Kit World Precision Instruments EZ-251A
Corn meal Genesee Scientific 62-100
Dried Molasses Food Service Direct OT280504
Droso-filler Food Pump geneseesci.com 59-169
Drosophila Stock bottles, 6 oz square bottom w/ Flugs geneseesci.com 32-130BF
Drosophila vials, Narrow K-Resin super bulk geneseesci.com 32-118SB
Dry active yeast Genesee Scientific 62-103
Ethanol IBI Scientific IB15720
EZ Basic Anesthesia System World Precision Instruments EZ-175
Falcon Centrifuge tubes Corning 352097
Falcon round bottom tubes Corning 352057
Fine point Sharpie marker Sharpie 30001
Fisherbrand Nutating Mixer Fisher Scientific 88-861-043
Flugs-Narrow Plastic Vials Genesee Scientific 49-102
Glass Thermometer Cole-Palmer EW-08008-12
Liquid nitrogen hose Thermo Scientific 398202
Liquid nitrogen tank-Dewar Cooper Surgical Inc 900109-1
Liquid nitrogen transfer vessel Electron Mircoscopy Sciences 61891-02
Paintbrushes(Red Sable) Size #0 Electro Microscopy Sciences 66100-00 This is used to separate the flies via sex without causing injury.
Plastic funnel Plews and Edelmann 570-75-062
Polarizing light microscope Microscope Central 1100100402241 Used to more clearly view Drosophila during sexing
ProPette Pipette Tips MTC Bio Incorporated P5200-100U
ProPette Pipette Tips MTC Bio Incorporated P5200-1M
ProPette Pipette Tips MTC Bio Incorporated P5200-5M
Propionic Acid Sigma Aldrich P1386-1L
Rayon Balls Genesee Scientific 51-100
Reynolds wrap standard aluminum foil Staples 1381273
Roaster Oven (Crockpot) Hamilton Beach 32950
Scotch 810 Magic Tape Electron Microscopy Sciences 77300
Spray bottle with trigger US Plastic 66446 Used to spray ethanol to clean work bend areas
Tegosept Genesee Scientific 20-258
Thermo Scientific Drosophila Incubator Thermo Scientific 3990FL
Thermo Scientific Revco 4 degree Lab fridge ThermoFisher Scientific REL7504D
Thermo Scientific Revco Lab Freezer ThermoFisher Scientific REL7504A
Tween 20 Anatrace T1003-1-GA

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References

  1. Halberg, F. Some physiological and clinical aspects of 24-hour periodicity. The Journal-Lancet. 73 (1), 20-32 (1953).
  2. Smarr, B. L., Jennings, K. J., Driscoll, J. R., Kriegsfeld, L. J. A time to remember: the role of circadian clocks in learning and memory. Behavioral Neuroscience. 128 (3), 283-303 (2014).
  3. Leng, Y., Musiek, E. S., Hu, K., Cappuccio, F. P., Yaffe, K. Association between circadian rhythms and neurodegenerative diseases. The Lancet. Neurology. 18 (3), 307-318 (2019).
  4. Hood, S., Amir, S. Neurodegeneration and the Circadian Clock. Frontiers in aging Neuroscience. 9, 170 (2017).
  5. Sulli, G., Lam, M. T. Y., Panda, S. Interplay between Circadian Clock and Cancer: New Frontiers for Cancer Treatment. Trends in Cancer. 5 (8), 475-494 (2019).
  6. Zehring, W. A., et al. P-element transformation with period locus DNA restores rhythmicity to mutant, arrhythmic Drosophila melanogaster. Cell. 39 (2 Pt 1), 369-376 (1984).
  7. Bargiello, T. A., Jackson, F. R., Young, M. W. Restoration of circadian behavioural rhythms by gene transfer in Drosophila. Nature. 312 (5996), 752-754 (1984).
  8. Siwicki, K. K., Eastman, C., Petersen, G., Rosbash, M., Hall, J. C. Antibodies to the period gene product of Drosophila reveal diverse tissue distribution and rhythmic changes in the visual system. Neuron. 1 (2), 141-150 (1988).
  9. Hardin, P. E., Hall, J. C., Rosbash, M. Feedback of the Drosophila period gene product on circadian cycling of its messenger RNA levels. Nature. 343 (6258), 536-540 (1990).
  10. Liu, X., et al. The period gene encodes a predominantly nuclear protein in adult Drosophila. Journal of Neuroscience. 12 (7), 2735-2744 (1992).
  11. Vosshall, L. B., Price, J. L., Sehgal, A., Saez, L., Young, M. W. Block in nuclear localization of period protein by a second clock mutation, timeless. Science (New York, N.Y). 263 (5153), 1606-1609 (1994).
  12. Price, J. L., et al. double-time is a novel Drosophila clock gene that regulates period protein accumulation. Cell. 94 (1), 83-95 (1998).
  13. Hanai, S., Hamasaka, Y., Ishida, N. Circadian entrainment to red light in Drosophila: requirement of Rhodopsin 1 and Rhodopsin 6. Neuroreport. 19 (14), 1441-1444 (2008).
  14. Vinayak, P., et al. Exquisite light sensitivity of Drosophila melanogaster cryptochrome. PLoS Genetics. 9 (7), e1003615 (2013).
  15. Kelly, S. M., Elchert, A., Kahl, M. Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains. Journal of Visualized Experiments. (129), e56174 (2017).
  16. Au-Eslami, A., Au-Lujan, J. Western Blotting: Sample Preparation to Detection. Journal of Visualized Experiments. (44), e2359 (2010).
  17. Fan, J. Y., Muskus, M. J., Price, J. L. Entrainment of the Drosophila circadian clock: more heat than light. Science's signal Transduction Knowledge Environment. (413), pe65 (2007).
  18. Miyasako, Y., Umezaki, Y., Tomioka, K. Separate sets of cerebral clock neurons are responsible for light and temperature entrainment of Drosophila circadian locomotor rhythms. Journal of Biological Rhythms. 22 (2), 115-126 (2007).
  19. Edery, I., Zwiebel, L. J., Dembinska, M. E., Rosbash, M. Temporal phosphorylation of the Drosophila period protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (6), 2260-2264 (1994).
  20. Helfrich-Forster, C. The neuroarchitecture of the circadian clock in the brain of Drosophila melanogaster. Microscopy Research and Technique. 62 (2), 94-102 (2003).
  21. Price, J. L. Genetic screens for clock mutants in Drosophila. Methods in Enzymology. 393, 35-60 (2005).

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जीव विज्ञान अंक 160 ड्रोसोफिला,सर्कैडियन एनट्रेनमेंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटीन निष्कर्षण निर्धारण न्यूरोबायोलॉजी
ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर का सर्कैडियन एनट्रेनमेंट
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Dada, A. O., Nguyen, M. Q.,… More

Dada, A. O., Nguyen, M. Q., Peterson, S. M., Ngo, V. T., Cornelio-Parra, D. V., Omer, B. S., Thapa, A., Rapp, S. R., Cloud, V. J., Mohan, R. D. Circadian Entrainment of Drosophila Melanogaster. J. Vis. Exp. (160), e61176, doi:10.3791/61176 (2020).

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