Summary

Überwachtes maschinelles Lernen zur Semiquantifizierung der extrazellulären DNA bei Glomerulonephritis

Published: June 18, 2020
doi:

Summary

Extrazelluläre DNA (ecDNA), die während des Zelltodes freigesetzt wird, ist proinflammatorische und trägt zu Entzündungen bei. Die Messung von ecDNA an der Verletzungsstelle kann die Wirksamkeit der therapeutischen Behandlung im Zielorgan bestimmen. Dieses Protokoll beschreibt den Einsatz eines Machine Learning-Tools zur Automatisierung der Messung von ecDNA im Nierengewebe.

Abstract

Der Glomeruläre Zelltod ist ein pathologisches Merkmal der Myeloperoxidase anti neutrophilen zytoplasmatischen Antikörperassoziierten Vaskulitis (MPO-AAV). Extrazelluläre Desoxyribonukleinsäure (ecDNA) wird bei verschiedenen Formen des Zelltodes freigesetzt, einschließlich Apoptose, Nekrose, Nekroptose, neutrophilen extrazellulären Fallen (NETs) und Pyroptose. Die Messung dieses Zelltodes ist zeitaufwändig, wobei mehrere verschiedene Biomarker erforderlich sind, um die verschiedenen biochemischen Formen des Zelltodes zu identifizieren. Die Messung von ecDNA wird in der Regel in Serum und Urin als Ersatz für Nierenschäden durchgeführt, nicht im eigentlichen Zielorgan, wo die pathologische Verletzung auftritt. Die aktuelle Schwierigkeit bei der Untersuchung von ecDNA in der Niere ist das Fehlen von Methoden für formalin fixiertes Paraffin-eingebettetes Gewebe (FFPE) sowohl experimentell als auch in archivierten menschlichen Nierenbiopsien. Dieses Protokoll bietet eine Zusammenfassung der Schritte, die erforderlich sind, um für ecDNA in FFPE-Gewebe (sowohl menschliche als auch murine), abschrecken Autofluoreszenz und messen die ecDNA in den resultierenden Bildern mit einem Machine Learning-Tool aus der öffentlich verfügbaren Open-Source-ImageJ-Plugin trainable Weka Segmentierung. Die trainierbare Weka-Segmentierung wird auf ecDNA innerhalb der Glomeruli angewendet, wo das Programm lernt, ecDNA zu klassifizieren. Dieser Klassifizierer wird auf nachfolgende erworbene Nierenbilder angewendet, wodurch die Notwendigkeit manueller Anmerkungen für jedes einzelne Bild reduziert wird. Die Anpassungsfähigkeit der trainierbaren Weka-Segmentierung wird weiter im Nierengewebe von experimenteller muriner Anti-MPO-Glomerulonephritis (GN) nachgewiesen, um NETs und ecMPO, häufige pathologische Mitwirkende an Anti-MPO GN, zu identifizieren. Diese Methode bietet eine objektive Analyse von ecDNA im Nierengewebe, die die Wirksamkeit deutlich zeigt, in der das trainierbare Weka-Segmentierungsprogramm ecDNA zwischen gesundem normalem Nierengewebe und krankem Nierengewebe unterscheiden kann. Dieses Protokoll kann leicht angepasst werden, um ecDNA, NETs und ecMPO in anderen Organen zu identifizieren.

Introduction

Myeloperoxidase anti neutrophile zytoplasmatische Antikörper assoziierte Vaskulitis (MPO-AAV) ist eine Autoimmunerkrankung, die zu Nierenversagen von pathologischen glomerulären Verletzungen mit erheblichem Zelltod und Freisetzung von Desoxyribonukleinsäure (DNA)1,2führt. DNA kann das Immunsystem aktivieren, indem sie als Gefahrensignal fungiert. Unter normalen gesunden Bedingungen bietet die nukleare Lage der DNA Schutz vor der Exposition gegenüber dem Immunsystem. Selbst-DNA, die extrazellulär während entweder pathogener Prozesse oder Autoimmunität freigesetzt wird, wird vom Immunsystem als eine potente proinflammatorische Schädigung assoziierter molekularer Selbstprotein (DAMP)3gesehen. Extra zelluläre DNA (ecDNA) wird aus sterbenden Zellen durch mehrere verschiedene Mechanismen freigesetzt, die durch verschiedene biochemische Bahnen gesteuert werden, wie Apoptose, Nekrotophile extrazelluläre Trapbildung (NETs), Nekrose oder Pyroptose4,5,6,7,8.

Wir beschreiben hierin Methoden zur Färbung und Messung von ecDNA, die aus sterbenden Zellen in Abschnitten von formalin fixierten Paraffin-eingebetteten (FFPE) Nieren von experimentellen Anti-MPO-GN- und Nierenbiopsien von Patienten mit MPO-AAV9,10freigesetzt werden. Es gibt mehrere Methoden zum Nachweis von zirkulierender doppelsträngiger DNA (dsDNA) und DNA-Komplexen aus Serum und Urin sowie aus In-vitro-Assays11,12. Diese Methoden, obwohl genau bei der Bestimmung der Menge an ecDNA, bestimmen nicht, wo die ecDNA anatomisch freigesetzt wird. Es gibt Methoden, die spezifische Messung von ecDNA wie Tunel für Apoptose und Messung von Zellablagerungen13,14beschreiben. Es gibt keine Methode, die die Messung von ecDNA beschreibt, die aus allen Formen des Zelltodes in FFPE-Nieren gegipfelt, wo die pathologische Schädigung auftritt. Dies ist wichtig, um festzustellen, ob experimentelle therapeutische Behandlungen die ecDNA von den Stellen der pathologischen Verletzung im eigentlichen Zielorgan löschen.

Die Erfassung mehrerer Bilder aus Nierenproben erzeugt ein hohes Datenvolumen, das häufig von einem einzelnen Benutzer analysiert wird. Dies ist arbeitsintensiv, zeitaufwändig und kann aufgrund von Voreingenommenheit des Benutzers einer unzuverlässigen Reproduzierbarkeit durch andere Benutzer unterliegen. Trainable Weka Segmentierung ist ein Open-Source-Software-Plugin für ImageJ, das modernste bioinforschende Werkzeuge verwendet, um Pixel mit Machine Learning-Algorithmen15,16zu klassifizieren. Diese Methode ist “trainierbar”, wobei sie aus der Klassifizierung von Pixelsegmenten des Benutzers lernt und die neu gelernte Klassifizierung auf andere Bilder anwendet. Diese Methode basiert auf gängigen Analysewerkzeugen innerhalb des ImageJ-Programms, die verwendet werden, um jedes Pixel in einem Segment als zu einer bestimmten “Klasse” gehörend zu “klassifizieren”. Sobald das Programm die “Klassifikatoren” erlernt hat, können sie verwendet werden, um andere ähnliche klassifizierte Segmente innerhalb desselben Bildes zu identifizieren. Dieses Modell wird dann gespeichert und auf andere Bildsätze innerhalb desselben Experiments angewendet.

Aktuelle Hindernisse bei der Bestimmung von ecDNA in situ in Nierenabschnitten ist die endogene Autofluoreszenz durch Fixierung im Formalin und die arbeitsintensive Analyse der Bilder. Wir beschreiben hier, wie diese Autofluoreszenz zu löschen, zu erkennen ecDNA, und verwenden überwachtes maschinelles Lernen für hohe Durchsatzmessung von ecDNA. Wir haben bereits die Messung von NETs und extrazellulärem MPO (ecMPO) mit einem Makro in ImageJ veröffentlicht, wir demonstrieren jetzt die Halbautomatisierung dieser Methoden mit überwachtem maschinellem Lernen1. Wir zeigen die Anpassungsfähigkeit des Machine Learning Tools, um einen alternativen Fleck für NETs und ecMPO innerhalb desselben Bildes zu klassifizieren. Diese hier beschriebenen Färbemethoden zum Nachweis von ecDNA, NETs und ecMPO können in andere feste Organe und Krankheiten übersetzt werden, bei denen ecDNA, NETS und ecMPO eine Rolle bei der Aufrechterhaltung von Krankheiten wie rheumatoider Arthritis und Lupus17,18spielen.

Protocol

Diese Methode ermöglicht die Detektion von Pan ecDNA aus allen Formen des Zelltodes. Die gleiche Methode und Antikörper werden für menschliches Nierenbiopsiegewebe verwendet (ab Schritt 4). Alle tierischen und menschlichen Probanden hatten die Ethik-Zulassung von der Monash University und Monash Health, Clayton, Victoria, Australien. 1. Färbung für ecDNA mit DAPI und A-Actin Induzieren Sie ein 20-Tage-Modell der Anti-Myeloperoxidase Glomerulonephritis (Anti-MPO-GN) in 8-10 Woche…

Representative Results

Diese Bilder stellen die verschiedenen Schritte dar, die erforderlich sind, um die trainierbare Weka-Segmentierung erfolgreich zu verwenden, um die arbeitsintensive manuelle Messung von ecDNA in fluoreszierend gefärbtem FFPE-Nierengewebe von einer Maus mit induziertem Anti-MPO GN zu minimieren. Diese Schritte sind in Abbildung 1 und Abbildung 2 mit Bildern zusammengefasst, die direkt aus dem Weka-Segmentierungsprogramm aufgenomm…

Discussion

Es gibt mehrere Protokolle, die proinflammatorische Marker im Serum und Urin von Patienten und Mausmodellen der Glomerulonephritis messen. Dieses beschriebene Protokoll ermöglicht die direkte Analyse der Produkte des Zelltodes (ecDNA, NETs und ecMPO) innerhalb des Glomerulus. Die wichtigsten Schritte in diesem Protokoll sind die Gewebevorbereitung und -bildgebung. Das wichtigste einschränkende Element der Verwendung einer fluoreszierenden Färbungsmethode für die Analyse ist die Gewebe-Autofluoreszenz. Formalin fixier…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir würdigen Monash Micro Imaging für den Einsatz des aufrechten Konfokallaser-Scanning-Mikroskops Nikon C1 und der Monash Histology Platform für die Verarbeitung von Nierengewebe.

Materials

Bovine Serum Albumin SIGMA A2153 5% and 1% solutions are made up in PBS, can be made in bulk and frozen- discard once thawed.
Chicken anti Goat IgG (H+L) cross absorbed antibody Alexa Fluor 594 ThermoFisher Scientific A-21468 Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail
Chicken anti mouse IgG (H+L) cross absorbed antibody, Alex Fluor 647 ThermoFisher Scientific A-121468 Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail
Chicken anti rabbit IgG (H+L) Cross absorbed antibody Alexa Fluor 488 ThermoFisher Scientific A-21441 Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail
Chicken sera SIGMA C5405 Made up in 1%BSA/PBS
Coverslips 24 x60 mm Azerscientific ES0107222 #1.5 This is not standard thickness- designed for use in confocal microscopy
EDTA 10mM SIGMA E6758 Add TRIS and EDTA together in distilled water and pH to 9, for antigen retrieval, can be made up in a 10x Solution
Ethanol 30%, 70% and 100% Chem Supply UN1170 Supplied as 100% undenatured ethanol- dilute to 30% and 70% using distilled water
Formaldehyde, 4% (10% Neutral buffered Formalin) TRAJAN NBF-500 Kidney is put into a 5ml tube containing 3ml of formalin for 16 hours at RT, formalin should be used in a fume hood
Glass histology slides- Ultra Super Frost, Menzel Glaze, 25×75 x1.0mm TRAJAN J3800AM4 Using positive charged coated slides is essential. We do not recommend using poly-L-lysine for coating slides as tissue dislodges from slides during the antigen retrieval step
Goat anti human/mouse MPO antibody R&D AF3667 Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival
Histosol Clini Pure CPL HISTOSOL 08 Used neat, in 200ml staining rack containers, use in a fume hood
Hydrophobic pen VECTOR Labs H-400 Use to draw circle around kidney tissue
Mouse anti human/mouse Peptidyl arginase 4 (PAD4) ABCAM ab128086 Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival
Nikon C1 confocal scanning laser head attached to Nikon Ti-E inverted Microscope Coherent Scientific Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival
Phosphate Buffered Saline SIGMA P38135 0.01M PB/0.09% NaCl Make up 5L at a time
Pressure Cooker 6L Tefal secure 5 Neo stainless Tefal GSA-P2530738 Purchased at local homeware store
Prolong Gold DAPI Life Technologies P36962 Apply drops directly to coverslip
Rabbit anti human/mouse Beta Actin antibody ABCAM ab8227 Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival
Rabbit anti human/mouse H3Cit antibody ABCAM ab5103 Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival
Staining rack 24 slides ProScitech H4465 Staining rack chosen has to be able to withstand boiling under pressure and incubation in 60 degree oven
Sudan Black B SIGMA 199664 0.3% Add 3g to a 1L bottle in 70% Ethanol, filter and protect from the light- stable for 6 months at room temperature
Tris 10mM SIGMA T4661 Add TRIS and EDTA together in distilled water and pH to 9, for antigen retrieval, can be made up in a 10x solution
Xylene Trajan XL005/20 Must be use used in a fume hood

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Cite This Article
O’Sullivan, K. M., Creed, S., Gan, P., Holdsworth, S. R. Supervised Machine Learning for Semi-Quantification of Extracellular DNA in Glomerulonephritis. J. Vis. Exp. (160), e61180, doi:10.3791/61180 (2020).

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