Summary
Här beskriver vi hur man synkroniserar Drosophila till en dygnsdag. Detta är det första, och viktigaste steget som är nödvändigt för att studera biologiska rytmer och kronobiologi.
Abstract
Nästan universell bland organismer, dygnsrytm samordna biologisk aktivitet till jordens bana runt solen. För att identifiera faktorer som skapar denna rytm och för att förstå de resulterande utgångarna krävs entrainment av modellorganismer till definierade dygnsrytm tidspunkter. Här vi detalj ett förfarande för att entrain många Drosophila till en definierad dygnsrytm. Vidare beskriver vi efter-entrainment steg för att förbereda prover för immunofluorescens, nukleinsyra eller protein extraktion-baserad analys.
Introduction
Nästan alla organismer på jorden, från den största ner till encellig, har en inre biologisk klocka med en cykel på ungefär en dag. Detta är känt som dygnsrytmen (myntades 1953 av Franz Halberg från de latinska termerna circa = ca/ungefärligt och "dör" = dag)1. Även om komponenter i kärnklockan är kända och deras rudimentära funktionsmekanismer konceptualiserade, finns det fortfarande mycket att förstå om hur biologiska rytmer upprätthålls i hela kroppen. Viktigt, misregulation av biologiska rytmer är associerad med dålig hälsa resultat inklusive dålig minnesbildning, sömnstörningar, säsongsbunden sjukdom, depression, bipolär sjukdom, diabetes, fetma, neurodegeneration, och cancer2,3,4,5.
Drosophila är en väletablerad modell för undersökning av dygnsvikarbiologi. Genetiskt och biokemiskt tractable, stort antal är lätt entrained (som kommer att visas). I själva verket, alla sju publikationer som nämns som viktiga publikationer av stöd i tilldelning av Nobelpriset för upptäckten av dygnsrytmen hävstångseffekt dessa styrkor av Drosophila modell6,7,8,9,10,11,12.
Dessutom visar vi effektiva strategier för att samla in entrained flugor för antingen immunofluorescens, nukleinsyra eller proteinutvinning-baserad analys. Med hjälp av dessa strategier kan man bearbeta och lagra större mängder prover för analys i framtiden. Dessa metoder är mycket fördelaktigt i att de är reproducerbara och kan ge hundratals entrained flugor som kan vara en del av en stor data pool.
Protocol
1. Flyga livsmedelsproduktion
- Per varje 1 L vatten, förbereda flugmat bestående av 4,69 g torkad melass, 19,70 g torr aktiv jäst, 87,22 g majsmjöl och 7,83 g agar.
- Kombinera innehållet som anges ovan i en crockpot och vrid värmen till 250 °F. Blanda väl som ingredienser tillsätts.
- Håll locket på crockpot som fluga maten värms samtidigt blanda innehållet var 10 minuter tills den når en rullande koka. Låt rullkokningen fortsätta i 20 min innan värmen stängers av.
- Tillsätt 83,60 mL vatten och håll locket på crockpot av när maten svalnar.
- Blanda och registrera temperaturen på maten var 10 min med en glastermometer. Undvik att låta ett lager av film bosätta sig på toppen av maten.
- När maten har svalnat till 60 °C, tillsätt 10,44 mL Tegosept och 5,51 mL propionssyra per liter vatten tillsatt (se steg 1.1).
- Blanda väl och vrid upp värmen till 60 °C för att förhindra att maten blir för sval.
- Pumpa flugmaten efter behov med hjälp av Droso-fyllmedlet.
- För smala injektionsflaskor, pump 10 mL och för 6 oz square bottom flaskor pump 60 mL.
2. Samla flugor av definierad ålder
- Monitorflaskor av vildtypsflugor som förvaras vid 25 °C i 5–7 dagar tills stora mängder pupa (ca 200 pupa) sitter fast vid flaskans sida. De flaskor som används är 6 oz Drosophila lager flaskor med fyrkantiga bottnar.
- Rensa befintliga vuxna från flaskan. Antingen spets de vuxna i en ny flaska eller placera dem i 70% etanol. Använd den tråkiga änden av en #0 för att driva eventuella återstående vuxna i flugmat. Var noga med att torka av färgpenseln ner med 70% etanol före och efter användning.
- Låt rensade flaskor sitta i 3 dagar i en 25 °C-inkubator för att möjliggöra att nästa generation ska eclose. Dessa flugor kommer att vara mellan 0 och 3 dagar gamla.
3. Flygseparation
- Efter 3 dagar, separera hanar från honor och samla önskat nummer för varje kön för var och en av de fyra tidpunkterna. Flugor kan differentieras efter kön genom att undersöka genitalier; hanar har mörka rundade könsorgan medan honorna har ljusare, mer spetsiga könsorgan. Honorna är också mycket större än hanflugor.
- Använd en CO2 anestesi pad för att effektivt separera flugorna och skilja mellan könen. Flytta flugor med penslar för att undvika att döda dem.
- Samla 100 hanar och 100 honor för varje tidpunkt, med 50 hanar per injektionsflaska och 100 honor per injektionsflaska. Män tenderar att vara mer aggressiva och deras sociala interaktioner leder till en hel del dödsfall när det finns 100 individer i en injektionsflaska. De honor-upp till 100 individer- är opåverkade medan de ingår i injektionsflaskan.
- Utför samlingarna vid följande tidpunkter: ZT1, ZT7, ZT13 och ZT19 (Tabell 1). Observera att samlingar som görs i mörker (ZT12-ZT24) är ljuskänsliga medan ZT0-ZT11-samlingar görs under lampor-på-tider och rumslampor kan vara på. Observera att två separata inkubatorer används med inversa 12 timmars ljusmönster för att möjliggöra att alla samlingar ska ske under dagen och inte över natten.
- Använd överskottsflugor för att skapa nya flaskor flugor för framtida entrainment. Placera 25 honor med 5-7 hanar i varje ny flaska och placera i inkubatorn vid 25 °C.
4. Flyga inkubation
- Låt flugorna stanna i ljusreglerade inkubatorer i 3-5 dagar för att dygnsrytmens entrainment ska kunna ske. Se till att inkubatorer är ljustäta eftersom även små mängder ljusföroreningar kommer att störa entrainment.
5. Immunofluorescensfixering
- Efter entrainment, förbereda nya injektionsflaska med fixeringslösning för prover som kommer att användas för immunofluorescens. Innan flugorna tas bort från inkubatorn, tillsätt 4,8 mL av 4% formaldehyd utspädd i 1x PBS + 0,1% Tween-20 till varje ny smal injektionsflaska för varje 100 flugor som ska fixeras. Varje injektionsflaska kommer att hysa 100 manliga eller 100 kvinnliga Circadian entrained flugor. Placera de smala injektionsflaskaerna i is.
6. Immunofluorescenssamling
- När du samlar flugorna från inkubatorn för immunofluorescens, ta bort flasklocket och invertera flaskan snabbt i tratten. Knacka försiktigt flugorna i lösningen via tratten för att hjälpa till att styra flugorna in i injektionsflaskan; kombinera två rör av de 50 hanarna för totalt 100 hanar i en injektionsflaska och använd ett enda rör med 100 hondjur för den andra injektionsflaskan.
- Utför ZT13 och ZT19 samlingar i mörker; använda ett rött ljus för att se som drosophila är långt mindre känsliga för dessa ljus våglängder och är därför mindre benägna att ljusförorening13. Cryptochrome protein, i synnerhet, är särskilt känslig för blått ljus, som måste undvikas14.
- För att minska ljusexponering, se till att rummet för insamling är lätt tätt med alla ljuskällor blockeras ut eller omfattas. Linda in dessa injektionsflaska i folie så att ZT13- och ZT19-flugor inte utsätts för ljus när de placeras på den nötande mixern i följande steg. ZT1- och ZT7-flugor är inte ljuskänsliga och kan placeras på blandaren utan folietäckning.
7. Nötande mixer och förvaring
- Efter att flugorna har samlats in tejpar du upp överdelen av de injektionsflaska som innehåller fixativ för att undvika spill och placera dem på den nötande mixern vid 165 RPM vid 4 °C i 4 h. Flugorna är inte längre ljuskänsliga efter detta fixeringssteg, så folie kan tas bort för att verifiera att lösningen rör sig och flugor håller på att dränkas i fixativet.
- Efter att ha tagit bort flugan som innehåller injektionsflaska från den nötande mixern avlägsna formaldehyden och tvätta tre gånger med 3 000 μL 1x PBS, inverterande injektionsflaskan med varje tvätt.
- Förvara injektionsflaskan med immunofluorescensprover vid 4 °C för att invänta framtida immunofluorescens15.
8. Samling för proteinutvinning
- Bered fyra 50 mL-rör och en Dewar som innehåller flytande kväve för konservering av prover för proteinutvinning
- För uppsamling av flugor för protein- eller nukleinsyrautvinning, överför flugor från flaskorna till röret på samma sätt som i steg 6.1 och snabbt locket röret för att förhindra utsläpp av flugor och placera röret i flytande kväve för att knäppa frysa.
9. Förvaring för proteinutvinning
- Förvara snap frysta prover för proteinutvinning vid -80 °C. Dessa kan bearbetas enligt det proteinutsugsprotokoll som är lämpligt för nedströmsanalys, inklusive immunoblotting16.
Representative Results
Kontrollerad dygnsrytm entrainment tillåter forskare att undersöka biologi vid specifika tidpunkter under hela dygnsdagen med hjälp av ZT1-ZT19 timing scheman eller att lägga till tid-punkter som behövs. Här använder vi ljus och mörker för att entrain flugor till dygnsrytm cykler och verifiera entrainment genom immunoblotting och immunofluorescens analys av perioden protein, en markör för dygnsrytm entrainment (Figur 1). Vid korrekt entrainment bör periodproteiner ha ett karakteristiskt intensitets- och rörlighetsmönster (Figur 1A) och ska synas på specifika platser i ZT1-hjärnan (Figur 1B). Även om andra variabler, inklusive mat och temperatur, kan påverka dygnsrytmen entrainment, ljus är mest enkel och tillförlitlig att kontrollera17. För syftet med dessa metoder hålls inkubator temperaturer konstant, förlitar sig på cerebral klocka nervceller som påverkas av ljus för entrainment18.
Bild 1: Verifiering av entrainment. (A) Immunoblotting av hela cellextrakt som framställts av huvuden av entrained flugor visar kanoniska mönster av perioden protein rörlighet och intensitet19. 1,4 kvinnliga huvuden från var och en av de angivna Zeitgeber gånger (ZT) analyserades med hjälp av en anti-Per antikropp. (B) Immunofluorescens av entrained hjärnor som samlas vid ZT, där Period proteinet finns i ett karakteristiskt mönster (botten paneler, återskapas från Helfrich-Forster20). Visas är bilder tagna från olika delar av hjärnan, fånga alla nervceller förväntas innehålla Period protein på ZT1. Skala bar är 40 μm. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
| ZT1 | ZT7 | ZT13 | ZT19 |
| Ljus mellan 10 am - 10 pm | Ljus mellan 10 am - 10 pm | Mörkt mellan 9 am - 9 pm | Mörkt mellan 9 am - 9 pm |
| Samlas vid 11 efter 1 timme i ljus | Samlas vid 5 pm efter 7 timmar i ljus | Samlas klockan 10 efter 1 timme i mörker | Samlas in klockan 16 efter 7 timmar i mörker |
Tabell 1: Scheman för tidpunkter för ZT1-ZT19 dygnsrytm.
Discussion
Forskare använder denna entrainment protokoll med framgång och konsekvens. Den här proceduren gör att fixeringen av en stor samplingspool som kan lagras för framtida analys. Dessutom bevarar denna strategi de neurologiska mönster som framkallas genom entrainment för framtida undersökning.
Fixering för lagring är en viktig del av entrainment processen eftersom det hjälper till att stabilisera hjärnvävnad och det möjliggör mer tid att analysera varje hjärna från datapoolen därmed minimera avfall från hjärnor som förlorar livskraft på grund avålder 21. Huvudmålet är att dygnsrytm entrain så många flugor som möjligt så att det finns kontinuerlig inventering tillgängliga för huvudet dissektioner och i slutändan immunofluorescens eller protein extraktion för att observera resultaten och avgöra om resultaten är av högt förtroende. För att säkerställa att dygnsrytm entrainment bevaras genom fixering, är det integrerad att någon källa till ljusföroreningar elimineras. Fixeringsprocessen gör det möjligt för Drosophila att lagras samtidigt som dess neurologiska "tidsstämpel" så att de kan dissekeras senare och analyseras utan märkbara skillnader till flugor som dissekeras och har genomgått immunofluorescens omedelbart efter entrainment. För fixering före immunofluorescence har labbet med överensstämmelse fastställt att flugor är bärkraftiga minst upp till 1 månad. Fixeringar för västra blot protein extraktion gör hjärnan livskraftig på obestämd tid när de lagras vid -80 °C.
Ett annat kritiskt protokollsteg är flugornas könsbestämning. Det är viktigt att detta steg görs exakt som att ha båda könen i samma injektionsflaska före fixering kan leda till parning, vilket kommer att ge nya flugor som är av yngre ålder och korrupt proteinanalys om män av misstag undersöks i stället för honor eller vice versa. Dessutom, när sexing är det viktigt att ta bort larver exemplar som ibland är knutna till honor. Detta förhindrar utvecklingen av ny avkomma inuti den kvinnliga injektionsflaskan som potentiellt kan korrumpera resultat.
Nästa steg för entrainment-protokollet kan vara med objekt som är relaterade till dataanalys. Fokus för protokollet är protein lokalisering, men om det finns andra variabler som påverkas av dygnsrytm entrainment, måste de utforskas genom nya vägar, ofta kräver protein eller nukleinsyra extraktion. Dessutom, Det finns andra proteiner i hjärnan som fortfarande kan analyseras via detta protokoll. Experimenten i samband med protokollet analyserade vissa proteiner, men listan över gener och proteiner som spelar en roll i dygnsrytmbiologi har inte uttömts. Protokollet är effektivt för att uppnå målet att upprätta en dygnsrytm, men tillämpningarna är omfattande.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Särskilt tack till University of Missouri-Kansas City och Jeffrey L. Price laboratoriet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100-1000uL pipette | Eppendorf | ES-1000 | |
| 10-100uL pipette | Eppendorf | ES-100 | |
| 16% Paraformaldehyde Solution | 15710 | ||
| 1X PBS | Caisson Labs | PBL01-6X100ML | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423500 | |
| Anesthesia Filter Connection Kit | World Precision Instruments | EZ-251A | |
| Corn meal | Genesee Scientific | 62-100 | |
| Dried Molasses | Food Service Direct | OT280504 | |
| Droso-filler Food Pump | geneseesci.com | 59-169 | |
| Drosophila Stock bottles, 6 oz square bottom w/ Flugs | geneseesci.com | 32-130BF | |
| Drosophila vials, Narrow K-Resin super bulk | geneseesci.com | 32-118SB | |
| Dry active yeast | Genesee Scientific | 62-103 | |
| Ethanol | IBI Scientific | IB15720 | |
| EZ Basic Anesthesia System | World Precision Instruments | EZ-175 | |
| Falcon Centrifuge tubes | Corning | 352097 | |
| Falcon round bottom tubes | Corning | 352057 | |
| Fine point Sharpie marker | Sharpie | 30001 | |
| Fisherbrand Nutating Mixer | Fisher Scientific | 88-861-043 | |
| Flugs-Narrow Plastic Vials | Genesee Scientific | 49-102 | |
| Glass Thermometer | Cole-Palmer | EW-08008-12 | |
| Liquid nitrogen hose | Thermo Scientific | 398202 | |
| Liquid nitrogen tank-Dewar | Cooper Surgical Inc | 900109-1 | |
| Liquid nitrogen transfer vessel | Electron Mircoscopy Sciences | 61891-02 | |
| Paintbrushes(Red Sable) Size #0 | Electro Microscopy Sciences | 66100-00 | This is used to separate the flies via sex without causing injury. |
| Plastic funnel | Plews and Edelmann | 570-75-062 | |
| Polarizing light microscope | Microscope Central | 1100100402241 | Used to more clearly view Drosophila during sexing |
| ProPette Pipette Tips | MTC Bio Incorporated | P5200-100U | |
| ProPette Pipette Tips | MTC Bio Incorporated | P5200-1M | |
| ProPette Pipette Tips | MTC Bio Incorporated | P5200-5M | |
| Propionic Acid | Sigma Aldrich | P1386-1L | |
| Rayon Balls | Genesee Scientific | 51-100 | |
| Reynolds wrap standard aluminum foil | Staples | 1381273 | |
| Roaster Oven (Crockpot) | Hamilton Beach | 32950 | |
| Scotch 810 Magic Tape | Electron Microscopy Sciences | 77300 | |
| Spray bottle with trigger | US Plastic | 66446 | Used to spray ethanol to clean work bend areas |
| Tegosept | Genesee Scientific | 20-258 | |
| Thermo Scientific Drosophila Incubator | Thermo Scientific | 3990FL | |
| Thermo Scientific Revco 4 degree Lab fridge | ThermoFisher Scientific | REL7504D | |
| Thermo Scientific Revco Lab Freezer | ThermoFisher Scientific | REL7504A | |
| Tween 20 | Anatrace | T1003-1-GA |
References
- Halberg, F. Some physiological and clinical aspects of 24-hour periodicity. The Journal-Lancet. 73 (1), 20-32 (1953).
- Smarr, B. L., Jennings, K. J., Driscoll, J. R., Kriegsfeld, L. J. A time to remember: the role of circadian clocks in learning and memory. Behavioral Neuroscience. 128 (3), 283-303 (2014).
- Leng, Y., Musiek, E. S., Hu, K., Cappuccio, F. P., Yaffe, K. Association between circadian rhythms and neurodegenerative diseases. The Lancet. Neurology. 18 (3), 307-318 (2019).
- Hood, S., Amir, S.
- Sulli, G., Lam, M. T. Y., Panda, S. Interplay between Circadian Clock and Cancer: New Frontiers for Cancer Treatment. Trends in Cancer. 5 (8), 475-494 (2019).
- Zehring, W. A., et al. P-element transformation with period locus DNA restores rhythmicity to mutant, arrhythmic Drosophila melanogaster. Cell. 39 (2 Pt 1), 369-376 (1984).
- Bargiello, T. A., Jackson, F. R., Young, M. W. Restoration of circadian behavioural rhythms by gene transfer in Drosophila. Nature. 312 (5996), 752-754 (1984).
- Siwicki, K. K., Eastman, C., Petersen, G., Rosbash, M., Hall, J. C. Antibodies to the period gene product of Drosophila reveal diverse tissue distribution and rhythmic changes in the visual system. Neuron. 1 (2), 141-150 (1988).
- Hardin, P. E., Hall, J. C., Rosbash, M. Feedback of the Drosophila period gene product on circadian cycling of its messenger RNA levels. Nature. 343 (6258), 536-540 (1990).
- Liu, X., et al. The period gene encodes a predominantly nuclear protein in adult Drosophila. Journal of Neuroscience. 12 (7), 2735-2744 (1992).
- Vosshall, L. B., Price, J. L., Sehgal, A., Saez, L., Young, M. W. Block in nuclear localization of period protein by a second clock mutation, timeless. Science (New York, N.Y). 263 (5153), 1606-1609 (1994).
- Price, J. L., et al. double-time is a novel Drosophila clock gene that regulates period protein accumulation. Cell. 94 (1), 83-95 (1998).
- Hanai, S., Hamasaka, Y., Ishida, N. Circadian entrainment to red light in Drosophila: requirement of Rhodopsin 1 and Rhodopsin 6. Neuroreport. 19 (14), 1441-1444 (2008).
- Vinayak, P., et al. Exquisite light sensitivity of Drosophila melanogaster cryptochrome. PLoS Genetics. 9 (7), e1003615 (2013).
- Kelly, S. M., Elchert, A., Kahl, M. Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains. Journal of Visualized Experiments. (129), e56174 (2017).
- Au-Eslami, A., Au-Lujan, J. Western Blotting: Sample Preparation to Detection. Journal of Visualized Experiments. (44), e2359 (2010).
- Fan, J. Y., Muskus, M. J., Price, J. L. Entrainment of the Drosophila circadian clock: more heat than light. Science's signal Transduction Knowledge Environment. (413), pe65 (2007).
- Miyasako, Y., Umezaki, Y., Tomioka, K. Separate sets of cerebral clock neurons are responsible for light and temperature entrainment of Drosophila circadian locomotor rhythms. Journal of Biological Rhythms. 22 (2), 115-126 (2007).
- Edery, I., Zwiebel, L. J., Dembinska, M. E., Rosbash, M. Temporal phosphorylation of the Drosophila period protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (6), 2260-2264 (1994).
- Helfrich-Forster, C. The neuroarchitecture of the circadian clock in the brain of Drosophila melanogaster. Microscopy Research and Technique. 62 (2), 94-102 (2003).
- Price, J. L. Genetic screens for clock mutants in Drosophila. Methods in Enzymology. 393, 35-60 (2005).
