Summary
Her beskriver vi, hvordan man synkroniserer Drosophila til en døgnrytmen dag. Dette er det første og vigtigste skridt, der er nødvendigt for at studere biologiske rytmer og kronobiologi.
Abstract
Næsten universel blandt organismer koordinerer døgnrytme biologisk aktivitet til Jordens bane omkring solen. For at identificere faktorer, der skaber denne rytme og forstå de deraf følgende output, er der behov for entraining af modelorganismer til definerede døgnrytmetidspunkter. Her beskriver vi en procedure for at oprede mange Drosophila til en defineret døgnrytme. Desuden beskriver vi post-entrainment skridt til at forberede prøver til immunfluorescens, nukleinsyre, eller protein ekstraktion-baseret analyse.
Introduction
Næsten alle organismer på Jorden, fra den største ned til encellede, har en intern biologisk ur med en cyklus på omkring en dag. Dette er kendt som døgnrytmen (opfundet i 1953 af Franz Halberg fra latinske termer circa = om / ca og "dør" = dag)1. Selv om komponenter i kernen ur er kendt, og deres rudimentære mekanismer funktion konceptualiseret, er der stadig meget at forstå om, hvordan biologiske rytmer opretholdes i hele kroppen. Vigtigere er det, misregulering af biologiske rytmer er forbundet med dårlige sundhedsmæssige resultater, herunder dårlig hukommelse dannelse, søvnforstyrrelser, sæsonbestemt påvirke lidelse, depression, bipolar lidelse, diabetes, fedme, neurodegeneration, og kræft2,,3,4,5.
Drosophila er en veletableret model for undersøgelse af døgnrytmen biologi. Genetisk og biokemisk tractable, et stort antal er let entrained (som vil blive vist). Faktisk alle syv publikationer nævnt som centrale publikationer støtte i tildelingen af Nobelprisen for opdagelsen af døgnrytmen gearede disse styrker af Drosophila model6,7,88,9,10,11,12.
Derudover viser vi effektive strategier for indsamling af indtræmte fluer med henblik på enten immunfluorescens, nukleinsyre eller proteinekstraktionsbaseret analyse. Ved hjælp af disse strategier, kan man behandle og gemme større mængder af prøver til analyse i fremtiden. Disse metoder er meget fordelagtige, fordi de er reproducerbare og kan give hundredvis af inddannede fluer, der kan være en del af en stor datapulje.
Protocol
1. Fly fødevareproduktion
- Pr. 1 L vand tilberedes flyvemad bestående af 4,69 g tørret melasse, 19,70 g tør aktiv gær, 87,22 g majsmel og 7,83 g agar.
- Kombiner indholdet ovenfor i en crockpot og drej varmen til 250 °F. Bland samt ingredienser tilsættes.
- Hold låget på crockpot som flue mad er opvarmning og samtidig blande indholdet hver 10 min, indtil den når en rullende kog. Lad den rullende kog fortsætte i 20 minutter, før du slukker for varmen.
- Tilsæt 83,60 ml vand og hold låget af crockpot off som maden køler.
- Bland og registrere temperaturen af maden hver 10 min med et glas termometer. Undgå at lade et lag af film bosætte sig på toppen af maden.
- Når maden er afkølet til 60 °C, tilsættes 10,44 ml Tegosept og 5,51 ml propionsyre pr. liter tilsat vand (se trin 1.1).
- Bland godt og drej varmen op til 60 °C for at forhindre, at maden bliver for afkølet.
- Pump flyvemaden efter behov ved hjælp af Droso-fyldstof.
- For smalle hætteglas, pumpe 10 ml og for 6 ounce kvadratisk bund flasker pumpe 60 ml.
2. Indsamling af fluer af defineret alder
- Monitor flasker af vild type fluer opbevares ved 25 °C i 5-7 dage, indtil store mængder pupper (ca. 200 pupper) er fastgjort til siden af flasken. De anvendte flasker er 6 ounce Drosophila lagerflasker med firkantede bunde.
- Ryd eksisterende voksne fra flasken. Enten tip de voksne i en ny flaske eller placere dem i 70% ethanol. Brug den kedelige ende af #0 en børste til at skubbe eventuelle resterende voksne ind i flyvemaden. Sørg for at tørre penselpensel ned med 70% ethanol før og efter brug.
- Lad de rensede flasker sidde i 3 dage i en 25 °C-inkubator for at gøre det muligt for den næste generation at lukke. Disse fluer vil være mellem 0 og 3 dage gamle.
3. Flyveadskillelse
- Efter 3 dage, adskille hanner fra kvinder og indsamle det ønskede nummer for hvert køn for hver af de fire tidspoint. Fluer kan differentieres efter køn ved at undersøge kønsorganer; hanner har mørke afrundede kønsorganer, mens hunnerne har lettere, mere spidse kønsorganer. Hunnerne er også meget større end mandlige fluer.
- Brug en CO2 anæstesi pad til effektivt at adskille fluer og skelne mellem kønnene. Flytte fluer med penselstrøg for at undgå at dræbe dem.
- Saml 100 hanner og 100 hunner for hvert tidspunkt med 50 hanner pr. hætteglas og 100 hunner pr. hætteglas. Mænd har tendens til at være mere aggressive og deres sociale interaktioner føre til en masse dødsfald, når der er 100 personer i et hætteglas. Hunnerne-op til 100 personer- er upåvirket, mens indeholdt i hætteglasset.
- Samlingerne udføres på følgende tidspunkt: ZT1, ZT7, ZT13 og ZT19 (tabel 1). Bemærk, at samlinger udført i mørke (ZT12-ZT24) er lysfølsomme, mens ZT0-ZT11 samlinger udføres under lys-on tider og værelse lys kan være tændt. Bemærk venligst, at der anvendes to separate væksthuse med omvendte 12 timers lysmønstre, så alle samlinger kan forekomme i løbet af dagen og ikke natten over.
- Brug overskydende fluer til at skabe nye flasker fluer til fremtidig indtrædelse. Der skal være 25 hunner med 5-7 hanner i hver ny flaske, og inkubatoren skal være placeret ved 25 °C.
4. Flueinkubation
- Lad fluerne blive i lette regulerede væksthuse i 3-5 dage, så der kan forekomme døgnrytmeindrænkning. Sørg for, at inkubatorer er lettætte, fordi selv små mængder lysforurening vil forstyrre medrivningen.
5. Immunfluorescensfiksering
- Efter indtrængning forberedes nye hætteglas med fikseringsopløsning til prøver, der skal anvendes til immunfluorescens. Før fluerne fjernes fra inkubatoren, tilsættes 4,8 ml formaldehyd fortyndet i 1x PBS + 0,1% Tween-20 til hvert nyt smalt hætteglas for hver 100 fluer, der skal fikseres. Hvert hætteglas vil huse 100 mandlige eller 100 kvindelige døgnrytmen entrained fluer. Placer de smalle hætteglas i isen.
6. Immunofluorescens samling
- Når fluerne opsames fra inkubatoren for immunfluorescens, fjernes flaskehætten, og flasken skal hurtigt vendes ind i tragten. Bank fluerne forsigtigt ind i opløsningen via tragten for at hjælpe med at lede fluerne ind i hætteglasset. kombinere to rør af de 50 hanner til i alt 100 hanner i et hætteglas og bruge et enkelt rør på 100 hunner til det andet hætteglas.
- Udfør ZT13 og ZT19 samlinger i mørke; bruge et rødt lys for at se som drosophila er langt mindre følsomme over for disse lys bølgelængder og er derfor mindre tilbøjelige til lysforurening13. Cryptochrome protein, især, er særligt følsomme over for blåt lys, som skal undgås14.
- For at reducere lyseksponeringen skal du sørge for, at indsamlingsrummet er lyst stramt med eventuelle lyskilder, der er blokeret eller tildækket. Wrap disse hætteglas i folie, således at ZT13 og ZT19 fluer ikke udsættes for lys, når de placeres på møtrikker mixeren i det følgende trin. ZT1- og ZT7-fluer er ikke lysfølsomme og kan placeres på mixeren uden foliebelægning.
7. Nuterende mixer og opbevaring
- Når fluerne er opsamlet, tapes toppen af hætteglassene, der indeholder fiksativer, for at undgå spild, og de sættes på nøddeblanderen ved 165 omdr./min. ved 4 °C i 4 timer. Fluerne er ikke længere lysfølsomme efter dette fikseringstrin, så folien kan fjernes for at kontrollere, at opløsningen bevæger sig, og fluerne nedsænkes i fiksativet.
- Efter fjernelse af flueberende hætteglas fra nøddeblandingen fjernes formaldehyd og vaskes tre gange med 3.000 μL μL μL 1x PBS, og hætteglasset vendes om med hver vask.
- Hætteglas med immunfluorescensprøver opbevares ved 4 °C for at afvente fremtidig immunfluorescens15.
8. Indsamling til proteinekstraktion
- Der klargør fire 50 ml rør og en Dewar indeholdende flydende nitrogen til konservering af prøver til proteinekstraktion
- Ved opsamling af fluer til protein- eller nukleinsyreekstraktion overføres fluer fra flaskerne til røret på samme måde som i trin 6.1, og rørrøret skal hurtigt hættebindes for at forhindre, at fluer frigives, og at røret anbringes i flydende nitrogen for at fastgøre fryse.
9. Opbevaring til proteinekstraktion
- Snap frosne prøver til proteinekstraktion ved -80 °C. Disse kan behandles i henhold til den proteinekstraktionsprotokol, der er relevant for downstream-analyse, herunder immunblotting16.
Representative Results
Kontrolleret døgnrytme med entrainment giver forskerne mulighed for at undersøge biologi på bestemte tidspunkter i hele døgnrytmen ved hjælp af ZT1-ZT19 tidsplaner eller tilføje tid-point efter behov. Her bruger vi lys og mørke til at optræde fluer til døgnrytmen cykler og kontrollere indtrængning ved immunoblotting og immunofluorescens analyse af perioden protein, en markør for døgnrytmen entrainment (Figur 1). Ved korrekt indtrædelse bør periodeproteiner have en karakteristisk intensitet og et mobilitetsmønster (figur 1A) og være synlige på bestemte steder i ZT1-hjernen (Figur 1B). Selv om andre variabler, herunder mad og temperatur, kan påvirke døgnrytmen medrivning, lys er mest enkel og pålidelig til at styre17. Med henblik på disse metoder holdes inkubatortemperaturer konstant, afhængig af cerebrale ur neuroner, der er påvirket af lys til medrivning18.
Figur 1: Kontrol af medrivning. aA) Immunbugning af helcelleekstrakter fremstillet af ledere af inddannede fluer viser kanoniske mønstre for periodeproteinmobilitet ogintensitet 19. 1,4 kvindelige hoveder fra hver af de angivne Zeitgeber gange (ZT) blev analyseret ved hjælp af et anti-Per antistof. (B) Immunofluorescens af inddannede hjerner indsamlet på ZT, hvor periodeproteinet findes i et karakteristisk mønster (bundpaneler, genskabt fra Helfrich-Forster20). Vist er billeder taget fra forskellige dele af hjernen, indfange alle neuroner forventes at indeholde Periode protein på ZT1. Skala bar er 40 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Kr. | Kr. | ZT13 | ZT19 |
| Lys mellem 10:00 - 10:00 | Lys mellem 10:00 - 10:00 | Mørk mellem 9:00 - 21:00 | Mørk mellem 9:00 - 21:00 |
| Indsamlet kl. | Indsamlet kl. | Indsamlet kl. | Indsamlet kl. |
Tabel 1: Tidsplaner for timing af ZT1-ZT19-døgnrytmen.
Discussion
Forskere udnytter denne medrivning protokol med succes og konsistens. Denne procedure gør det muligt at fikse en stor stikprøvepulje, der kan opbevares til fremtidig analyse. Derudover bevarer denne strategi de neurologiske mønstre, der er fremkaldt af indtrædelse til fremtidig undersøgelse.
Fiksering til opbevaring er en vigtig del af medredlingsprocessen, da det hjælper med at stabilisere hjernevæv, og det giver mulighed for mere tid til at analysere hver hjerne fra datapuljen og dermed minimere affald fra hjerner, der mister levedygtighed på grund afalder 21. Det vigtigste mål er at døgnrytmen entrain så mange fluer som muligt, således at der er løbende opgørelse til rådighed for hoveddissektioner og i sidste ende immunfluorescens eller protein ekstraktion til at observere resultaterne og afgøre, om resultaterne er af høj tillid. For at sikre, at døgnrytmen med indtrængning bevares ved fiksering, er det integreret, at enhver kilde til lysforurening elimineres. Fikseringen proces giver mulighed for Drosophila, der skal opbevares og samtidig bevare sin neurologiske "tidsstempel", så de kan dissekeres senere og analyseres uden mærkbare forskelle til fluer, der er dissekeret og har gennemgået immunfluorescens umiddelbart efter medrivning. Med henblik på fiksering før immunfluorescens har laboratoriet med konsistens fastslået, at fluer er levedygtige i mindst op til 1 måned. Fikseringer for vestlig skamplet proteinekstraktion gør hjernen levedygtig på ubestemt tid, når de opbevares ved -80 °C.
Et andet kritisk protokoltrin er fluens sexing. Det er vigtigt, at dette trin gøres præcist som at have begge køn i samme hætteglas før fiksering kan føre til parring, som vil give nye fluer, der er af yngre alder og korrupte protein analyse, hvis hannerne ved et uheld undersøges i stedet for hunner eller vice versa. Derudover, når sexing er det vigtigt at fjerne larver prøver, der er til tider knyttet til hunner. Dette forhindrer udviklingen af nyt afkom inde i det kvindelige hætteglas, der potentielt kan ødelægge resultater.
Det næste trin i tilkundingsprotokollen kan være med elementer, der er relateret til dataanalyse. Fokus for protokollen er protein lokalisering, men hvis der er andre variabler, der er påvirket af døgnrytmen meduddannelse, skal de udforskes gennem nye veje, der ofte kræver protein eller nukleinsyre ekstraktion. Derudover er der andre proteiner i hjernen, der stadig kan analyseres via denne protokol. De eksperimenter, der er forbundet med protokollen analyseret visse proteiner, men listen over gener og proteiner, der spiller en rolle i døgnrytmen biologi er ikke blevet opbrugt. Protokollen er effektiv til at nå målet om at etablere en døgnrytme, men ansøgningerne er vidtrækkende.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Særlig tak til University of Missouri-Kansas City og Jeffrey L. Price laboratorium.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100-1000uL pipette | Eppendorf | ES-1000 | |
| 10-100uL pipette | Eppendorf | ES-100 | |
| 16% Paraformaldehyde Solution | 15710 | ||
| 1X PBS | Caisson Labs | PBL01-6X100ML | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423500 | |
| Anesthesia Filter Connection Kit | World Precision Instruments | EZ-251A | |
| Corn meal | Genesee Scientific | 62-100 | |
| Dried Molasses | Food Service Direct | OT280504 | |
| Droso-filler Food Pump | geneseesci.com | 59-169 | |
| Drosophila Stock bottles, 6 oz square bottom w/ Flugs | geneseesci.com | 32-130BF | |
| Drosophila vials, Narrow K-Resin super bulk | geneseesci.com | 32-118SB | |
| Dry active yeast | Genesee Scientific | 62-103 | |
| Ethanol | IBI Scientific | IB15720 | |
| EZ Basic Anesthesia System | World Precision Instruments | EZ-175 | |
| Falcon Centrifuge tubes | Corning | 352097 | |
| Falcon round bottom tubes | Corning | 352057 | |
| Fine point Sharpie marker | Sharpie | 30001 | |
| Fisherbrand Nutating Mixer | Fisher Scientific | 88-861-043 | |
| Flugs-Narrow Plastic Vials | Genesee Scientific | 49-102 | |
| Glass Thermometer | Cole-Palmer | EW-08008-12 | |
| Liquid nitrogen hose | Thermo Scientific | 398202 | |
| Liquid nitrogen tank-Dewar | Cooper Surgical Inc | 900109-1 | |
| Liquid nitrogen transfer vessel | Electron Mircoscopy Sciences | 61891-02 | |
| Paintbrushes(Red Sable) Size #0 | Electro Microscopy Sciences | 66100-00 | This is used to separate the flies via sex without causing injury. |
| Plastic funnel | Plews and Edelmann | 570-75-062 | |
| Polarizing light microscope | Microscope Central | 1100100402241 | Used to more clearly view Drosophila during sexing |
| ProPette Pipette Tips | MTC Bio Incorporated | P5200-100U | |
| ProPette Pipette Tips | MTC Bio Incorporated | P5200-1M | |
| ProPette Pipette Tips | MTC Bio Incorporated | P5200-5M | |
| Propionic Acid | Sigma Aldrich | P1386-1L | |
| Rayon Balls | Genesee Scientific | 51-100 | |
| Reynolds wrap standard aluminum foil | Staples | 1381273 | |
| Roaster Oven (Crockpot) | Hamilton Beach | 32950 | |
| Scotch 810 Magic Tape | Electron Microscopy Sciences | 77300 | |
| Spray bottle with trigger | US Plastic | 66446 | Used to spray ethanol to clean work bend areas |
| Tegosept | Genesee Scientific | 20-258 | |
| Thermo Scientific Drosophila Incubator | Thermo Scientific | 3990FL | |
| Thermo Scientific Revco 4 degree Lab fridge | ThermoFisher Scientific | REL7504D | |
| Thermo Scientific Revco Lab Freezer | ThermoFisher Scientific | REL7504A | |
| Tween 20 | Anatrace | T1003-1-GA |
References
- Halberg, F. Some physiological and clinical aspects of 24-hour periodicity. The Journal-Lancet. 73 (1), 20-32 (1953).
- Smarr, B. L., Jennings, K. J., Driscoll, J. R., Kriegsfeld, L. J. A time to remember: the role of circadian clocks in learning and memory. Behavioral Neuroscience. 128 (3), 283-303 (2014).
- Leng, Y., Musiek, E. S., Hu, K., Cappuccio, F. P., Yaffe, K. Association between circadian rhythms and neurodegenerative diseases. The Lancet. Neurology. 18 (3), 307-318 (2019).
- Hood, S., Amir, S.
- Sulli, G., Lam, M. T. Y., Panda, S. Interplay between Circadian Clock and Cancer: New Frontiers for Cancer Treatment. Trends in Cancer. 5 (8), 475-494 (2019).
- Zehring, W. A., et al. P-element transformation with period locus DNA restores rhythmicity to mutant, arrhythmic Drosophila melanogaster. Cell. 39 (2 Pt 1), 369-376 (1984).
- Bargiello, T. A., Jackson, F. R., Young, M. W. Restoration of circadian behavioural rhythms by gene transfer in Drosophila. Nature. 312 (5996), 752-754 (1984).
- Siwicki, K. K., Eastman, C., Petersen, G., Rosbash, M., Hall, J. C. Antibodies to the period gene product of Drosophila reveal diverse tissue distribution and rhythmic changes in the visual system. Neuron. 1 (2), 141-150 (1988).
- Hardin, P. E., Hall, J. C., Rosbash, M. Feedback of the Drosophila period gene product on circadian cycling of its messenger RNA levels. Nature. 343 (6258), 536-540 (1990).
- Liu, X., et al. The period gene encodes a predominantly nuclear protein in adult Drosophila. Journal of Neuroscience. 12 (7), 2735-2744 (1992).
- Vosshall, L. B., Price, J. L., Sehgal, A., Saez, L., Young, M. W. Block in nuclear localization of period protein by a second clock mutation, timeless. Science (New York, N.Y). 263 (5153), 1606-1609 (1994).
- Price, J. L., et al. double-time is a novel Drosophila clock gene that regulates period protein accumulation. Cell. 94 (1), 83-95 (1998).
- Hanai, S., Hamasaka, Y., Ishida, N. Circadian entrainment to red light in Drosophila: requirement of Rhodopsin 1 and Rhodopsin 6. Neuroreport. 19 (14), 1441-1444 (2008).
- Vinayak, P., et al. Exquisite light sensitivity of Drosophila melanogaster cryptochrome. PLoS Genetics. 9 (7), e1003615 (2013).
- Kelly, S. M., Elchert, A., Kahl, M. Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains. Journal of Visualized Experiments. (129), e56174 (2017).
- Au-Eslami, A., Au-Lujan, J. Western Blotting: Sample Preparation to Detection. Journal of Visualized Experiments. (44), e2359 (2010).
- Fan, J. Y., Muskus, M. J., Price, J. L. Entrainment of the Drosophila circadian clock: more heat than light. Science's signal Transduction Knowledge Environment. (413), pe65 (2007).
- Miyasako, Y., Umezaki, Y., Tomioka, K. Separate sets of cerebral clock neurons are responsible for light and temperature entrainment of Drosophila circadian locomotor rhythms. Journal of Biological Rhythms. 22 (2), 115-126 (2007).
- Edery, I., Zwiebel, L. J., Dembinska, M. E., Rosbash, M. Temporal phosphorylation of the Drosophila period protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (6), 2260-2264 (1994).
- Helfrich-Forster, C. The neuroarchitecture of the circadian clock in the brain of Drosophila melanogaster. Microscopy Research and Technique. 62 (2), 94-102 (2003).
- Price, J. L. Genetic screens for clock mutants in Drosophila. Methods in Enzymology. 393, 35-60 (2005).
