Summary
O DNA extracelular (ecDNA) liberado durante a morte celular é proinflamatório e contribui para inflamação. A medição do ecDNA no local da lesão pode determinar a eficácia do tratamento terapêutico no órgão-alvo. Este protocolo descreve o uso de uma ferramenta de aprendizado de máquina para automatizar a medição do ecDNA no tecido renal.
Abstract
A morte celular glomerular é uma característica patológica do anticorpo citoplasmica anti-neutrófilo mielóperidase associado à vasculite (MPO-AAV). O ácido desoxiribonucleico extracelular (ecDNA) é liberado durante diferentes formas de morte celular, incluindo apoptose, necroptose, armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) e pioptosis. A medição desta morte celular é demorada com vários biomarcadores diferentes necessários para identificar as diferentes formas bioquímicas de morte celular. A medição do ecDNA é geralmente conduzida em soro e urina como substituto para danos renais, não no órgão alvo real onde ocorre a lesão patológica. A dificuldade atual em investigar o ecDNA no rim é a falta de métodos para o tecido incorporado de parafina fixa formalina (FFPE) tanto experimentalmente quanto em biópsias renais humanas arquivadas. Este protocolo fornece um resumo das etapas necessárias para colorir para ecDNA no tecido FFPE (humano e murine), saciar a autofluorescência e medir o ecDNA nas imagens resultantes usando uma ferramenta de aprendizado de máquina da segmentação weka de código aberto disponível publicamente. A segmentação de Weka trainável é aplicada ao ecDNA dentro do glomeruli onde o programa aprende a classificar o ecDNA. Este classificador é aplicado a imagens renais adquiridas subsequentes, reduzindo a necessidade de anotações manuais de cada imagem individual. A adaptabilidade da segmentação de Weka trainável é demonstrada ainda mais no tecido renal a partir da glomerulonephrite murina experimental (GN), para identificar NETs e ecMPO, contribuintes patológicos comuns para o ANTI-MPO GN. Este método fornece uma análise objetiva da ecDNA no tecido renal que demonstra claramente a eficácia na qual o programa de segmentação de Weka pode distinguir o ECDNA entre tecido renal normal saudável e tecido renal doente. Este protocolo pode ser facilmente adaptado para identificar ecDNA, NETs e ecMPO em outros órgãos.
Introduction
O anticorpo citoplasmico anti-neutrófilo associado à vasculite anti-neutronômica (MPO-AAV) é uma doença autoimune que resulta em insuficiência renal por lesão glomerular patológica com considerável morte celular e liberação de ácido desoxiribonucleico (DNA)1,,2. O DNA pode ativar o sistema imunológico agindo como um sinal de perigo. Em condições saudáveis normais, a localização nuclear do DNA oferece proteção contra a exposição ao sistema imunológico. O auto-DNA que é liberado extracelularmente durante processos patogênicos ou autoimunidade é visto pelo sistema imunológico como um potente dano proinflamatório associado à auto-proteína molecular (DAMP)3. O DNA celular extra (ecDNA) é liberado de células moribundas através de vários mecanismos distintos que são regidos por distintas vias bioquímicas, como apoptose, necroptose formação de armadilha extracelular (NETs), necrose ou pioptose4,,5,,6,,7,,8.
Descrevemos aqui métodos para colorar e medir o ecDNA liberado de células moribundas em seções de parafina fixa formalina incorporada (FFPE) de biópsias experimentais anti-MPO GN e renais de pacientes com MPO-AAV9,,10. Existem múltiplos métodos para a detecção de complexos de DNA duplo encalhado circulante (dsDNA) e DNA tanto do soro quanto da urina e dos ensaios in vitro11,12. Esses métodos, embora precisos na determinação da quantidade de ecDNA, não determinam onde o ecDNA é liberado anatomicamente. Existem métodos que descrevem a medição específica do ecDNA, como o tunel para apoptose e a medição de detritos celulares13,14. Não há nenhum método que descreva a medição do ECDNA culminado de todas as formas de morte celular nos rins FFPE onde ocorre o dano patológico. Isso é importante para determinar se os tratamentos terapêuticos experimentais estão eliminando o ecDNA dos locais de lesão patológica no órgão alvo real.
A aquisição de múltiplas imagens de amostras de rim cria um alto volume de dados que é analisado comumente por um único usuário. Isso é trabalhoso, demorado e pode estar sujeito a reprodutibilidade não confiável por outros usuários, devido ao viés do usuário. A segmentação de Weka é um plugin de software de código aberto para ImageJ que usa ferramentas bioinformáticas de ponta para classificar pixels usando algoritmos de aprendizado de máquina15,,16. Este método é "treinável" pelo qual aprende com a classificação do usuário segmentos de pixels e aplica a nova classificação aprendida a outras imagens. Este método se baseia em ferramentas de análise comuns dentro do programa ImageJ que são usadas para "classificar" cada pixel em um segmento como pertencente a uma "classe" específica. Uma vez que o programa aprende os "classificadores", eles podem ser usados para identificar outros segmentos classificados semelhantes dentro da mesma imagem. Este modelo é então salvo e aplicado a outros conjuntos de imagens dentro do mesmo experimento.
Os obstáculos atuais para determinar o ecDNA in situ em seções renais é a autofluorescência endógena da fixação na formalina e a análise intensiva do trabalho intensivo das imagens. Descrevemos aqui como saciar essa autofluorescência, detectar ecDNA e usar aprendizado de máquina supervisionado para medição de alto rendimento do ecDNA. Publicamos anteriormente a medição de NETs e MPO extracelular (ecMPO) utilizando uma macro no ImageJ, agora demonstramos semimass automação desses métodos usando aprendizado de máquina supervisionado1. Demonstramos a adaptabilidade da ferramenta de aprendizado de máquina, para classificar uma mancha alternativa para NETs e ecMPO dentro da mesma imagem. Estes métodos de coloração descritos aqui para a detecção de ecDNA, NETs e ecMPO podem ser traduzidos para outros órgãos e doenças sólidas onde ecDNA, NETS e ecMPO desempenha um papel na perpetuação de doenças como artrite reumatoide e lúpus17,18.
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Protocol
Este método permite a detecção de ecDNA pan de todas as formas de morte celular. O mesmo método e anticorpos são usados para o tecido de biópsia renal humana (a partir do passo 4). Todos os indivíduos animais e humanos tiveram aprovação ética da Monash University, e Monash Health, Clayton, Victoria, Austrália.
1. Coloração para ecDNA com DAPI e β-Actin
- Induzir um modelo de 20 dias de glomerulonephritis anti-mieloperoxidase (anti-MPO-GN) em camundongos C57/Bl6 de 8-10 semanas de idade, com controles9.
- Eutanize ratos humanamente usando uma câmara de CO2.
- Remova os rins fazendo uma incisão anterior da linha média através da pele com uma tesoura, e, em seguida, corte cuidadosamente o peritônio e pino de volta em uma placa de dissecção. O uso de fórceps afasta a fáscia renal anterior e o peritônio parietal e corta o rim livre, cortando o ureter e os vasos sanguíneos (artéria renal e veia) na pelve renal. Remova com fórceps e corte os rins ao meio (plano sagital) com um bisturi tamanho 22.
- Coloque o rim em formalina fixa (4% tamponada) durante 16 horas em temperatura ambiente (RT). Remova e mergulhe o rim fixo em 30% de etanol durante 24 horas antes do processamento.
- Processar rins usando um ciclo padrão de 6 horas:
70% de etanol por 15 min
90% de etanol por 15 min
100% etanol por 15 min
100% etanol por 20 min
100% etanol por 25 min
100% etanol por 30 min
Xileno por 20 min
Xileno por 30 min
Xileno por 40 min
Cera por 30 min
Cera por 35 min
Cera por 40 min
NOTA: Isso é importante, pois os rins não devem ser submetidos a exposição prolongada ao calor na cera, pois podem destruir antígenos de interesse. - Corte seções de 3 μm em um microtome e monte em lâminas de microscópio de vidro disponíveis comercialmente revestidas com uma carga positiva. Deixe secar durante a noite.
- Coloque lâminas de vidro em um rack de deslizamento em um forno de 60 °C por 60 min.
NOTA: As etapas 1.3 e 1.4 são cruciais para garantir que as seções não flutuem durante a etapa de recuperação de antígenos. - Mergulhe slides em duas mudanças de solvente (xileno ou substituto) por 40 minutos cada, em um capô de fumaça.
- O reidrato desliza em 100% etanol, 100% etanol, 70% etanol por 5 min cada. Lave por 5 minutos na água da torneira.
- Coloque uma placa quente em um capô de fumaça e solução de recuperação de antígeno pré-loil (10 mM Tris, 1 mM EDTA pH 9.0) em uma panela de pressão. Assim que a solução de recuperação de antígeno começar a ferver, coloque os slides na panela horizontalmente usando um par de pinças e bloqueie a tampa. Ferva em alta (equivalente a 15 psi ou 103 kPa) por 10 min.
NOTA: Esta etapa é crucial, pois recupera o antígeno de interesse ao desmascarar o epítope de antígeno (transversal por fixação de formalina) para permitir que o anticorpo epitope específico vincule a posterior coloração não funcionará sem ele. - Remova a panela de pressão do fogo e remova a tampa imediatamente, executando a torneira fria em cima da tampa em uma pia. Deixe slides para equilibrar por 20 minutos na solução de recuperação de antígeno.
- Lave lâminas duas vezes por 5 min em 0,01 M de salina tamponada de fosfato (PBS) (pH 7.4) em um agitador orbital.
- Use uma caneta hidrofóbica para desenhar círculos ao redor do tecido renal, tomando cuidado para não deixar nenhum tecido secar neste tempo.
- Bloqueie tecido em 10% sera de frango em 5% de gêrina bovina albumina (BSA)/PBS (pH 7.4, 0,01 M) por 30 min, 60 μL por seção. Não lave após esta etapa, mas remova cuidadosamente a solução de bloqueio usando uma pipeta de 60 μL, não deixe as seções secarem.
- Aplique coquetel de anticorpos primários para β-actin diluído 1/1000 em 1% BSA/PBS (pH 7,4, 0,01 M), 60 μL por seção e incubar durante a noite em uma câmara de umidade a 4 °C.
- Lave lâminas duas vezes por 5 min em PBS (pH 7,4, 0,01 M) em um agitador orbital.
- Aplique anticorpo secundário, anti coelho de frango 488 (1/200), 60 μL por seção diluída em 1%BSA/PBS (pH 7,4, 0,01 M) por 40 min na RT.
- Lave os slides duas vezes por 5 min em PBS (pH 7,4, 0,01 M) em um agitador orbital.
- Mergulhe os slides em 0,3% Sudão Preto em 70% de etanol por 30 min em um frasco de Coplin.
NOTA: Esta etapa é importante, pois sacia a autofluorescência causada pela fixação da formalina. - Lave os slides na água da torneira para remover o precipitado e, em seguida, mergulhe em PBS (pH 7.4, 0,01 M) por 10 minutos para evitar que mais precipitado Sudão Preto se forme.
- Monte slides em tampas de vidro confocal usando três gotas de 60 μL de solução de montagem com DAPI e selar as tampas com esmalte, aplicando-se ao redor do perímetro da mancha de cobertura.
- Deixe os slides curarem por 24 horas no RT (para permitir que o DAPI penetrá-lo) e, em seguida, armazene a 4 °C protegido da luz.
NOTA: Importante manter-se no escuro para evitar o desbotamento das sondas fluorescentes. - Slides de imagem usando uma cabeça de varredura a laser confocal presa a um microscópio. Excite slides com o laser 405 para DAPI e o Laser 488 para Beta Actin. Capture imagens de plano único 1024 x1024 pixels usando captura sequencial de linha e média de 4 linhas, o que é essencial para detectar ecDNA. 40x 1.0 O objetivo do óleo NA é utilizado.
- Imagem mínima de 20 glomeruli por amostra. Salvar imagens como arquivos ND2.
2. Análise da DAPI e β-Actin
- Instalar ImageJ: https://imagej.net/Fiji/Downloads.
- Verifique se a segmentação weka trainável está disponível em Plugins | Segmentação | Segmentação de Weka trainável.
- Solte a imagem na barra de ferramentas ImageJ. Clique em Imagem | Cor | Canais divididos. Uma imagem com DAPI em azul manchando todos os núcleos aparecerá e 1 imagem com β-actin em verde aparecerá, o que delineia o glomeruli.
- Crie um arquivo mesclado das imagens únicas para desenhar uma região de interesse (ROI) para o glomerulus clicando em Color | Canais de mesclagem. Uma caixa pop-up pedirá para atribuir uma cor a cada canal. Depois de atribuir a cada canal uma cor, marque a caixa Criar composto e a caixa Manter imagens de origem e clique em Ok. Uma imagem composta mesclada aparecerá.
- Usando a coloração β-actin como guia, desenhe um ROI em torno do tufo glomerular. Mantenha esta imagem de lado para usar o ROI no final deste protocolo.
- Execute um borrão gaussiano na imagem DAPI azul única. Clique em Processo | Filtros | Gaussian Blur,coloque em 1-2.00. A imagem agora parecerá um pouco desfocada, mas os núcleos agora estão lisos e o fundo suavizado.
NOTA: Esta etapa é pré-formada para remover ruídos para limpar a imagem de artefatos que podem impedir a detecção relevante de atributos de imagem a serem analisados. - Clique em Plugins | Segmentação | Segmentação de Weka trainável.
- Usando a ferramenta de linha na barra de ferramentas no ImageJ, primeiro rastreie núcleos intactos usando as ferramentas manuais livres (há opções de ferramentas de linha, circular e quadradas disponíveis para escolher) e, em seguida, adicione à caixa Classe 1.
- Usando a ferramenta de linha na barra de ferramentas no ImageJ delineie áreas de fundo para a caixa classe 2.
- Clique no rótulo de botão Criar nova classe na janela de segmentação Weka e rotular "ecDNA". Use a ferramenta de linha (da barra de ferramentas ImageJ) para delinear dna extranuclear manchado pelo DAPI.
- Clique no botão Train Classifier no menu de treinamento na janela de segmentação weka treinar.
NOTA: O botão STOP aparecerá no lugar do botão Classificador de Trem e permanecerá até que o treinamento tenha terminado. Não clique neste botão durante o treinamento, pois o processo será interrompido. - Clique no botão Criar resultado para criar uma imagem com todos os componentes classificados, consistindo de núcleos intactos, o fundo e ecDNA identificados.
- Clique no botão Obter probabilidade. Alterne o mouse para dar uma imagem em preto e branco de todas as classes com o objeto de seleção destacado em branco.
- Duplicar esta imagem clicando em Imagem | Duplicata.
- Alterne para a tela usando o botão do mouse que contém o ecDNA. Aplique um limiar para obter apenas o que foi identificado como ecDNA. Clique em Aplicar quando o limiar for suficiente.
- Se após o limiar, houver mais áreas de DNA que não são ecDNA, retornar à imagem original treinada, adicionar mais classificadores e repetir as etapas 2.1-2.13.
- Clique em Imagem | Ajuste de imagem | Faça binário. Copie o ROI glomerular feito na etapa 2.3 e clique em Ctrl+Shift+E. Ativar a janela Weka por Editar | Seleções | Restaurar,que restaura a seleção. Clique em Analisar partículas, que irá medir apenas as partículas de ecDNA dentro do glomerulus.
NOTA: Uma folha de resultado é calculada com a contagem de partículas, a área, médias de pixels e a porcentagem do glomerulus contendo ecDNA. Esses resultados podem ser exportados para uma planilha e salvos, para análise estatística posterior. - Salve o classificador como ecDNA.classifier clicando em Salvar classificador no menu de opções no aplicativo ImageJ na área de trabalho. Em seguida, clique em Salvar dados do menu de opções e salvar como ecDNA.arff na pasta ImageJ. O ROI terá que ser adicionado manualmente cada vez, pois o tamanho e a forma glomerulus mudarão, no entanto o programa aprendeu o que é ecDNA.
- Para reaplicar o modelo às imagens subsequentes, repita as etapas 2.1-2.5 com uma nova imagem. Clique em Carregar classificador no menu de opções e, em seguida, ecDNAmodel.classifier na pasta ImageJ a partir da etapa 2.16. O menu de registro aparecerá e executará o modelo.
- Uma vez executado o modelo, clique em Dados de carga no menu de opções e selecione o arquivo ecDNA.arff salvo na pasta ImageJ a partir da etapa 2.16. Clique em Criar Resultado. Se a imagem resultante não conseguiu captar todos os núcleos, fundo ou ecDNA clique no classificador de re-trem e adicione mais classificadores e salve o novo modelo. Complete o processo de análise repetindo as etapas 2.9-2.16.
NOTA: Várias imagens podem ser usadas para gerar o modelo final usado para detectar ecDNA. Isso é conseguido aplicando o modelo às imagens subsequentes, adicionando mais classificadores e salvando o novo modelo e dados na pasta ImageJ. Isso pode ser particularmente importante quando diferentes amostras têm maior fundo. O programa de segmentação Weka também é compatível com a linguagem macro ImageJ, que permite que muitos dos comandos sejam macro-graváveis para automatizar algumas das etapas.
3. Medição de armadilhas extracelulares de neutrófilos e ecMPO
NOTA: Este método identifica nets por colocalização de DNA extracelular, Histones citrulliados peptidyl arginase 4 (PAD4) e MPO.
- Induzir um modelo de 20 dias de glomerulonephritis anti-mieloperoxidase (anti-MPO-GN) em camundongos C57/Bl6 de 8-10 semanas de idade, com controles9.
- Eutanize ratos humanamente usando uma câmara de CO2.
- Remova os rins fazendo uma incisão anterior da linha média através da pele com uma tesoura, e, em seguida, corte cuidadosamente o peritônio e pino de volta em uma placa de dissecção. O uso de fórceps afasta a fáscia renal anterior e o peritônio parietal e corta o rim livre, cortando o ureter e os vasos sanguíneos (artéria renal e veia) na pelve renal. Remova com fórceps e corte os rins ao meio (plano sagital) com um bisturi tamanho 22.
- Coloque o rim em formalina fixa (4% tamponada) durante 16 horas em temperatura ambiente (RT). Remova e mergulhe o rim fixo em 30% de etanol durante 24 horas antes do processamento.
- Processar rins usando um ciclo padrão de 6 horas:
70% de etanol por 15 min
90% de etanol por 15 min
100% etanol por 15 min
100% etanol por 20 min
100% etanol por 25 min
100% etanol por 30 min
Xileno por 20 min
Xileno por 30 min
Xileno por 40 min
Cera por 30 min
Cera por 35 min
Cera por 40 min
NOTA: Os rins não devem ser submetidos à exposição prolongada ao calor na cera, pois podem destruir antígenos de interesse. - Corte seções de 3 μm em um microtome e monte em lâminas de microscópio de vidro disponíveis comercialmente revestidas com uma carga positiva. Deixe secar durante a noite
- Coloque lâminas de vidro em um rack de deslizamento em um forno de 60 °C por 60 min.
NOTA: As etapas 3.3-3.4 são cruciais para garantir que as seções não flutuem durante a etapa de recuperação de antígenos. - Mergulhe slides em duas mudanças de solvente (xileno ou substituto) por 40 minutos cada, em um capô de fumaça.
- O reidrato desliza em 100% etanol, 100% etanol, 70% etanol por 5 min cada.
- Lave por 5 minutos na água da torneira.
- Coloque uma placa quente em um capô de fumaça e solução de recuperação de antígeno pré-loil (10 mM Tris-1 mM EDTA pH 9.0) em uma panela de pressão. Assim que a solução de recuperação de antígeno começar a ferver coloque os slides na panela horizontalmente usando um par de pinças e bloqueie a tampa. Ferva em alta (equivalente a 15 psi ou 103 kPa) por 10 min.
NOTA: Esta etapa recupera o antígeno de interesse ao desmascarar o epítope de antígeno (transversal por fixação de formalina) para permitir que o anticorpo epitope específico vincule a posterior coloração não funcionará sem esta etapa. - Remova a panela de pressão do fogo e remova a tampa imediatamente, executando a torneira fria em cima da tampa em uma pia. Deixe slides para equilibrar por 20 minutos na solução de recuperação de antígeno.
- Lave lâminas duas vezes por 5 min em salina tamponada de fosfato (PBS) (pH 7,4, 0,01 M) em um agitador orbital.
- Use uma caneta hidrofóbica para desenhar círculos ao redor do tecido renal, tomando cuidado para não deixar nenhum tecido secar neste tempo.
- Bloqueie tecido em 10% sera de frango em 5% de gêrina bovina albumina (BSA)/PBS (pH 7.4, 0,01 M) por 30 min, 60 μL por seção. Não lave após esta etapa, mas remova cuidadosamente a solução de bloqueio usando uma pipeta de 60 μL. Não deixe as seções secarem.
- Faça um coquetel dos anticorpos primários diluídos em 1%BSA/PBS (pH 7,4, 0,01 M) em 1 tubo. Aplique 60 μL por seções renais. A concentração dos anticorpos primários é a seguinte:
Coelho anti-humano/rato H3Cit 1/100
Mouse anti humano/mouse PAD4 1/50
Cabra anti-humano/rato MPO 1/200 - Incubar durante a noite a 4 °C em uma câmara de umidade.
- Lave lâminas duas vezes por 5 min em PBS (pH 7,4, 0,01 M) em um agitador orbital.
- Faça um coquetel dos anticorpos secundários em um tubo. Anticorpos secundários são aplicados em 1% BSA/PBS, 60 μL por seção da seguinte forma:
Frango anti coelho 488 1/200.
Frango anti-rato 647 1/200.
Frango anti cabra 594 1/200. - Incubar na RT por 40 min.
- Lave lâminas duas vezes por 5 min em PBS (pH 7,4, 0,01 M) em um agitador orbital.
- Aplique anticorpo secundário 1.200 em 1%BSA/PBS (pH 7.4, 0,01 M) para 40 min a RT 60 μL por seção.
- Lave lâminas duas vezes por 5 min em PBS (pH 7,4, 0,01 M) em um agitador orbital.
- Mergulhe em 0,3% Sudão Preto em 70% etanol por 30 min.
- Lave lâminas na água da torneira para remover precipitados e, em seguida, mergulhe em PBS (pH 7.4, 0,01 M) por 10 minutos para evitar que mais precipitado Sudão Preto se forme.
- Monte slides em tampas de vidro confocal usando três gotas de 60 μL de solução de montagem com DAPI. Sele as tampas com esmalte aplicando ao redor do perímetro da mancha de cobertura.
- Deixe os slides curarem por 24 horas no RT (para permitir que o DAPI penetrá-lo) e, em seguida, armazene a 4 °C protegido da luz. Mantenha-se no escuro para evitar o desbotamento de sondas fluorescentes.
- Slides de imagem usando uma cabeça de varredura a laser confocal presa a um microscópio. Excite slides com o laser 405 para DAPI e o Laser 488 para H3Cit, 561 para MPO e 647 para PAD4. Capture imagens de plano único 1024x1024 pixels usando captura sequencial de linha e média de 4 linhas que é essencial para detectar ecDNA. Use um objetivo de óleo 40x 1.0 NA. Imagem mínima de 20 glomeruli por amostra. Salvar imagens como arquivos ND2.
4. Armadilhas extracelulares de neutrófilos e análise ecMPO
- Instalar ImageJ: https://imagej.net/Fiji/Downloads.
- Verifique se a segmentação weka trainável está disponível em Plugins | Segmentação | Segmentação de Weka trainável.
- Deixe a imagem no ImageJ. Clique em Imagem | Cor | Canais divididos. Uma imagem com DAPI em azul manchando todos os núcleos aparecerá, uma imagem com H3Cit em verde, uma imagem com MPO em vermelho e uma imagem com PAD4 em branco aparecerão.
- Crie um arquivo mesclado das imagens únicas para desenhar um ROI para o glomerulus clicando em Color | Canais de mesclagem. Uma caixa pop-up pedirá para atribuir uma cor a cada canal. Depois de atribuir a cada canal uma cor, marque a caixa Criar composto e a caixa Manter imagens de origem e clique em Ok. Uma imagem mesclada aparece. Ao contrário do protocolo para ecDNA anteriormente, usaremos a imagem composta para executar o resto das etapas.
- Realize um borrão gaussiano na imagem composta. Isso permite suavizar os núcleos. Clique em Processo | Filtros | Gaussian Blur,coloque em 1.00-2.00. A imagem agora parecerá um pouco desfocada, mas os núcleos agora estão lisos e o fundo suavizado.
NOTA: Esta etapa é pré-formada para remover ruídos para limpar a imagem de artefatos que podem impedir a detecção relevante de atributos de imagem a serem analisados. - Clique em Plugins | Segmentação | Segmentação de Weka trainável. Uma nova janela aparecerá com a imagem a ser analisada e ferramentas específicas de menu de segmentação weka.
- Usando a ferramenta de linha na barra de ferramentas (em ImageJ), primeiro rastreie em torno de núcleos intactos não positivos para todos os 4 componentes NET (MPO, PAD4, DAPI e H3Cit) usando a ferramenta manual gratuita e, em seguida, adicione à caixa Adicionar Classe 1.
- Usando a ferramenta de linha na barra de ferramentas ImageJ delineia áreas de fundo para a caixa Classe 2.
- Clique no rótulo de botão Criar nova classe no menu de rótulos e rotular "NETs". Use a ferramenta de linha para delinear nets identificados como DAPI de co-localização (azul), MPO (vermelho), PAD4 (branco) e histonas citrumeladas (verde).
- Clique no rótulo de botão Criar nova classe no menu de rótulos e rotular "ecMPO". Use a ferramenta de linha para delinear MPO (vermelho) que é livre de células.
- Clique no botão Classificador de trem no menu de treinamento na janela Segmentação Trainable Weka.
NOTA: O botão STOP aparecerá no lugar do botão Classificador de Trem e permanecerá até que o treinamento tenha terminado. Não clique neste botão durante o treinamento e o processo será interrompido. - Clique no botão Criar resultado no menu de treinamento e uma imagem é criada com todos os componentes classificados, consistindo de núcleos intactos, o fundo e o que foi identificado como ecMPO.
- Clique no botão Obter probabilidade no menu de treinamento. Alterne o mouse para dar uma imagem em preto e branco de todas as classes com o objeto de seleção destacado em branco.
- Duplicar tanto a probabilidade NET quanto a imagem de probabilidade ecMPO clicando em Imagem | Duplicata.
- Alterne para a tela usando o botão do mouse que contém NETs. Aplique um limiar para garantir apenas o destaque dos NETs identificados. Na barra de ferramentas do menu ImageJ, clique em Imagem | Ajuste | Limiar. Mova as barras de alternação deslizantes até que os componentes NET sejam destacados. Clique em Aplicar quando estiver satisfeito com o limiar. Repita os mesmos passos para ecMPO.
- Se após o limiar ainda houver áreas de detecção de ecMPO ou NETs, volte à imagem original treinada e adicione mais classificadores e reaplique as etapas 4.1-4.14.
- Clique em Imagem | Ajuste de imagem | Faça binário. Copie o ROI glomerular feito na etapa 4.3, clique em Ctrl+Shift+E. Ativar janela Weka por Editar | Seleções | Restaurar,que restaura a seleção. Clique em Analisar partículas para medir apenas as partículas NET dentro do glomerulus.
- Alterne para a tela usando o botão do mouse que contém ecMPO. Aplique um limiar para garantir que apenas o ecMPO identificado seja obtido. Clique em Aplicar quando estiver satisfeito com o limiar. Repita o passo 4.16 acima.
NOTA: Uma folha de resultados é calculada com a Contagem de partículas, a área, médias de pixels e a porcentagem do glomerulus contendo nets e ecMPO. Esses resultados podem então ser colocados em uma planilha e salvos, para análise estatística posterior. - Salve o classificador como NETs.classifier clicando em Salvar classificador no menu de opções e salvar arquivo no aplicativo ImageJ na pasta desktop (ImageJ). Em seguida, clique em Salvar dados do menu de opções e salvar como arquivo NETs.arff. O ROI glomerular terá que ser adicionado manualmente cada vez, pois o tamanho e a forma glomerulus mudarão, mas o programa aprendeu quais são os NETs e o ecMPO.
- Para reaplicar o modelo às imagens subsequentes, repita as etapas 4.1-4.5 com uma nova imagem. Clique em Carregar classificador no menu de opções. Clique em Nets.classifier na pasta ImageJ. O menu de registro aparecerá e executará o modelo, uma vez que o modelo tenha sido executado clique em Dados de carga no menu de opções e selecione o arquivo NETs.arff.
- Clique em Criar Resultado. Se a imagem resultante não conseguiu captar todos os núcleos, fundo ou ecDNA clique no classificador de re-trem e adicione mais classificadores e salve o novo modelo. Complete o processo de análise repetindo as etapas 4.11-4.19.
NOTA: Várias imagens podem ser usadas para gerar o modelo final usado para detectar ecDNA, ecMPO e NETs. Isso é conseguido aplicando o modelo às imagens subsequentes, adicionando mais classificadores e salvando o novo modelo e dados na pasta ImageJ. Isso pode ser particularmente importante quando diferentes amostras têm maior fundo. O programa de segmentação Weka é compatível com a linguagem macro ImageJ, que permite que muitos dos comandos sejam macro graváveis para automatizar algumas das etapas.
- Clique em Criar Resultado. Se a imagem resultante não conseguiu captar todos os núcleos, fundo ou ecDNA clique no classificador de re-trem e adicione mais classificadores e salve o novo modelo. Complete o processo de análise repetindo as etapas 4.11-4.19.
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Representative Results
Essas imagens representam as múltiplas etapas necessárias para usar com sucesso a segmentação de Weka treinar para minimizar a medição manual intensiva de ecDNA em tecido renal FFPE manchado fluorescentemente de um rato com GN anti-MPO induzido. Essas etapas são resumidas na Figura 1 e Figura 2 com imagens tiradas diretamente do programa de segmentação Weka, delineando cada etapa do processo de análise. As medições desta análise são então mostradas na Figura 3 demonstrando a capacidade do programa de determinar as diferentes quantidades de ecDNA depositadas no glomerulus, no tecido de controle, sem induzida anti MPO GN. A Figura 4 demonstra que o modelo de ecDNA pode ser adaptado para identificar ecDNA em amostras de biópsia renal de um paciente de controle (pacientes com Doença de Mudança Mínima têm dano glomerular mínimo evidente em nível histológico) e comparado com o de uma biópsia renal de um paciente com MPO-AAV. A Figura 5 demonstra a capacidade translacional deste programa para outras manchas dentro do tecido renal. Usamos uma amostra representativa de um rim de rato com induzido anti-MPO GN experimental para colorir para NETs e ecMPO. O programa de segmentação weka capacitável é então usado para identificar tanto NETS quanto ecMPO dentro da mesma imagem. A Figura 6 demonstra que não há diferença significativa no resultado dos resultados na quantidade de quantificação de ecDNA no mesmo conjunto de dados analisado por dois usuários independentes criando 2 modelos diferentes projetados para semi-quantitar o ecDNA.
Figura 1: Imagens que ilustram a classificação de núcleos, fundo e DNA extracelular dentro do glomeruli renal do rato a partir do EXPERIMENTAL MPO-ANCA GN usando segmentação weka trainável. (A) Demonstra imagens de canal único de DAPI para coloração de DNA (azul), β actin (verde) para delinear área glomerular, e o arquivo composto com uma região de interesse (ROI) indicando a área glomerular a ser medida. (B) Classificação de núcleos intactos para desenvolver o modelo (rosa) e núcleos não classificados (azul). (C) Classificação do que é considerado de fundo (verde). (D) Classificação do que é considerado ecDNA (roxo). (E) O modelo gerado pela segmentação weka trainável mostrando núcleos em vermelho, fundo na área verde e ecDNA em roxo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Imagens que demonstram o componente supervisionado do modelo para reduzir a imprecisão. O modelo Weka gera a probabilidade de reconhecer cada classificador em componentes não classificados. (A) Modelo gerado classificação do que são núcleos intactos. (B) Modelo gerado classificação do que é considerado fundo. (C) Geração de modelo do que o ecDNA é considerado. (D) Ilustra a imagem de ecDNA classificado sem retenção. (E) Mostra o ajuste do limiar para excluir quaisquer erros no que foi identificado como ecDNA, identificado ecDNA mostrado em vermelho. (F) O limiar é aplicado à imagem e transformado em uma imagem binária para análise de partículas. (G) O ROI glomerular é sobreposto à imagem para que apenas o ecDNA glomerular seja analisado. (H) Mostra o resumo dos resultados gerados a partir da análise. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Imagens que ilustram a classificação de núcleos, fundo e DNA extracelular dentro de glomeruli renal de camundongos de um rato de controle sem induzida mpo-ANCA GN experimental usando segmentação weka trainável. (A) Mostra a imagem original mesclada com a região glomerular a ser analisada, o treinamento e o resultado do modelo treinado (verde fundo, núcleos vermelhos e ecDNA identificados em roxo. (B) Mostra as probabilidades do modelo de identificação, núcleos, fundo e ecDNA. (C) Resultados do que o modelo classificou e identificou como ecDNA, exibido em unidades arbitrárias. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: A imagem que ilustra a segmentação de Weka é adaptável para a análise de ecDNA em biópsias renais humanas de um paciente com doença de mudança mínima e um paciente com vasculite MPO-ANCA. (A) Ilustra que o ecDNA mínimo é detectado usando núcleos intactos de segmentação weka traináveis (vermelho), fundo (verde) e ecDNA (roxo). (B) Demonstra quantidades consideráveis de ecDNA em uma biópsia renal paciente de um paciente com vasculite MPO-ANCA núcleos intactos (vermelho), fundo (verde) e roxo ecDNA. Os resultados demonstram que 8 partículas de ecDNA foram encontradas na região glomerular de um paciente com MCD em comparação com um paciente com vasculite MPO ANCA ativa (180 partículas). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: A segmentação de Weka treinável pode ser usada para identificar NETS e ecMPO dentro da mesma imagem e análise de modelo, no tecido renal do camundongo do EXPERIMENTAL MPO-ANCA GN. (A) Demonstra um glomerulus com NETs [co-localização de verde (Histona Citrullinate 3), DAPI vermelho (MPO) (núcleos) e PAD4 (branco)]. ecMPO é considerado livre de células. (B) Treinamento para identificação dos classificadores, Vermelho (Núcleos Intactos), Verde (fundo), Roxo (NETs) e amarelo (ecDNA)]. (C) O modelo de segmentação weka treina para classificar NETs e ecMPO, vermelho (núcleos intactos), verde (fundo), roxo (NETs) e amarelo (ecDNA). (D) Análise de partículas do que o modelo determinou ser NETs. (E) Análise de partículas do que o modelo determinou ser ecMPO. (F) Folha de resultados da análise de partículas tanto para NETs quanto para ecDNA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Comparação de 2 usuários independentes na concepção de um modelo para detecção de ecDNA. (A) Imagem original mostrando as imagens DAPI, Beta Actin e Merged a serem analisadas. (B) Comparação do modelo de treinamento, classificadores, limiar e ROI glomerular entre 2 usuários independentes. A seta amarela indica que o Usuário 2 teve que retreinar o modelo para remover o fundo. (C) Resultados gerados mostrando a comparação da contagem de ecDNA, área total, % área e perímetro, entre 2 usuários. (D) Gráfico de resultados não mostrando diferença significativa entre o número de ecDNA detectado na área glomeruli e % de dois investigadores independentes. Análise estatística realizada utilizando-se o teste De Mann-Whitney U com significância definida em <0,05. O tamanho da amostra é n=6. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Existem protocolos múltiplos que medem marcadores proinflamatórios no soro e urina de ambos os pacientes e modelos de camundongos de glomerulonephritis. Este protocolo descrito permite a análise dos produtos de morte celular (ecDNA, NETs e ecMPO) dentro do glomerulus diretamente. Os passos mais cruciais neste protocolo são a preparação e a imagem do tecido. O principal elemento restritivo do uso de um método de coloração fluorescente para análise é a autofluorescência tecidual. O tecido de parafina fixa formalina está sujeito a autofluorescência que pode obscurecer manchas fluorescentes específicas. O passo final no método de coloração onde os slides estão imersos no preto do Sudão, atenua a autofluorescência do tecido, e permite a iluminação do anticorpo específico de coloração através da redução do sinal para a razão de ruído19. A imagem do tecido deve ser realizada com pelo menos 40x de ampliação de óleo para ser capaz de detectar fragmentos menores de ecDNA e MPO. Quando a imagem é adquirida, é crucial que seja feita de forma sequencial de linha para garantir que não haja sangramento através da fluorescência de um marcador para outro.
Uma vantagem do protocolo para análise é que ele está disponível em acesso aberto através do ImageJ para quem acessar16. Demonstramos aqui que o método pode ser facilmente adaptado para medir diferentes marcadores fluorescentes dentro do tecido renal. Uma vez determinado o modelo na segmentação de Weka, pode ser aplicado a imagens subsequentes sem viés e exatamente da mesma maneira que cada imagem foi analisada. A natureza supervisionada da análise permite que qualquer erro na segmentação seja ajustado através das etapas adicionais de limiar das imagens "treinadas" ou retreinamento do programa e adição de mais classificadores. A vantagem deste programa é que dois usuários diferentes obterão resultado semelhante usando o mesmo modelo, desde que delineiem com precisão o tufo glomerular. A maior imprecisão na reprodutibilidade por dois usuários finais diferentes é criada pela maneira diferente em que as pessoas traçam em torno do tufo glomerular. Por exemplo, se uma pessoa desenha um círculo áspero em torno do tufo glomerular e outro usuário cuidadosamente desenha em torno dos loops capilares mais externos a área que está sendo examinada difere (como demonstrado nos resultados). Portanto, é essencial que ambos os usuários sejam treinados para identificar o tufo glomerular de forma idêntica. A aplicação prática deste programa seria que dois usuários projetassem o modelo juntos em várias imagens para construir um modelo robusto a ser aplicado a outros conjuntos de dados. Quanto mais imagens forem usadas para treinar os classificadores, mais preciso será o modelo.
Limitações deste protocolo seriam a medição de fragmentos de ecDNA menores do que o microscópio confocal pode detectar. Isso poderia ser superado com o uso de imagens captura usando métodos de microscopia de super resolução e aplicando a segmentação de Weka trainável a essas imagens. O componente supervisionado do aprendizado de máquina adiciona etapas extras e reduz a capacidade de processar grandes conjuntos de imagens em lote. No entanto, como demonstramos nos resultados modelos não supervisionados têm reduzido a precisão e introduzindo o componente supervisionado reduziu significativamente a imprecisão.
Publicamos anteriormente que, além de neutrófilos produzindo armadilhas extracelulares, monócitos/macrófagos também foram observados para produzir armadilhas extracelulares (denominadas METs) em vasculite ANCA humana, mas em proporções menores1. Os métodos atuais descritos aqui não distinguem,entre armadilhas extracelulares produzidas por neutrófilos ou monócitos/macrófagos. Isso é difícil de alcançar, pois a maioria dos microscópios confocal são limitados pelo número de lasers. A identificação de NETs requer 4 lasers diferentes, limitando, portanto, o número de marcadores celulares capazes de ser processados através de imagens confocal padrão. Se a célula positiva mpo de origem for necessária uma segunda seção serial pode ser manchada com um neutrófilo ou marcador de macrófago/monócito, para identificar o tipo de célula que produz a armadilha extracelular.
Características patológicas da vasculite MPO-ANCA incluem a deposição de ecDNA, NETS e ecMPO dentro do glomeruli do rim20. Tericamente visando o DNA dentro dos NETs e ecMPO, bem como medi-los em biópsias humanas como marcadores da doença tem sido objeto de estudos recentes1,,20,21,22. A significância desses métodos neste campo é determinar com precisão a proporção relativa de ecDNA, NETs e ecMPO dentro do órgão alvo, de forma reprodutível e menos demorada. Em conclusão, demonstramos uma ferramenta supervisionada de aprendizagem de máquina capacitada pela segmentação Weka para semi automatizar a análise de grandes conjuntos de dados de imagens adquiridas para ecDNA, NETs e ecMPO. O uso desta ferramenta reduzirá consideravelmente o tempo de análise da imagem e as técnicas podem ser facilmente adaptadas a outras manchas em outros órgãos.
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Disclosures
Nada para revelar.
Acknowledgments
Reconhecemos a Monash Micro Imaging pelo uso do microscópio de varredura a laser confocal Nikon C1 e da Plataforma de Histologia Monash para o processamento do tecido renal.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A2153 | 5% and 1% solutions are made up in PBS, can be made in bulk and frozen- discard once thawed. |
| Chicken anti Goat IgG (H+L) cross absorbed antibody Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-21468 | Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail |
| Chicken anti mouse IgG (H+L) cross absorbed antibody, Alex Fluor 647 | ThermoFisher Scientific | A-121468 | Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail |
| Chicken anti rabbit IgG (H+L) Cross absorbed antibody Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-21441 | Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail |
| Chicken sera | SIGMA | C5405 | Made up in 1%BSA/PBS |
| Coverslips 24 x60 mm | Azerscientific | ES0107222 | #1.5 This is not standard thickness- designed for use in confocal microscopy |
| EDTA 10mM | SIGMA | E6758 | Add TRIS and EDTA together in distilled water and pH to 9, for antigen retrieval, can be made up in a 10x Solution |
| Ethanol 30%, 70% and 100% | Chem Supply | UN1170 | Supplied as 100% undenatured ethanol- dilute to 30% and 70% using distilled water |
| Formaldehyde, 4% (10% Neutral buffered Formalin) | TRAJAN | NBF-500 | Kidney is put into a 5ml tube containing 3ml of formalin for 16 hours at RT, formalin should be used in a fume hood |
| Glass histology slides- Ultra Super Frost, Menzel Glaze, 25x75 x1.0mm | TRAJAN | J3800AM4 | Using positive charged coated slides is essential. We do not recommend using poly-L-lysine for coating slides as tissue dislodges from slides during the antigen retrieval step |
| Goat anti human/mouse MPO antibody | R&D | AF3667 | Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival |
| Histosol | Clini Pure | CPL HISTOSOL 08 | Used neat, in 200ml staining rack containers, use in a fume hood |
| Hydrophobic pen | VECTOR Labs | H-400 | Use to draw circle around kidney tissue |
| Mouse anti human/mouse Peptidyl arginase 4 (PAD4) | ABCAM | ab128086 | Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival |
| Nikon C1 confocal scanning laser head attached to Nikon Ti-E inverted Microscope | Coherent Scientific | Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival | |
| Phosphate Buffered Saline | SIGMA | P38135 | 0.01M PB/0.09% NaCl Make up 5L at a time |
| Pressure Cooker 6L Tefal secure 5 Neo stainless | Tefal | GSA-P2530738 | Purchased at local homeware store |
| Prolong Gold DAPI | Life Technologies | P36962 | Apply drops directly to coverslip |
| Rabbit anti human/mouse Beta Actin antibody | ABCAM | ab8227 | Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival |
| Rabbit anti human/mouse H3Cit antibody | ABCAM | ab5103 | Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival |
| Staining rack 24 slides | ProScitech | H4465 | Staining rack chosen has to be able to withstand boiling under pressure and incubation in 60 degree oven |
| Sudan Black B | SIGMA | 199664 | 0.3% Add 3g to a 1L bottle in 70% Ethanol, filter and protect from the light- stable for 6 months at room temperature |
| Tris 10mM | SIGMA | T4661 | Add TRIS and EDTA together in distilled water and pH to 9, for antigen retrieval, can be made up in a 10x solution |
| Xylene | Trajan | XL005/20 | Must be use used in a fume hood |
References
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