Summary
여기에서 는 드로소필라를 일주기의 날에 동기화하는 방법을 자세히 설명합니다. 이것은 생물학적 리듬과 연대기생물학을 연구하는 데 필요한 첫 번째, 그리고 가장 중요한 단계입니다.
Abstract
유기체 들 사이에서 거의 보편적인, circadian 리듬 태양 주위 지구의 궤도에 생물학적 활동을 조정. 이 리듬을 만드는 요인을 식별하고 결과 출력을 이해하려면 모델 유기체를 정의 한 circadian 시간 점에 대한 교육이 필요합니다. 여기에서 우리는 정의된 circadian 리듬에 많은 Drosophila를 entrain하는 절차를 자세히 설명합니다. 또한 면역 형광, 핵산 또는 단백질 추출 기반 분석을 위한 샘플을 준비하기 위해 사후 교육 단계를 자세히 설명합니다.
Introduction
지구상의 거의 모든 유기체는 가장 큰 것에서 단 하나 세포까지, 대략 1일의 주기와 가진 내부 생물학 시계가 있습니다. 이것은 Circadian 리듬으로 알려져 있습니다 (라틴어 용어 에서 프란츠 할베르크에 의해 1953 년에 동전 = 약 / 약 및 "죽는다"= 일)1. 코어 클럭의 구성 요소가 알려져 있고 기능의 기초적인 메커니즘이 개념화되었지만 생물학적 리듬이 신체 전체에서 어떻게 유지되는지에 대해 이해해야 할 것이 여전히 많습니다. 중요하게도, 생물학적 리듬의 잘못된 조절은 가난한 기억 형성, 수면 장애, 계절적 영향 장애, 우울증, 양극성 장애, 당뇨병, 비만, 신경변성 및 암2,,3,,4,,5를 포함한 열악한 건강 결과와 관련이있다.
드로소필라는 circadian 생물학의 조사를 위한 잘 확립된 모형입니다. 유전적으로 생화학적으로, 많은 사람들이 쉽게 훈련됩니다 (표시된 바와 같이). 실제로, 모든 일곱 간행물은 circadian 리듬의 발견에 대한 노벨상을 수여에 지원의 주요 간행물으로 인용6,7,78,,99,810,,11,,12.
또한 면역 형광, 핵산 또는 단백질 추출 기반 분석을 목적으로 변형 된 파리를 수집하기위한 효과적인 전략을 보여줍니다. 이러한 전략을 사용하면 향후 분석을 위해 더 많은 양의 샘플을 처리하고 저장할 수 있습니다. 이러한 방법은 재현가능하며 대규모 데이터 풀의 일부가 될 수 있는 수백 개의 훈련된 파리를 생성할 수 있다는 점에서 매우 유리합니다.
Protocol
1. 플라이 식품 생산
- 물 1L당 말린 당밀 4.69g, 건조 활성 효모 19.70g, 옥수수 식사 87.22g, 한고 7.83g으로 구성된 플라이 푸드를 준비하십시오.
- 크록팟에 위에 나열된 내용을 결합하고 열을 250 °F로 돌립니다. 재료가 첨가될 때 섞는다.
- 플라이 푸드가 가열될 때 크록팟에 뚜껑을 두는 동시에 10분마다 내용물들을 섞어 끓인 끓입니다. 열을 끄기 전에 20 분 동안 롤링 끓는 것을 계속하십시오.
- 83.60mL의 물을 넣고 음식이 식을 때 크록팟 뚜껑을 벗어 두십시오.
- 유리 온도계로 10분마다 음식의 온도를 혼합하고 기록합니다. 필름 레이어가 음식 위에 정착하지 않도록 하십시오.
- 음식이 60 °C로 냉각되면, 추가 된 물 리터 당 테고프10.44 mL 및 5.51 mL의 프로피오닉 산을 추가하십시오 (1단계 1.1 참조).
- 잘 섞어서 60°C까지 가열하여 음식이 너무 시원해지는 것을 방지합니다.
- 드로소 필러를 사용하여 필요에 따라 플라이 푸드를 펌핑합니다.
- 좁은 바이알의 경우 10mL 펌프와 6 온스 정사각형 바닥 병 펌프 60 mL.
2. 정의된 연령의 파리 수집
- 대량의 푸파(약 200pupa)가 병의 측면에 부착될 때까지 5-7일 동안 25°C에 저장된 야생형 파리의 모니터 병. 사용된 병은 사각형 바닥이있는 6 온스 Drosophila 재고 병입니다.
- 병에서 기존 성인을 지우기. 성인을 새로운 병에 넣거나 70%의 에탄올에 넣습니다. #0 페인트 브러시의 둔한 끝을 사용하여 남은 성인을 플라이 푸드로 밀어 넣습니다. 사용 전후70%의 에탄올로 페인트 브러시를 닦아야 합니다.
- 클리어드 병이 25°C 인큐베이터에서 3일 동안 앉아 다음 세대가 닫을 수 있도록 허용합니다. 이 파리는 0~3일 사이입니다.
3. 플라이 분리
- 3 일 후, 여성과 남성을 분리하고 네 시간 포인트의 각 성별에 대한 원하는 번호를 수집합니다. 파리는 생식기를 검사하여 섹스로 구별 될 수있다; 남성은 어두운 둥근 생식기를 가지고 반면 여성은 가볍고 뾰족한 생식기를 가지고 있습니다. 암컷은 또한 수컷 파리보다 훨씬 큽습니다.
- CO2 마취 패드를 사용하여 파리를 효과적으로 분리하고 남녀를 구별하십시오. 파리를 페인트 브러시로 이동하여 죽지 않도록 합니다.
- 각 시간 당 100 명의 남성과 100 명의 여성을 수집하며, 바이알 당 50 명의 남성과 바이알 당 100 명의 여성을 수집합니다. 남성은 더 공격적인 경향이 있고 그들의 사회적인 상호 작용은 유리병에 있는 100명의 개별이 있을 때 많은 죽음으로 이끌어 냅니다. 100 명의 개인까지 의 여성은 유리병에 포함되어있는 동안 영향을받지 않습니다.
- ZT1, ZT7, ZT13 및 ZT19(표1)와같은 시점에서 컬렉션을 수행합니다. 어두운 색으로 수행되는 컬렉션(ZT12-ZT24)은 가볍고 민감하지만 ZT0-ZT11 컬렉션은 조명 켜기 시간 동안 수행되며 실내 조명이 켜질 수 있습니다. 두 개의 별도 인큐베이터는 12시간 동안 사용되며, 모든 컬렉션은 하룻밤 사이에 발생하지 않습니다.
- 초과 파리를 사용하여 미래의 훈련을 위해 새로운 파리 병을 만듭니다. 각 새로운 병에 5-7 수컷을 가진 25명의 암컷을 놓고 25°C의 인큐베이터에 놓습니다.
4. 플라이 인큐베이션
- 파리가 3-5일 동안 가벼운 조절 인큐베이터에 머물도록 하여 circadian 의 연동이 발생할 수 있도록 하십시오. 소량의 빛 공해조차도 방해가 되기 때문에 인큐베이터가 가볍도록 단단하게 유지하십시오.
5. 면역형광 고정
- entrainment 후 면역 형광에 사용되는 샘플을 위한 고정 솔루션의 새로운 바이알을 준비하십시오. 인큐베이터에서 파리를 제거하기 전에, 고정될 100개의 파리마다 각각의 새로운 좁은 유리병에 1x PBS + 0.1% Tween-20에 희석된 4%의 포름알데히드4%를 4.8mL로 추가합니다. 각 병병은 100 명의 남성 또는 100 개의 암컷 Circadian 인훈련 된 파리를 수용합니다. 좁은 바이알을 얼음에 놓습니다.
6. 면역 형광 수집
- 면역 불면을 위해 인큐베이터에서 파리를 수집할 때 병 뚜껑을 제거하고 병을 깔때기로 빠르게 반전시면 됩니다. 파리를 깔때기를 통해 용액에 부드럽게 탭하여 파리를 유리병으로 안내합니다. 50명의 수컷의 튜브 2개를 한 병부에서 총 100명의 남성으로 결합하고 다른 유리병에 100명의 암컷의 단일 튜브를 사용합니다.
- 어둠 속에서 ZT13 및 ZT19 컬렉션을 수행합니다. drosophila가 이 광파장에 훨씬 덜 민감하고 따라서 빛 공해에 덜 경향이 있다 으로 보기 위하여 빨간 빛을 사용 하 여13. 특히 크립토크롬 단백질은특히 14를피해야 하는 청색광에 민감하다.
- 광 노출을 줄이기 위해 조명이 차단되었거나 덮여 있는 모든 광원으로 수집실이 가볍게 고정되어 있는지 확인합니다. ZT13 및 ZT19 파리가 다음 단계에서 누이 믹서에 배치할 때 빛에 노출되지 않도록 호일로 이 바이알을 싸서 싸서. ZT1 및 ZT7 파리는 빛에 민감하지 않으며 호일 덮개없이 믹서에 배치 할 수 있습니다.
7. 누티팅 믹서 및 보관
- 파리가 수집된 후, 유출을 피하기 위해 고정을 포함하는 바이알의 상단을 테이프로 붙이고 4 시간 동안 4 °C에서 165 RPM에서 누두 믹서에 놓습니다. 파리는 이 고정 단계 후에 더 이상 빛에 민감하지 않으므로 호일을 제거하여 솔루션이 이동하고 파리가 고정물에 잠겨 있는지 확인할 수 있습니다.
- 누시믹서에서 바이알을 함유한 파리를 제거한 후 포름알데히드를 제거하고 1x PBS의 3,000 μL로 세 번 세척하여 각 세척시 유리병을 반전시다.
- 면역형광시료를 베어링바이알을 4°C에 저장하여 향후면역형광(15)을기다린다.
8. 단백질 추출을 위한 컬렉션
- 단백질 추출을 위한 견본의 보존을 위한 4개의 50mL 관 및 액체 질소를 포함하는 Dewar를 준비합니다
- 단백질 또는 핵산 추출을 위해 파리를 수집하기 위해, 6.1 단계와 동일한 방식으로 병에서 튜브로 파리를 옮기고 신속하게 튜브를 캡하여 파리의 방출을 방지하고 튜브를 액체 질소로 배치하여 동결합니다.
9. 단백질 추출을 위한 저장
- -80°C에서 단백질 추출을 위해 스냅 냉동 샘플을 저장합니다. 이들은면역blotting(16)을포함하여 다운스트림 분석에 적합한 단백질 추출 프로토콜에 따라 처리될 수 있다.
Representative Results
제어 된 circadian entrainment 는 연구원이 ZT1-ZT19 타이밍 일정을 사용하여 circadian 일 내내 특정 시점에서 생물학을 검사하거나 필요에 따라 시간 점을 추가 할 수 있습니다. 여기서는 빛과 어둠을 사용하여 파리를 일주기로 훈련시키고 기간 단백질의 면역 블로팅 및 면역 형광 분석에 의한 자극을 검증하며, 일주기 에 대한마커(도 1). 정확한 내분시, 기간 단백질은 특징적인 강도 및 이동성패턴(도 1A)을가져야 하며 ZT1 뇌의 특정 위치에서 볼 수 있어야 한다(도1B). 음식과 온도를 포함한 다른 변수는 circadian 의 감기에 영향을 미칠 수 있지만 빛은17을제어하는 것이 가장 간단하고 신뢰할 수 있습니다. 이러한 방법의 목적을 위해, 인큐베이터 온도는 지속적으로 유지되며,18에대한 빛에 의해 영향을 받는 대뇌 시계 뉴런에 의존한다.
그림 1: 훈련 확인. (A)훈련된 파리의 머리로부터 제조된 전세포 추출물의 면역블로팅은 기간 단백질 이동성 및강도(19)의정수 패턴을 나타낸다. 1.4 각 기질회(ZT)로부터의 암컷 헤드는 항체별 항체를 사용하여 분석하였다. (B)ZT에서 수집된 훈련된 뇌의 면역불률은, 여기서 기간 단백질은 특징적인 패턴에서 발견된다(하단 패널, 헬프리히 포스터20에서재현). ZT1에서 기간 단백질을 포함 할 것으로 예상되는 모든 뉴런을 캡처, 뇌의 다른 섹션에서 찍은 이미지입니다. 스케일 바는 40 μm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| ZT1 | ZT7 | ZT13 | ZT19 |
| 오전 10시~오후 10시 사이 빛 | 오전 10시~오후 10시 사이 빛 | 오전 9시 ~오후 9시 사이에 어두운 | 오전 9시 ~오후 9시 사이에 어두운 |
| 1시간 후 오전 11시에 수집 | 7시간 후 오후 5시에 수집 | 어둠 속에서 1 시간 후 오전 10시에 수집 | 어둠 속에서 7 시간 후 오후 4시에 수집 |
표 1: ZT1-ZT19 Circadian 리듬 타이밍 일정.
Discussion
연구원은 성공과 일관성이 entrainment 프로토콜을 활용. 이 절차를 사용하면 향후 분석을 위해 저장할 수 있는 큰 샘플링 풀을 고정할 수 있습니다. 또한,이 전략은 향후 검사를 위한 훈련으로 유도된 신경학적 패턴을 보존합니다.
저장을 위한 고정은 뇌 조직을 안정화하는 데 도움이 되므로 훈련 과정의 주요 구성 요소이며,21세로인해 생존력을 상실한 뇌의 폐기물을 최소화하는 데이터 풀에서 각 뇌를 분석하는 데 더 많은 시간을 할애할 수 있다. 주요 목표는 가능한 한 많은 파리를 순환하여 머리 해부에 사용할 수 있는 지속적인 재고가 있고 궁극적으로 면역 형광 또는 단백질 추출을 통해 연구 결과를 관찰하고 결과가 높은 신뢰인지 확인하는 것입니다. circadian entraination 고정을 통해 보존 되도록, 빛 공해의 모든 소스를 제거 하는 것이 필수적이다. 고정 과정은 Drosophila가 나중에 해부되고 절단 직후 면역 형광을 겪은 파리에 눈에 띄는 차이없이 분석 할 수 있도록 신경학적 "타임 스탬프"를 유지하면서 저장 할 수 있습니다. 면역 형광 이전에 고정의 목적을 위해, 실험실은 파리가 적어도 1 달까지 실행 가능한 일관성으로 결정했습니다. 서부 블롯 단백질 추출을 위한 고정은 -80°C에 저장될 때 뇌를 무기한으로 실행 가능하게 만듭니다.
또 다른 중요한 프로토콜 단계는 파리의 섹스입니다. 이 단계는 고정하기 전에 동일한 유리병에 남녀를 갖는 것으로 정확하게 수행되는 것이 중요합니다 짝짓기로 이어질 수 있습니다, 이는 남성이 실수로 여성 또는 그 반대의 경우도 마찬가지인 경우 젊은 나이와 부패한 단백질 분석의 새로운 파리를 산출합니다. 또한, 섹스 할 때 여성에 부착 된 시간에 애벌레 표본을 제거하는 것이 중요합니다. 이것은 잠재적으로 결과를 손상시킬 수 있는 여성 병병 안쪽에 새로운 자손의 발달을 방지합니다.
entrainment 프로토콜의 다음 단계는 데이터 분석과 관련된 항목일 수 있습니다. 프로토콜의 초점은 단백질 현지화입니다, 그러나 circadian entrainment에 의해 영향을 받는 그밖 변수가 있는 경우에, 수시로 단백질 또는 핵산 추출을 요구하는 새로운 도로를 통해 탐구되어야 합니다. 추가적으로, 아직도 이 프로토콜을 통해 분석될 수 있는 두뇌의 그밖 단백질이 있습니다. 프로토콜과 관련되었던 실험은 특정 단백질을 분석했습니다 그러나 circadian 생물학에 있는 역할을 하는 유전자와 단백질의 목록은 소진되지 않았습니다. 이 프로토콜은 circadian 리듬을 확립하는 목표를 달성하는 데 효과적이지만 응용 프로그램은 광범위합니다.
Disclosures
없음.
Acknowledgments
미주리 -캔자스 시티 대학과 제프리 L. 가격 연구소에 특별한 감사.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100-1000uL pipette | Eppendorf | ES-1000 | |
| 10-100uL pipette | Eppendorf | ES-100 | |
| 16% Paraformaldehyde Solution | 15710 | ||
| 1X PBS | Caisson Labs | PBL01-6X100ML | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423500 | |
| Anesthesia Filter Connection Kit | World Precision Instruments | EZ-251A | |
| Corn meal | Genesee Scientific | 62-100 | |
| Dried Molasses | Food Service Direct | OT280504 | |
| Droso-filler Food Pump | geneseesci.com | 59-169 | |
| Drosophila Stock bottles, 6 oz square bottom w/ Flugs | geneseesci.com | 32-130BF | |
| Drosophila vials, Narrow K-Resin super bulk | geneseesci.com | 32-118SB | |
| Dry active yeast | Genesee Scientific | 62-103 | |
| Ethanol | IBI Scientific | IB15720 | |
| EZ Basic Anesthesia System | World Precision Instruments | EZ-175 | |
| Falcon Centrifuge tubes | Corning | 352097 | |
| Falcon round bottom tubes | Corning | 352057 | |
| Fine point Sharpie marker | Sharpie | 30001 | |
| Fisherbrand Nutating Mixer | Fisher Scientific | 88-861-043 | |
| Flugs-Narrow Plastic Vials | Genesee Scientific | 49-102 | |
| Glass Thermometer | Cole-Palmer | EW-08008-12 | |
| Liquid nitrogen hose | Thermo Scientific | 398202 | |
| Liquid nitrogen tank-Dewar | Cooper Surgical Inc | 900109-1 | |
| Liquid nitrogen transfer vessel | Electron Mircoscopy Sciences | 61891-02 | |
| Paintbrushes(Red Sable) Size #0 | Electro Microscopy Sciences | 66100-00 | This is used to separate the flies via sex without causing injury. |
| Plastic funnel | Plews and Edelmann | 570-75-062 | |
| Polarizing light microscope | Microscope Central | 1100100402241 | Used to more clearly view Drosophila during sexing |
| ProPette Pipette Tips | MTC Bio Incorporated | P5200-100U | |
| ProPette Pipette Tips | MTC Bio Incorporated | P5200-1M | |
| ProPette Pipette Tips | MTC Bio Incorporated | P5200-5M | |
| Propionic Acid | Sigma Aldrich | P1386-1L | |
| Rayon Balls | Genesee Scientific | 51-100 | |
| Reynolds wrap standard aluminum foil | Staples | 1381273 | |
| Roaster Oven (Crockpot) | Hamilton Beach | 32950 | |
| Scotch 810 Magic Tape | Electron Microscopy Sciences | 77300 | |
| Spray bottle with trigger | US Plastic | 66446 | Used to spray ethanol to clean work bend areas |
| Tegosept | Genesee Scientific | 20-258 | |
| Thermo Scientific Drosophila Incubator | Thermo Scientific | 3990FL | |
| Thermo Scientific Revco 4 degree Lab fridge | ThermoFisher Scientific | REL7504D | |
| Thermo Scientific Revco Lab Freezer | ThermoFisher Scientific | REL7504A | |
| Tween 20 | Anatrace | T1003-1-GA |
References
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