Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Overvåget maskinlæring til semi-kvantificering af ekstracellulær DNA i glomerulonefritis

Published: June 18, 2020 doi: 10.3791/61180
Automatic Translation
1, 2, 1, 1,3
1Department of Medicine, Monash University, 2Monash Micro Imaging, Monash University, 3Immunology Department, Monash Health

Summary

Ekstracellulært DNA (ecDNA), der frigives under celledød, er proinflammatorisk og bidrager til inflammation. Måling af ecDNA på skadesstedet kan bestemme effekten af terapeutisk behandling i målorganet. Denne protokol beskriver brugen af et maskinlæringsværktøj til at automatisere måling af ecDNA i nyrevæv.

Abstract

Glomerular celledød er et patologisk træk ved myeloperoxidase anti neutrofile cytoplasmatiske antistof associeret vaskulitis (MPO-AAV). Ekstracellulær deoxyribonucleic syre (ecDNA) frigives under forskellige former for celledød, herunder apoptose, nekrose, nekroptose, neutrofile ekstracellulære fælder (NETs) og pyropose. Måling af denne celledød er tidskrævende med flere forskellige biomarkører, der kræves for at identificere de forskellige biokemiske former for celledød. Måling af ecDNA udføres generelt i serum og urin som et surrogat for nyreskader, ikke i det faktiske målorgan, hvor den patologiske skade opstår. Den nuværende vanskelighed ved at undersøge ecDNA i nyrerne er manglen på metoder til formalin fast paraffin indlejret væv (FFPE) både eksperimentelt og i arkiverede humane nyre biopsier. Denne protokol indeholder en oversigt over de trin, der kræves for at plette for ecDNA i FFPE væv (både human og murine), slukke autofluorescens og måle ecDNA i de resulterende billeder ved hjælp af en maskine læring værktøj fra den offentligt tilgængelige open source ImageJ plugin trainable Weka segmentering. Trainable Weka segmentering anvendes til ecDNA inden for glomeruli, hvor programmet lærer at klassificere ecDNA. Denne klassificering anvendes på efterfølgende erhvervede nyrebilleder, hvilket reducerer behovet for manuelle anmærkninger af hvert enkelt billede. Tilpasningsevnen af den trainable Weka segmentering er påvist yderligere i nyrevæv fra eksperimentelle murine anti-MPO glomerulonefritis (GN), at identificere NETs og ecMPO, fælles patologiske bidragydere til anti-MPO GN. Denne metode giver objektiv analyse af ecDNA i nyrevæv, der klart viser effekten, hvor den trainable Weka segmentering program kan skelne ecDNA mellem sunde normale nyrevæv og syge nyrevæv. Denne protokol kan nemt tilpasses til at identificere ecDNA, NETs og ecMPO i andre organer.

Introduction

Myeloperoxidase anti neutrophil cytoplasmatisk antistof associeret vaskulitis (MPO-AAV) er en autoimmun sygdom, der resulterer i nyresvigt fra patologisk glomerular skade med betydelig celledød og frigivelse af deoxyribonucleic syre (DNA)1,2. DNA kan aktivere immunsystemet ved at fungere som et faresignal. Under normale sunde forhold, den nukleare placering af DNA giver beskyttelse mod eksponering for immunsystemet. Selv-DNA, der frigives ekstracellulær under enten patogene processer eller autoimmunitet ses af immunsystemet som en potent proinflammatoriske skader forbundet molekylær selvprotein (DAMP)3. Ekstra cellulære DNA (ecDNA) frigives fra døende celler gennem flere forskellige mekanismer, der er omfattet af forskellige biokemiske veje, såsom apoptose, nekroptose neutrofile ekstracellulære fælde dannelse (NETs), nekrose eller pyroptose4,,5,,6,7,8.

Vi beskriver heri metoder til plet og måle ecDNA frigivet fra døende celler i dele af formalin fast paraffin indlejret (FFPE) nyrer fra eksperimentelle anti-MPO GN og nyre biopsier fra patienter med MPO-AAV9,10. Der findes flere metoder til påvisning af cirkulerende dobbeltstrenget DNA (dsDNA) og DNA-komplekser fra både serum og urin og fra in vitro-analyser11,12. Disse metoder, selv om nøjagtige ved bestemmelse af mængden af ecDNA, ikke bestemme, hvor ecDNA frigives anatomisk. Der findes metoder, der beskriver specifik måling af ecDNA,13,14f.eks. Der er ingen metode, der beskriver måling ecDNA kulminerede fra alle former for celledød i FFPE nyrer, hvor de patologiske skader opstår. Dette er vigtigt for at afgøre, om eksperimentelle terapeutiske behandlinger rydder ecDNA fra steder af patologisk skade i det faktiske målorgan.

Erhvervelsen af flere billeder fra nyreprøver skaber en stor mængde data, der analyseres almindeligt af en enkelt bruger. Dette er arbejdskrævende, tidskrævende og kan være underlagt upålidelig reproducerbarhed af andre brugere, på grund af brugerenbias. Trainable Weka segmentering er en open source software plugin til ImageJ, der bruger banebrydende bioinformatik værktøjer til at klassificere pixels ved hjælp af machine learning algoritmer15,16. Denne metode er "trainable", hvorved den lærer af brugerens klassificering af segmenter af pixels og anvender den nye lært klassificering til andre billeder. Denne metode er baseret på fælles analyseværktøjer i ImageJ-programmet, der bruges til at "klassificere" hver pixel i et segment som tilhørende en bestemt "klasse". Når programmet lærer "klassificeringer", kan de bruges til at identificere andre lignende klassificerede segmenter inden for samme billede. Denne model gemmes og anvendes derefter på andre sæt billeder i det samme eksperiment.

Nuværende hindringer for bestemmelse ecDNA in situ i nyre sektioner er den endogene autofluorescens fra fiksering i formalin og arbejdskrævende analyse af billederne. Vi beskriver her, hvordan du slukker denne autofluorescens, registrerer ecDNA og bruger overvåget maskinlæring til måling af høj gennemløb af ecDNA. Vi har tidligere offentliggjort måling af NETs og ekstracellulære MPO (ecMPO) ved hjælp af en makro i ImageJ, vi nu demonstrere semi automatisering af disse metoder ved hjælp af overvåget machine learning1. Vi demonstrerer maskinlæringsværktøjets tilpasningsevne for at klassificere en alternativ plet til NET'er og ecMPO i det samme billede. Disse farvning metoder, der er beskrevet her for at opdage ecDNA, NETs og ecMPO kan oversættes til andre faste organer og sygdomme, hvor ecDNA, NETS og ecMPO spiller en rolle i at fastholde sygdomme som leddegigt og lupus17,18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne metode gør det muligt påvisning af pan ecDNA fra alle former for celledød. Den samme metode og antistoffer anvendes til humannyrebiopsivæv (fra trin 4). Alle dyre-og mennesker havde Etik godkendelse fra Monash University, og Monash Health, Clayton, Victoria, Australien.

1. Farvning for ecDNA med DAPI og β-Actin

  1. Fremkald en 20 dages model af anti-myeloperoxidase glomerulonefritis (anti-MPO-GN) i 8-10 uger gamle C57/Bl6 mus, med kontrol9.
    1. Aflivet mus humant ved hjælp af et CO2 kammer.
    2. Fjern nyrer ved at gøre en forreste midterlinjen snit gennem huden med en saks, og derefter forsigtigt skære bughinden og pin tilbage på en dissektion bord. Brug pincet skubbe til side den forreste nyre fascia og parietal bughinde og skære nyrerne fri ved at skære ureter og blodkar (nyrearteri og vene) på nyrebækkenet. Fjern med pincet og skære nyrer i halve (sagittal plan) med en størrelse 22 skalpel.
    3. Placer nyre i fiksativ (4% buffered formalin) i 16 timer ved stuetemperatur (RT). Fjern og sættetid fast nyre i 30% ethanol i 24 timer før forarbejdning.
  2. Behandl nyrer ved hjælp af en standard 6-timers cyklus:
    70% ethanol i 15 min.
    90% ethanol i 15 min.
    100% ethanol i 15 min.
    100% ethanol i 20 min
    100% ethanol i 25 min.
    100% ethanol i 30 min
    Xylen i 20 min.
    Xylen i 30 min.
    Xylen i 40 min.
    Voks i 30 min
    Voks i 35 min
    Voks i 40 min
    BEMÆRK: Dette er vigtigt, da nyrer ikke bør udsættes for langvarig udsættelse for varme i voks, da det kan ødelægge antigener af interesse.
  3. Skær 3 μm sektioner på en mikrotom og montere på kommercielt tilgængelige glas mikroskop dias belagt med en positiv ladning. Lad det tørre natten over.
  4. Sæt glas dias i en slide rack i en 60 °C ovn i 60 min.
    BEMÆRK: Trin 1.3 og 1.4 er afgørende for at sikre, at sektioner ikke flyder af under antigenudtagningstrinnet.
  5. Nedsænk objektglas i to opløsningsmiddelskift (xylen eller erstatning) i 40 min hver i en røghætte.
  6. Rehydrer dias i 100% ethanol, 100% ethanol, 70% ethanol i 5 min hver. Vask i 5 minutter i postevand.
  7. Anbring en varmeplade i en røghætte og forboril antigengenhentningsopløsning (10 mM Tris, 1 mM EDTA pH 9.0) i en trykkoger. Så snart antigengengengengengengengengengengengengen opløsning begynder at koge, placere dias i gryden vandret ved hjælp af et par tang og låse låget. Der koges højt (svarende til 15 psi eller 103 kPa) i 10 min.
    BEMÆRK: Dette trin er afgørende, da det henter det antigen af interesse ved at afsløre antigen epitop (kryds forbundet via formalin fiksering) for at tillade epitop antistof specifik binding den efterfølgende farvning vil ikke fungere uden.
  8. Fjern trykkogeren fra varmen og fjern straks låget ved at køre kold hane oven på låget i en vask. Der skal være ækvivalensglas i 20 minutter i antigenhentningsopløsningen.
  9. Rutsjebaner til 5 min i 0,01 M fosfatbuffered saltvand (PBS) (pH 7.4) på en orbital shaker.
  10. Brug en hydrofob pen til at tegne cirkler omkring nyrevævet og passe på ikke at lade noget væv tørre ud i denne tid.
  11. Blokvæv i 10 % kyllingesera i 5 % kvægserumalbumin (BSA)/PBS (pH 7,4, 0,01 M) i 30 min., 60 μL pr. sektion. Efter dette trin må du ikke vaske det, men forsigtigt fjerne blokeringsopløsningen med en 60 μL pipette, og delene må ikke tørres ud.
  12. Der påføres primær antistofcocktail for β-actin fortyndet 1/1000 i 1% BSA/PBS (pH 7,4, 0,01 M), 60 μL pr. sektion og inkuberes natten over i et fugtighedskammer ved 4 °C.
  13. Vask slides to gange i 5 min i PBS (pH 7,4, 0,01 M) på en orbital shaker.
  14. Påfør sekundært antistof, kylling anti kanin 488 (1/200), 60 μL pr sektion fortyndet i 1%BSA/PBS (pH 7.4, 0.01 M) for 40 min ved RT.
  15. Diasene vaskes to gange i 5 minutter i PBS (pH 7,4, 0,01 M) på en orbital shaker.
  16. Fordyb dias i 0,3% Sudan Black i 70% ethanol i 30 min i en Coplin krukke.
    BEMÆRK: Dette trin er vigtigt, da det slukker autofluorescence forårsaget af formalin fiksering.
  17. Rutsjebanerne vaskes i postevand for at fjerne bundfaldet og nedsænkes derefter i PBS (pH 7,4, 0,01 M) i 10 minutter for at forhindre yderligere sudanesort bundfald i at danne.
  18. Monter objektglas på konfokale glasovertræksskæbler ved hjælp af tre 60 μL dråber monteringsopløsning med DAPI, og dækslerne forsegles med neglelak ved at anvende omkredsen af dækslet.
  19. Lad objektglasrene hærde i 24 timer ved RT (så DAPI kan trænge ind) og opbevares derefter ved 4 °C beskyttet mod lys.
    BEMÆRK: Vigtigt at holde i mørke for at forhindre falmning af fluorescerende sonder.
  20. Billeddias ved hjælp af et konfokalt laserscanningshoved, der er fastgjort til et mikroskop. Excite dias med 405 laser til DAPI og 488 Laser for Beta Actin. Optag billeder af enkeltplan 1024 x1024 pixel ved hjælp af linjestætning og 4-linjers gennemsnit, hvilket er afgørende for at registrere ecDNA. 40x 1,0 NA olie mål anvendes.
    1. Billede mindst 20 glomeruli pr prøve. Gem billeder som ND2-filer.

2. DAPI og β-Actin-analyse

  1. Installer ImageJ: https://imagej.net/Fiji/Downloads.
  2. Kontroller, at den trainable Weka segmentering er tilgængelig under Plugins | Segmentering | Trainable Weka Segmentering.
  3. Slip billedet på ImageJ-værktøjslinjen. Klik på Billede | Farve | Opdelte kanaler. Et billede med DAPI i blå farvning alle kerner vises og 1 billede med β-actin i grøn vises, som afgrænser glomeruli.
    1. Opret en flettet fil med de enkelte billeder for at tegne et interesseområde (ROI) for glomerulus ved at klikke på Farve | Flet kanaler. En pop-up-boks vil bede om at tildele en farve til hver kanal. Når du har tildelt hver kanal en farve, skal du markere feltet Opret sammensat og feltet Bevar kildebilleder og klikke på Ok. Der vises et flettet sammensat billede.
    2. Brug β-actin farvning som en guide, tegne et investeringsafkast omkring glomerular tot. Hold dette billede til side for at bruge investeringsafkastet i slutningen af denne protokol.
  4. Udfør en gaussisk sløring på det enkelte blå DAPI-billede. Klik på Proces | Filtre | Gaussisk Blur, sat i 1-2,00. Billedet vil nu se lidt sløret ud, men kerner er nu glatte og baggrund blødgjort.
    BEMÆRK: Dette trin er præfabrikeret for at fjerne støj for at rydde op i billedet fra artefakter, der kan forhindre relevant påvisning af billedattributter, der skal analyseres.
  5. Klik på Plugins | Segmentering | Trainable Weka Segmentering.
  6. Brug linjeværktøjet på værktøjslinjen i ImageJ til at spore de intakte kerner ved hjælp af det frie håndværktøj (der er linje-, cirkulære og firkantede værktøjsindstillinger at vælge imellem) og føj derefter til Tilføj klasse 1-boks.
  7. Brug af linjeværktøjet på værktøjslinjen i ImageJ afgrænse områder af baggrunden til klasse 2 boks.
  8. Klik på knappen Opret ny klasse i Weka-segmenteringsvinduet og etiketten "ecDNA". Brug linjeværktøjet (fra ImageJ-værktøjslinjen) til at afgrænse ekstranukleart DNA, der er farvet af DAPI.
  9. Klik på knappen Togklasseifier i træningsmenuen i det trærbare Weka-segmenteringsvindue.
    BEMÆRK: STOP-knappen vises i stedet for knappen Togklasse og forbliver, indtil træningen er færdig. Klik ikke på denne knap under træningen, da processen vil blive afbrudt.
  10. Klik på Knappen Opret resultat for at oprette et billede med alle de klassificerede komponenter, der består af intakte kerner, baggrunden og identificeret ecDNA.
  11. Klik på knappen Hent sandsynlighed. Slå musen til for at give et sort-hvidt billede af alle klasserne med markeringsobjektet fremhævet med hvidt.
  12. Duplikere dette billede ved at klikke på Billede | Duplikere.
  13. Skift til skærmen ved hjælp af den museknap, der indeholder ecDNA. Anvend en tærskel for kun at få det, der er blevet identificeret som ecDNA. Klik på Anvend, når tærsklen er tilstrækkelig.
  14. Hvis der efter tærskelværdi, er der flere områder af DNA, der ikke ecDNA, vende tilbage til den oprindelige uddannede billede, tilføje flere klassificeringer, og gentag trin 2.1-2.13.
  15. Klik på Billede | Billedjustering | Gør binær. Kopier det glomerulære INVESTERINGSAFKAST, der er foretaget i trin 2.3, og klik på Ctrl+Skift+E. Aktivere Weka-vinduet ved at redigere | Valg | Gendan, som gendanner markeringen. Klik analysere partikler, som vil måle kun ecDNA partikler i glomerulus.
    BEMÆRK: Et resultatark beregnes med antallet af partikler, området, gennemsnitspixel og procentdelen af glomerulus, der indeholder ecDNA. Disse resultater kan eksporteres til et regneark og gemmes til senere statistisk analyse.
  16. Gem klassificeringen som ecDNA.classifier ved at klikke på Gem klassificering fra indstillingsmenuen i ImageJ-appen på skrivebordet. Klik derefter på Gem data i indstillingsmenuen, og gem som ecDNA.arff i mappen ImageJ. Investeringsafkastet skal manuelt tilføjes hver gang som glomerulus størrelse og form vil ændre sig, men programmet har lært, hvad ecDNA er.
  17. Hvis du vil anvende modellen på efterfølgende billeder igen, skal du gentage trin 2.1-2.5 med et nyt billede. Klik på Indlæs klassificering i indstillingsmenuen og derefter ecDNAmodel.classifier i mappen ImageJ fra trin 2.16. Logmenuen vil poppe op og køre modellen.
  18. Når modellen er kørt, skal du klikke på Indlæs data i indstillingsmenuen og vælge filen ecDNA.arff, der er gemt i mappen ImageJ fra trin 2.16. Klik på Opret resultat. Hvis det resulterende billede har undladt at afhente alle de kerner, baggrund eller ecDNA klik på re-tog klassificering og tilføje flere klassificeringer og gemme den nye model. Fuldfør analyseprocessen ved at gentage trin 2.9-2.16.
    BEMÆRK: Flere billeder kan bruges til at generere den endelige model, der anvendes til at opdage ecDNA. Dette opnås ved at anvende modellen på efterfølgende billeder, tilføje flere klassificeringer og gemme den nye model og data i Mappen ImageJ. Dette kan især være vigtigt, når forskellige prøver har højere baggrund. Weka Segmentering programmet er også kompatibel med ImageJ makro sprog, som gør det muligt for mange af de kommandoer, der skal makro skrivbare at automatisere nogle af trinene.

3. Måling af neutrofile ekstracellulære fælder og ecMPO

BEMÆRK: Denne metode identificerer NETs ved colocalization af ekstracellulær DNA, Citrullinated Histones peptidyl arginase 4 (PAD4) og MPO.

  1. Fremkald en 20 dages model af anti-myeloperoxidase glomerulonefritis (anti-MPO-GN) i 8-10 uger gamle C57/Bl6 mus, med kontrol9.
    1. Aflivet mus humant ved hjælp af et CO2 kammer.
    2. Fjern nyrer ved at gøre en forreste midterlinjen snit gennem huden med en saks, og derefter forsigtigt skære bughinden og pin tilbage på en dissektion bord. Brug pincet skubbe til side den forreste nyre fascia og parietal bughinde og skære nyrerne fri ved at skære ureter og blodkar (nyrearteri og vene) på nyrebækkenet. Fjern med pincet og skære nyrer i halve (sagittal plan) med en størrelse 22 skalpel.
    3. Placer nyre i fiksativ (4% buffered formalin) i 16 timer ved stuetemperatur (RT). Fjern og sættetid fast nyre i 30% ethanol i 24 timer før forarbejdning.
  2. Behandl nyrer ved hjælp af en standard 6-timers cyklus:
    70% ethanol i 15 min.
    90% ethanol i 15 min.
    100% ethanol i 15 min.
    100% ethanol i 20 min
    100% ethanol i 25 min.
    100% ethanol i 30 min
    Xylen i 20 min.
    Xylen i 30 min.
    Xylen i 40 min.
    Voks i 30 min
    Voks i 35 min
    Voks i 40 min
    BEMÆRK: Nyrer bør ikke udsættes for langvarig udsættelse for varme i voks, da det kan ødelægge antigener af interesse.
  3. Skær 3 μm sektioner på en mikrotom og montere på kommercielt tilgængelige glas mikroskop dias belagt med en positiv ladning. Lad det tørre natten over
  4. Sæt glas dias i en slide rack i en 60 °C ovn i 60 min.
    BEMÆRK: Trin 3.3-3.4 er afgørende for at sikre, at sektioner ikke flyder af under antigenudtagningstrinnet.
  5. Nedsænk objektglas i to opløsningsmiddelskift (xylen eller erstatning) i 40 min hver i en røghætte.
  6. Rehydrer dias i 100% ethanol, 100% ethanol, 70% ethanol i 5 min hver.
  7. Vask i 5 minutter i postevand.
  8. Anbring en varmeplade i en røghætte og forboril antigengenhentningsopløsning (10 mM Tris-1 mM EDTA pH 9.0) i en trykkoger. Så snart antigengengen hentning opløsning begynder at koge placere dias i gryden vandret ved hjælp af et par tang og låse låget. Der koges højt (svarende til 15 psi eller 103 kPa) i 10 min.
    BEMÆRK: Dette trin henter det antigen af interesse ved at afsløre antigen epitop (kryds forbundet via formalin fiksering) for at tillade epitop antistof specifik binding den efterfølgende farvning vil ikke fungere uden dette trin.
  9. Fjern trykkogeren fra varmen, og fjern straks låget ved at køre kold hane oven på låget i en vask. Der skal være ækvivalensglas i 20 minutter i antigenhentningsopløsningen.
  10. Rutsjebaner to gange i 5 min i fosfatbufferet saltvand (PBS) (pH 7,4, 0,01 M) på en orbital shaker.
  11. Brug en hydrofob pen til at tegne cirkler omkring nyrevævet og passe på ikke at lade noget væv tørre ud i denne tid.
  12. Blokvæv i 10 % kyllingesera i 5 % kvægserumalbumin (BSA)/PBS (pH 7,4, 0,01 M) i 30 min., 60 μL pr. sektion. Efter dette trin må blokeringsopløsningen ikke vaskes, men blokeringsopløsningen fjernes forsigtigt med en 60 μL pipette. Lad ikke sektionerne tørre ud.
  13. Der laves en cocktail af de primære antistoffer fortyndet i 1%BSA/PBS (pH 7,4, 0,01 M) i 1 rør. Påfør 60 μL pr. nyresektion. Koncentrationen af de primære antistoffer er som følger:
    Kanin anti menneske / mus H3Cit 1/ 100
    Mus anti menneske/ mus PAD4 1/50
    Gedeanti human/mus MPO 1/200
  14. Inkuber natten over ved 4 °C i et fugtighedskammer.
  15. Vask slides to gange i 5 min i PBS (pH 7,4, 0,01 M) på en orbital shaker.
  16. Lav en cocktail af de sekundære antistoffer i 1 rør. Sekundære antistoffer påføres i 1% BSA/PBS, 60 μL pr. sektion som følger:
    Kylling anti kanin 488 1/200.
    Kylling anti mus 647 1/200.
    Kylling anti ged 594 1/200.
  17. Inkubere på RT i 40 min.
  18. Vask slides to gange i 5 min i PBS (pH 7,4, 0,01 M) på en orbital shaker.
  19. Påfør sekundært antistof 1:200 i 1%BSA/PBS (pH 7.4, 0,01 M) i 40 min ved RT 60 μL pr. sektion.
  20. Vask slides to gange i 5 min i PBS (pH 7,4, 0,01 M) på en orbital shaker.
  21. Fordyb dias i 0,3% Sudan Black i 70% ethanol i 30 min.
  22. Rutsjebaner vaskes i postevand for at fjerne bundfaldet og derefter nedsænkes i PBS (pH 7.4, 0,01 M) i 10 minutter for at forhindre yderligere Sudan Black bundfald fra formning.
  23. Monter objektglas på konfokale glasovertræk ved hjælp af tre 60 μL dråber monteringsopløsning med DAPI. Seal coverslips med neglelak ved at anvende omkring omkredsen af overtræksslip.
  24. Lad objektglasrene hærde i 24 timer ved RT (så DAPI kan trænge ind) og opbevares derefter ved 4 °C beskyttet mod lys. Opbevares i mørke for at forhindre fading af fluorescerende sonder.
  25. Billeddias ved hjælp af et konfokalt laserscanningshoved, der er fastgjort til et mikroskop. Excite glider med 405 laser til DAPI og 488 Laser til H3Cit, 561 for MPO, og 647 for PAD4. Optag enkelt plan 1024x1024 pixel billeder ved hjælp af linje-sekventiel optagelse og 4-line gennemsnit, som er afgørende for at opdage ecDNA. Brug en 40x 1,0 NA olie mål. Billede mindst 20 glomeruli pr prøve. Gem billeder som ND2-filer.

4. Neutrofile ekstracellulære fælder og ecMPO Analyse

  1. Installer ImageJ: https://imagej.net/Fiji/Downloads.
  2. Kontroller, at den trainable Weka segmentering er tilgængelig under Plugins | Segmentering | Trainable Weka Segmentering.
  3. Slip billedet i ImageJ. Klik på Billede | Farve | Opdelte kanaler. Et billede med DAPI i blå farvning alle kerner vises, et billede med H3Cit i grøn, et billede med MPO i rødt, og et billede med PAD4 i hvid vises.
    1. Opret en flettet fil med de enkelte billeder for at tegne et investeringsafkast for glomerulus ved at klikke på Farve | Flet kanaler. En pop-up-boks vil bede om at tildele en farve til hver kanal. Når du har tildelt hver kanal en farve, skal du markere feltet Opret sammensat og feltet Bevar kildebilleder og klikke på Ok. Der vises et flettet billede. I modsætning til protokollen for ecDNA tidligere vil vi bruge det sammensatte billede til at udføre resten af trinene.
  4. Udfør en gaussisk sløring på det sammensatte billede. Dette giver mulighed for udjævning ud af kernerne. Klik på Proces | Filtre | Gaussisk Blur, sat i 1,00-2,00. Billedet vil nu se lidt sløret ud, men kerner er nu glatte og baggrund blødgjort.
    BEMÆRK: Dette trin er præfabrikeret for at fjerne støj for at rydde op i billedet fra artefakter, der kan forhindre relevant påvisning af billedattributter, der skal analyseres.
  5. Klik på Plugins | Segmentering | Trainable Weka Segmentering. Et helt nyt vindue vises med det billede, der skal analyseres, og Weka segmentering specifikke menuværktøjer.
  6. Brug linjeværktøjet på værktøjslinjen (i ImageJ) til at spore de intakte kerner, der ikke er positive for alle 4 NET-komponenter (MPO, PAD4, DAPI og H3Cit) ved hjælp af værktøjet med fri hånd, og føj derefter til feltet Tilføj klasse 1.
  7. Brug af linjeværktøjet på ImageJ-værktøjslinjen, der afgrænser baggrundsområder til feltet Klasse 2.
  8. Klik på knappen Opret ny klasse i etiketmenuen og etiketten "NETs". Brug linjeværktøjet til at afgrænse NETS, der er identificeret som co-lokalisering DAPI (blå), MPO (rød), PAD4 (hvid) og citrullinerede histoner (grøn).
  9. Klik på knappen Opret ny klasse i etiketmenuen og etiketten "ecMPO". Brug linjeværktøjet til at afgrænse MPO (rød), der er cellefri.
  10. Klik på knappen Togklasseifier i træningsmenuen i vinduet Trainable Weka Segmentation.
    BEMÆRK: STOP-knappen vises i stedet for knappen Togklasse og forbliver, indtil træningen er færdig. Klik ikke på denne knap under træningen, og processen vil blive afbrudt.
  11. Klik på Knappen Opret resultat i træningsmenuen, og der oprettes et billede med alle de klassificerede komponenter, der består af intakte kerner, baggrunden og hvad der blev identificeret som ecMPO.
  12. Klik på knappen Hent sandsynlighed i træningsmenuen. Slå musen til for at give et sort-hvidt billede af alle klasserne med markeringsobjektet fremhævet med hvidt.
  13. Dupliker både NET-sandsynligheden og ecMPO-sandsynlighedsbilledet ved at klikke på Billede | Duplikere.
  14. Skift til skærmen ved hjælp af den museknap, der indeholder NET'er. Anvend en tærskel for kun at sikre fremhævning af identificerede NET'er. Klik på Billede | Juster | Tærskel. Flyt glidende til/fra-bjælker, indtil NET-komponenterne er fremhævet. Klik på Anvend, når du er tilfreds med grænsen. Gentag de samme trin for ecMPO.
  15. Hvis der efter tærskelværdi stadig er detektering områder af ECMPO eller NETs, gå tilbage til den oprindelige uddannede billede og tilføje flere klassificeringer og genanvende trin 4.1-4.14.
  16. Klik på Billede | Billedjustering | Gør binær. Kopier det glomerulære INVESTERINGSAFKAST, der er foretaget i trin 4.3, og klik på Ctrl+Skift+E. Aktivér Weka-vindue ved redigering | Valg | Gendan, som gendanner markeringen. Klik på Analyser partikler for kun at måle NET-partiklerne i glomerulus.
  17. Skift til skærmen ved hjælp af den museknap, der indeholder ecMPO. Anvend en tærskel for at sikre, at der kun opnås identificeret ECMPO. Klik på Anvend, når du er tilfreds med grænsen. Gentag trin 4.16 ovenfor.
    BEMÆRK: Et resultatark beregnes med antallet af partikler, området, gennemsnitspixel og procentdelen af glomerulus, der indeholder både NET'er og ecMPO. Disse resultater kan derefter sættes i et regneark og gemmes til senere statistisk analyse.
  18. Gem klassificeringen som NETs.classifier ved at klikke på Gem klassificering fra indstillingsmenuen og gemme filen i ImageJ-appen på skrivebordet (mappen ImageJ). Klik derefter på Gem data i indstillingsmenuen, og gem som filen NETs.arff. Den glomerular ROI bliver nødt til at blive manuelt tilføjet hver gang som glomerulus størrelse og form vil ændre sig, men programmet har lært, hvad både NETs og ECMPO er.
  19. Hvis du vil anvende modellen på efterfølgende billeder igen, skal du gentage trin 4.1-4.5 med et nyt billede. Klik på Indlæs klassificering i indstillingsmenuen. Klik på Nets.classifier i mappen ImageJ. Logmenuen vil poppe op og køre model, når modellen har kørt klik på Indlæs data i menuen indstillinger og vælg NETs.arff fil.
    1. Klik på Opret resultat. Hvis det resulterende billede har undladt at afhente alle de kerner, baggrund eller ecDNA klik på re-tog klassificering og tilføje flere klassificeringer og gemme den nye model. Fuldfør analyseprocessen ved at gentage trin 4.11-4.19.
      BEMÆRK: Flere billeder kan bruges til at generere den endelige model, der anvendes til at opdage ecDNA, ecMPO og NETs. Dette opnås ved at anvende modellen på efterfølgende billeder, tilføje flere klassificeringer og gemme den nye model og data i Mappen ImageJ. Dette kan især være vigtigt, når forskellige prøver har højere baggrund. Weka Segmenteringsprogrammet er kompatibelt med ImageJ-makrosprog, hvilket gør det muligt for mange af kommandoerne at kunne registrere makroer for at automatisere nogle af trinnene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Disse billeder repræsenterer de mange trin, der kræves for at kunne bruge trainable Weka segmentering for at minimere arbejdskrævende manuel måling af ecDNA i fluorescerende farvede FFPE nyrevæv fra en mus med induceret anti-MPO GN. Disse trin er opsummeret i figur 1 og figur 2 med billeder taget direkte fra Weka segmentering program, der skitserer hvert trin i analyseprocessen. Målinger fra denne analyse vises derefter i figur 3, der viser programmets evne til at bestemme de forskellige mængder af ecDNA deponeret i glomerulus, i kontrolvæv, uden induceret anti MPO GN. Figur 4 viser, at modellen for ecDNA kan tilpasses til at identificere ecDNA i nyrebiopsiprøver fra en kontrolpatient (patienter med minimal glomerular skade, der er tydelig på et histologisk niveau) og sammenlignet med en nyrebiopsi fra en patient med MPO-AAV. Figur 5 viser oversættelseskapaciteten af dette program til andre pletter i nyrevæv. Vi har brugt en repræsentativ prøve fra en musenyre med induceret eksperimentel anti-MPO GN til plet for NETs og ecMPO. Det programmerbare Weka-segmenteringsprogram bruges derefter til at identificere både NETS og ecMPO inden for samme billede. Figur 6 viser, at der ikke er nogen signifikant forskel i resultatet af resultaterne i mængden af ecDNA-kvantificering på det samme datasæt analyseret af to uafhængige brugere, der skaber 2 forskellige modeller, der er designet til at halvkvantificere ecDNA.

Figure 1
Figur 1: Billeder, der illustrerer klassificering af kerner, baggrund og ekstracellulær DNA i musenyryre glomeruli fra eksperimentel MPO-ANCA GN ved hjælp af trainable Weka segmentering. (A) Demonstrerer enkelt kanal billeder af DAPI til plet DNA (blå), β actin (grøn) for at afgrænse glomerular område, og den sammensatte fil med en region af interesse (ROI), der angiver glomerular område, der skal måles. (B) Klassificering af intakte kerner til at udvikle modellen (pink) og uklassificerede kerner (blå). (C) Klassificering af, hvad der anses for at være baggrund (grøn). (D) Klassificering af, hvad der anses for at være ecDNA (lilla). (E) Den model, der genereres af trainable Weka segmentering viser kerner i rødt, baggrund i grøn og ecDNA område i lilla. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Billeder, der viser modellens overvågede komponent for at reducere unøjagtigheden. Weka-modellen genererer sandsynligheden for at genkende hver klassificering i uklassificerede komponenter. (A) Model genereret klassificering af, hvad intakt kerner er. (B) Model genereret klassificering af, hvad der betragtes som baggrund. (C) Modelgenerering af, hvad ecDNA anses for. (D) Illustrerer billedet af klassificeret ecDNA unthresholded. (E) Viser justeringen af tærsklen for at udelukke eventuelle fejl i, hvad der er blevet identificeret som ecDNA, identificeret ecDNA vist med rødt. (F) Tærskel anvendes på billedet og gøres til et binært billede til partikelanalyse. (G) Den glomerular ROI er overlejret på billedet, så kun glomerular ecDNA analyseres. (H) Viser en oversigt over resultater, der er genereret af analysen. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Billeder, der illustrerer klassificering af kerner, baggrund og ekstracellulær DNA i musenyryseringstillær fra en kontrolmus uden induceret eksperimentel MPO-ANCA GN ved hjælp af trænet Weka-segmentering. (A) Viser det oprindelige flettede billede med den glomerulære region, der skal analyseres, træningen og det uddannede modelresultat (baggrundsgrøn, kerner rød og ecDNA identificeret i lilla. (B) Viser modelsandsynlighederne for identifikation, kerner, baggrund og ecDNA. (C) Resultater af, hvad modellen klassificeret og identificeret som ecDNA, vises i vilkårlige enheder. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Billede, der illustrerer trænet Weka-segmentering, kan tilpasses til analyse af ecDNA i humane nyrebiopsier fra en patient med minimal ændringssygdom og en patient med MPO-ANCA vaskulitis. (A) Illustrerer, at minimal ecDNA er opdaget ved hjælp af trainable Weka segmentering intakt kerner (rød), baggrund (grøn) og ecDNA (lilla). (B) Demonstrerer betydelige mængder af ecDNA hos en patient nyre biopsi fra en patient med MPO-ANCA vaskulitis intakt kerner (rød), baggrund (grøn) og ecDNA lilla. Resultaterne viser, at der blev fundet 8 partikler ecDNA inden for glomerularregionen hos en patient med MCD sammenlignet med en patient med aktiv MPO ANCA-vaskulitis (180 partikler). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Trainable Weka segmentering kan bruges til at identificere NETS og ecMPO inden for samme billede og model analyse, i mus nyrevæv fra eksperimentelle MPO-ANCA GN. (A) Demonstrerer en glomerulus med NETs [co-lokalisering af grøn (Citrullinate histone 3), rød (MPO) DAPI (kerner) og PAD4 (hvid)]. ecMPO anses for at være cellefri. (B) Uddannelse til identifikation af klassificeringerne, Rød (Intakt kerner), Grøn (baggrund), Lilla (NETs) og gul (ecDNA)]. (C) Den model trainable Weka segmentering bruger til at klassificere NETs og ecMPO, Rød (Intakt kerner), Grøn (baggrund), Lilla (NETs) og gul (ecDNA). (D) Partikelanalyse af, hvad modellen bestemte at være NET'er. (E) Partikelanalyse af, hvad modellen bestemte at være ecMPO. (F) Resultatark fra partikelanalysen for både NET'er og ecDNA. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: Sammenligning af 2 uafhængige brugere i udformningen af en model til påvisning af ecDNA. (A) Originalt billede, der viser de DAPI-, Beta Actin- og Flettede billeder, der skal analyseres. ( B) Sammenligning af uddannelsesmodel, klassificeringer, tærskelværdier og glomerular ROI mellem 2 uafhængige brugere. Den gule pil angiver, at bruger 2 var nødt til at omskole modellen for at fjerne baggrunden. (C) Resultater, der viser sammenligningen af ecDNA-tælling, samlet areal, % areal og omkreds mellem 2 brugere. (D) Resultatgraf, der ikke viser nogen signifikant forskel mellem antallet af ecDNA-påviste inden for glomeruli- og % -området fra to uafhængige efterforskere. Statistisk analyse udført ved hjælp af Mann-Whitney U-test med betydning sat til <0.05. Stikprøvestørrelsen er n=6. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Der findes flere protokoller, der måler proinflammatoriske markører i serum og urin hos både patienter og musemodeller af glomerulonefritis. Denne beskrevne protokol giver mulighed for analyse af produkter af celledød (ecDNA, NETs og ecMPO) inden for glomerulus direkte. De mest afgørende skridt i denne protokol er væv forberedelse og billeddannelse. Det vigtigste begrænsende element ved at bruge en fluorescerende farvning metode til analyse er væv autofluorescens. Formalin fast paraffinvæv er underlagt autofluorescens, der kan skjule specifikke fluorescerende farvning. Det sidste trin i farvningsmetoden, hvor objektglas nedsænkes i Sudan sort, dæmper vævets autofluorescens og gør det muligt at oplyse antistofspecifik farvning gennem reduktion i signal til støjforhold19. Vævs billeddannelse skal udføres med mindst 40x olieforstørrelse for at kunne detektere mindre fragmenter af ecDNA og MPO. Når billeddannelse er erhvervet, er det afgørende, at det sker i en linje sekventiel måde at sikre ingen blødning gennem fluorescens af en markør til en anden.

En fordel ved protokollen til analyse er, at den er tilgængelig i åben adgang via ImageJ for alle at få adgang til16. Vi har påvist heri, at metoden let kan tilpasses til at måle forskellige fluorescerende markører i nyrevæv. Når modellen i trainable Weka segmentering er blevet bestemt det kan anvendes til efterfølgende billeder uden bias og på nøjagtig samme måde hvert billede er blevet analyseret. Den overvågede karakter af analysen gør det muligt at justere enhver fejl i segmenteringen gennem de yderligere trin med tærskelværdi af de "uddannede" billeder eller omskoling af programmet og tilføjelse af flere klassificeringer. Fordelen ved dette program er, at to forskellige brugere vil få lignende resultat ved hjælp af den samme model, forudsat at de præcist afgrænse glomerular tot. Den største unøjagtighed i reproducerbarhed af to forskellige slutbrugere er skabt af de forskellige måde, hvorpå folk spore omkring glomerular tot. For eksempel, hvis en person tegner en ru cirkel omkring glomerular tot og en anden bruger omhyggeligt trækker omkring den yderste kapillær sløjfer det område, der undersøges, vil afvige (som vist i resultaterne). Det er derfor vigtigt, at begge brugere er uddannet til at identificere den glomerulære tot på samme måde. Den praktiske anvendelse af dette program ville være for to brugere til at designe modellen sammen på flere billeder til at bygge en robust model, der skal anvendes på yderligere datasæt. Jo flere billeder, der bruges til at træne klassificeringerne, jo mere præcis bliver modellen.

Begrænsninger af denne protokol ville være måling af fragmenter af ecDNA mindre end hvad den konfokale mikroskop kan detektere. Dette kunne overvindes ved hjælp af at tage billeder ved hjælp af super opløsning mikroskopi metoder og anvende den trainable Weka segmentering til disse billeder. Den overvågede komponent i maskinlæring tilføjer ekstra trin og reducerer muligheden for at batch proces store sæt af billeder. Men som vi demonstreret inden for resultaterne uovervåget modeller har reduceret nøjagtighed og indføre den overvågede komponent reduceret unøjagtighed betydeligt.

Vi har tidligere offentliggjort, at ud over neutrofiler producerer ekstracellulære fælder, monocytter / makrofager blev også observeret for at producere ekstracellulære fælder (kaldes METs) i human ANCA vaskulitis, men i mindre proportioner1. De nuværende metoder, der er beskrevet heri, skelner ikke mellem ekstracellulære fælder, der produceres af neutrofiler eller monocytter/makrofager. Dette er vanskeligt at opnå, da de fleste konfokale mikroskoper er begrænset af antallet af lasere. Identifikation af NET'er kræver derfor 4 forskellige lasere, hvilket begrænser antallet af cellemarkører, der kan behandles via standardkonfokal billeddannelse. Hvis MPO-den positive oprindelsescelle er påkrævet, kan der farves en anden seriel sektion med enten en neutrofil- eller makrofag/monocytmarkør for at identificere den celletype, der producerer den ekstracellulære fælde.

Patologiske træk ved MPO-ANCA vaskulitis omfatter aflejring af ecDNA, NETS og ecMPO i glomeruli i nyrerne20. Terapeutisk målrettet DNA i NET'er og ECMPO samt måling af dem i humane biopsier som sygdomsmarkører har været genstand for nylige undersøgelser1,20,21,22. Betydningen af disse metoder på dette område er nøjagtigt at bestemme den relative andel af ecDNA, NETs og ecMPO inden for målorganet, på en reproducerbar, mindre tidskrævende måde. Afslutningsvis har vi demonstreret en overvåget machine learning værktøj trainable Weka segmentering til semi automatisere analysen af store datasæt af erhvervede billeder til ecDNA, NETs og ecMPO. Brugen af dette værktøj vil reducere billedanalyse tid betydeligt, og de teknikker kan let tilpasses til andre pletter i andre organer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi anerkender Monash Micro Imaging for brug af Nikon C1 opretstående konfokal laser scanning mikroskop og Monash Histology Platform til behandling af nyrevæv.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bovine Serum Albumin SIGMA A2153 5% and 1% solutions are made up in PBS, can be made in bulk and frozen- discard once thawed.
Chicken anti Goat IgG (H+L) cross absorbed antibody Alexa Fluor 594 ThermoFisher Scientific A-21468 Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail
Chicken anti mouse IgG (H+L) cross absorbed antibody, Alex Fluor 647 ThermoFisher Scientific A-121468 Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail
Chicken anti rabbit IgG (H+L) Cross absorbed antibody Alexa Fluor 488 ThermoFisher Scientific A-21441 Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail
Chicken sera SIGMA C5405 Made up in 1%BSA/PBS
Coverslips 24 x60 mm Azerscientific ES0107222 #1.5 This is not standard thickness- designed for use in confocal microscopy
EDTA 10mM SIGMA E6758 Add TRIS and EDTA together in distilled water and pH to 9, for antigen retrieval, can be made up in a 10x Solution
Ethanol 30%, 70% and 100% Chem Supply UN1170 Supplied as 100% undenatured ethanol- dilute to 30% and 70% using distilled water
Formaldehyde, 4% (10% Neutral buffered Formalin) TRAJAN NBF-500 Kidney is put into a 5ml tube containing 3ml of formalin for 16 hours at RT, formalin should be used in a fume hood
Glass histology slides- Ultra Super Frost, Menzel Glaze, 25x75 x1.0mm TRAJAN J3800AM4 Using positive charged coated slides is essential. We do not recommend using poly-L-lysine for coating slides as tissue dislodges from slides during the antigen retrieval step
Goat anti human/mouse MPO antibody R&D AF3667 Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival
Histosol Clini Pure CPL HISTOSOL 08 Used neat, in 200ml staining rack containers, use in a fume hood
Hydrophobic pen VECTOR Labs H-400 Use to draw circle around kidney tissue
Mouse anti human/mouse Peptidyl arginase 4 (PAD4) ABCAM ab128086 Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival
Nikon C1 confocal scanning laser head attached to Nikon Ti-E inverted Microscope Coherent Scientific Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival
Phosphate Buffered Saline SIGMA P38135 0.01M PB/0.09% NaCl Make up 5L at a time
Pressure Cooker 6L Tefal secure 5 Neo stainless Tefal GSA-P2530738 Purchased at local homeware store
Prolong Gold DAPI Life Technologies P36962 Apply drops directly to coverslip
Rabbit anti human/mouse Beta Actin antibody ABCAM ab8227 Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival
Rabbit anti human/mouse H3Cit antibody ABCAM ab5103 Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival
Staining rack 24 slides ProScitech H4465 Staining rack chosen has to be able to withstand boiling under pressure and incubation in 60 degree oven
Sudan Black B SIGMA 199664 0.3% Add 3g to a 1L bottle in 70% Ethanol, filter and protect from the light- stable for 6 months at room temperature
Tris 10mM SIGMA T4661 Add TRIS and EDTA together in distilled water and pH to 9, for antigen retrieval, can be made up in a 10x solution
Xylene Trajan XL005/20 Must be use used in a fume hood

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. O'Sullivan, K. M., et al. Renal participation of myeloperoxidase in antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated glomerulonephritis. Kidney International. 88 (5), 1030-1046 (2015).
  2. Jennette, J. C., Falk, R. J., Hu, P., Xiao, H. Pathogenesis of antineutrophil cytoplasmic autoantibody-associated small-vessel vasculitis. Annual Review of Pathology. 8, 139-160 (2013).
  3. Jorgensen, I., Rayamajhi, M., Miao, E. A. Programmed cell death as a defence against infection. Nat Rev Immunol. 17 (3), 151-164 (2017).
  4. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  5. Wyllie, A. H., Kerr, J. F., Currie, A. R. Cell death: the significance of apoptosis. International Review of Cytology. 68, 251-306 (1980).
  6. Fiers, W., Beyaert, R., Declercq, W., Vandenabeele, P. More than one way to die: apoptosis, necrosis and reactive oxygen damage. Oncogene. 18 (54), 7719-7730 (1999).
  7. Pasparakis, M., Vandenabeele, P. Necroptosis and its role in inflammation. Nature. 517 (7534), 311-320 (2015).
  8. Fink, S. L., Cookson, B. T. Caspase-1-dependent pore formation during pyroptosis leads to osmotic lysis of infected host macrophages. Cellular Microbiology. 8 (11), 1812-1825 (2006).
  9. Ooi, J. D., Gan, P. Y., Odobasic, D., Holdsworth, S. R., Kitching, A. R. T cell mediated autoimmune glomerular disease in mice. Current Protocols in Immunology. 107, 15.27.11-15.27.19 (2014).
  10. Ruth, A. J., et al. Anti-neutrophil cytoplasmic antibodies and effector CD4+ cells play nonredundant roles in anti-myeloperoxidase crescentic glomerulonephritis. Journal of the American Society of Nephrology. 17 (7), 1940-1949 (2006).
  11. Nagler, M., Insam, H., Pietramellara, G., Ascher-Jenull, J. Extracellular DNA in natural environments: features, relevance and applications. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (15), 6343-6356 (2018).
  12. Burnham, P., et al. Urinary cell-free DNA is a versatile analyte for monitoring infections of the urinary tract. Nature Communications. 9 (1), 2412 (2018).
  13. Gobe, G. Identification of apoptosis in kidney tissue sections. Methods in Molecular Biology. 466, 175-192 (2009).
  14. Olander, M., Handin, N., Artursson, P. Image-Based Quantification of Cell Debris as a Measure of Apoptosis. Analytical Chemistry. 91 (9), 5548-5552 (2019).
  15. Arganda-Carreras, I., et al. Trainable Weka Segmentation: a machine learning tool for microscopy pixel classification. Bioinformatics. 33 (15), 2424-2426 (2017).
  16. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  17. Apel, F., Zychlinsky, A., Kenny, E. F. The role of neutrophil extracellular traps in rheumatic diseases. Nature Reviews Rheumatology. 14 (8), 467-475 (2018).
  18. Chapman, E. A., et al. Caught in a Trap? Proteomic Analysis of Neutrophil Extracellular Traps in Rheumatoid Arthritis and Systemic Lupus Erythematosus. Frontiers in Immunology. 10, 423 (2019).
  19. Oliveira, V. C., et al. Sudan Black B treatment reduces autofluorescence and improves resolution of in situ hybridization specific fluorescent signals of brain sections. Histology & Histopathology. 25 (8), 1017-1024 (2010).
  20. Kessenbrock, K., et al. Netting neutrophils in autoimmune small-vessel vasculitis. Nature Medicine. 15 (6), 623-625 (2009).
  21. Schreiber, A., et al. Necroptosis controls NET generation and mediates complement activation, endothelial damage, and autoimmune vasculitis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (45), E9618-E9625 (2017).
  22. Antonelou, M., Perea Ortega, L., Harvey, J., Salama, A. D. Anti-myeloperoxidase antibody positivity in patients without primary systemic vasculitis. Clinical and Experimental Rheumatology. 37 (2), 86-89 (2019).

Tags

Immunologi og infektion Problem 160 Glomerulonefritis Ekstracellulær DNA Nyre Cellød Overvåget Machine Learning
Overvåget maskinlæring til semi-kvantificering af ekstracellulær DNA i glomerulonefritis
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

O'Sullivan, K. M., Creed, S., Gan,… More

O'Sullivan, K. M., Creed, S., Gan, P. Y., Holdsworth, S. R. Supervised Machine Learning for Semi-Quantification of Extracellular DNA in Glomerulonephritis. J. Vis. Exp. (160), e61180, doi:10.3791/61180 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter