Summary

포토컨버터블 덴드라2를 사용하여 노화 C. 엘레간스의 단백질 회전율의 생체 내 정량화

Published: June 13, 2020
doi:

Summary

여기에 제시된 단백질 헌팅틴의 분해를 광변환형 형광소 덴드라2에 융합한 분해를 모니터링하는 프로토콜이 있다.

Abstract

단백질은 항상성을 유지하기 위해 세포 내에서 지속적으로 합성되고 저하됩니다. 관심 있는 단백질의 저하를 모니터링할 수 있다는 것은 수명 주기뿐만 아니라 프로테오스타증 네트워크의 불균형을 발견하는 데 핵심적인 역할을 합니다. 이 방법은 질병을 유발하는 단백질 헌팅틴의 분해를 추적하는 방법을 보여줍니다. 덴드라2에 융합된 헌팅틴의 두 가지 버전은 C. elegans 신경계에 표현됩니다: 생리적 버전 또는 글루타민의 확장되고 병원성 스트레칭이 있는 것. 덴드라2는 광변환형광단백질; 짧은 자외선(UV) 조사 펄스에 따라 Dendra2는 초록색에서 빨간색으로 여기/방출 스펙트럼을 전환합니다. 펄스-체이스 실험과 유사하게, 새로 합성된 그린 덴드라2의 간섭에 관계없이 변환된 적색-덴드라2의 회전율을 모니터링하고 정량화할 수 있다. 공초점 기반 현미경 검사법을 사용하고 C. elegans의광학 적 투명성으로 인해 살아있는 노화 유기체에서 헌팅틴 덴드라2의 분해를 모니터링하고 정량화 할 수 있습니다. 뉴런 헌팅틴-덴드라2는 변환 직후 부분적으로 저하되고 시간이 지남에 따라 더 지워집니다. 돌연변이 헌팅틴의 존재가 부족하고 노화가 더욱 손상됩니다. 같은 신경계 내의 신경 아류형은 헌팅틴-덴드라2에 대해 서로 다른 회전율을 나타낸다. 전반적으로 Dendra2에 융합된 관심 있는 단백질을 모니터링하면 그 성능 저하및 프로테오스타증 네트워크의 플레이어뿐만 아니라 위치, 인신 매매 및 운송에 대한 중요한 정보를 제공할 수 있습니다.

Introduction

살아있는 유기체의 프로테아메는 끊임없이 자신을 갱신하고 있습니다. 단백질은 세포의 생리적 요구에 따라 지속적으로 분해되고 합성됩니다. 몇몇 단백질은 빨리 제거됩니다, 그 외는 더 오래 살아있는 반면. 단백질 역학을 모니터링하는 것은 유전자 인코딩형 형광 단백질(FPs)을 사용할 때 더 간단하고 정확하며 덜 침습적인 작업입니다. FPs는 자가촉매를 형성하고 관심있는 단백질 (POI)에 융합 될 수 있지만 산소1을위해 보조 인자를 구하거나 필요로하는 효소를 필요로하지 않습니다. 새로운 세대의 FP는 최근에 결정된 파장의 가벼운 펄스로 조사 시 색상을 전환하도록 설계되었습니다. 이러한 포토액티브ApP(PAFP)는 POI, 또는 그들이 거주하는 세포기관 또는 세포의 라벨링 및 추적을 허용하고, 그들의 정량적 및/또는 질적 파라미터2를검사한다. FP는 POI의 움직임, 방향성, 운동 속도, 확산 계수, 모바일 대 움직이지 않는 분수, 한 셀룰러 컴파트먼트에 거주하는 시간, 회전율을 추적할 수 있게 합니다. 특정 소기관, 운동 및 수송, 또는 핵분열 및 융합 이벤트를 결정할 수 있다. 특정 셀 타입의 경우 셀의 위치, 분할 속도, 부피 및 형상을 확립할 수 있습니다. 결정적으로, PAFP를 사용하면 연속 시각화 없이 새로 합성된 프로브의 간섭 없이 추적할 수 있습니다. 세포와 전체 유기체 에서 모두 연구 결과는 성공적으로 암과 전이의 발달, 세포 골격의 조립 또는 분해, 및 RNA-DNA/단백질 상호 작용3과같은 생체 내생물학적 질문을 해결하기 위하여 PAFPs를 채택했습니다. 이 원고에서, 가벼운 현미경 검사법과 PAFPs는 신경 퇴행성 질병의 C. elegans 모형에 있는 생체내에서 응집되기 쉬운 단백질 헌팅틴 (HTT)의 회전율을 밝히기 위하여 이용됩니다.

여기서 설명된 프로토콜은 융합 단백질 헌팅틴-덴드라2(HTT-D2)의 안정성과 분해를 정량화한다. Dendra2는 UV 또는 가시광선에 대한 응답으로 방출/여기 스펙트럼을 녹색에서 빨간색으로 돌이킬 수 없이 전환하는 2세대 단황 PAFP4로, 최대 4,000배5,,6의강도가 증가한다. 헌팅틴은 치명적인 유전성 신경 퇴행성 질환인 헌팅턴병(헌팅턴병)을 유발하는 단백질이다. 헌팅틴 엑슨-1에는 글루타민(CAG, Q)이 들어 있습니다. 단백질이 39Q 이상으로 표현되면 돌연변이, 독성 및 병원성 단백질로 잘못 접습니다. 돌연변이 HTT는 응집되기 쉽고 짧은 올리고머 종또는 더 큰 고도로 구조화 된 아밀로이드7로뉴런 세포 죽음과 변성으로 이어집니다.

선충은 조작의 용이성, 동종 성질, 짧은 수명 및 광학 투명성8덕분에노화와 신경 변성을 연구하기 위한 모델 시스템입니다. 생체 내에서 HTT의 안정성을 연구하기 위해, 융합 구조는 C. elegans의신경계에서 발현되었다. 25Qs(HTTQ25-D2)의 생리적 스트레치 또는 97Q(HTTQ97-D2)의 병리학적 스트레칭을 포함하는 HTT-D2 트랜스진은 선충의 일생동안팬뉴런으로 과발현된다. 라이브 C. elegans를 짧고 집중적인 빛의 지점에 복종시킴으로써 단일 뉴런이 포토전환되고 변환된 HTT-D2는 시간이 지남에 따라 추적됩니다. HTT-D2의 양을 분해하기 위해, 갓 변환된 HTT-D2의 적색 신호 의 차이는 결정된 기간 후에 HTT-D2의 나머지 적신호와 비교된다. 따라서, 헌팅틴이 생리적 형태에 비해 확장되고 독성이 있는 형태로 발견될 때 헌팅틴이 어떻게 저하되는지 조사할 수 있게 된다. 전방 또는 후방 뉴런이 Q97 대 Q25의 존재에 다르게 반응하는 방법, 특히 장기간에 걸쳐; 노화 중 프로테오스타증 네트워크(PN)의 붕괴가 저하율의 차이에 어떻게 기여하는가. 이러한 결과는 HTT-D2의 회전율에 대한 작은 관찰 집합에대해서만 설명합니다. 그러나, 단백질 응집 및 proteostasis의 필드에 관련있는 더 많은 생물학 질문은 생체 응용에서 이것으로 해결될 수 있습니다.

Protocol

1. 뉴런 헌팅틴-덴드라2 융합 단백질을 표현하는 C. 엘레간 세대 기존의 제한 효소다이제스트(10),깁슨 어셈블리(11) 또는 임의의 선택 방법에 의해 선충발발11벡터(즉, pPD95_75, addgene #1494)에서 POI를 코딩하는 유전자를 복제한다. 프로모터를 삽입하여 원하는 조직 또는 원하는 발달 단계에서 발현을 유도합니다. DENdra2 플루오로포어를 POI와 함께 프레임…

Representative Results

광변환 단백질 Dendra2와 함께 프레임에서 헌팅틴 엑슨-1 단백질 단편을 발현하는 두 개의 선충균은 미세 주입을 통해 수득되었고 플라스미드는 엑스트라크로모솜 배열로 유지되었다. 융합 구조는 노화를 통해 개발에서 전체 C. elegans 신경계에서 표현되었다. 여기서, HTT-D2는 생리학적 25폴리글루타민 스트레치(HTTQ25-D2, 도 1A)또는 97글…

Discussion

단백질의 기능을 이해하려면 합성, 위치 및 저하를 이해하는 것이 중요합니다. 소설, 안정적이고 밝은 FP의 개발로 POI를 시각화하고 모니터링하는 것이 더 쉽고 효율적입니다. Dendra2와 같은 유전적으로 발현된 융합 PAFP는 POI의 안정성을 연구하기 위해 독특하게 배치됩니다. 보라색-청색 광에 노출되면 Dendra2는 보존된 아미노산의 삼합체 내에서 정확한 위치에서 휴식을 취합니다. 불소는 작은 구조?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리는 자금 조달을 위해 DFG (KI-1988/5-1 에서 JK, MLP에 대한 우수성의 NeuroCure 클러스터에 의해 NeuroCure 박사 펠로우십)을 인정합니다. 우리는 또한 이미징 세트를 제공하기위한 분자 약리학 베를린 (FMP)에 대한 라이프 니즈 연구소의 이미징 핵심 시설을 인정합니다. 또한, 우리는 실험실에서 Dendra2 시스템을 구축하고 지침을 제공 디오고 펠레치아노 감사합니다.

Materials

Agar-Agar Kobe I Carl Roth GmbH + Co. KG 5210.2 NGM component
Agarose, Universal Grade Bio & Sell GmbH BS20.46.500 Mounting slide component
BD Bacto Peptone BD-Bionsciences 211677 NGM component
Deckgläser-18x18mm Carl Roth GmbH + Co. KG 0657.2 Cover slips
EC Plan-Neufluar 20x/0.50 Ph2 M27 Carl Zeiss AG Objective
Fiji/ImageJ 1.52p NIH Analysis Software
Levamisole Hydrochloride AppliChem GmbH A4341 Anesthetic
LSM710-ConfoCor3 Carl Zeiss AG Laser Scanning Confocal Micoscope
Mounting stereomicroscope Leica Camera AG Mounting microscope
neuronal-HTTQ25-Dendra2 this paper C. elegans strain
neuronal-HTTQ97-Dendra2 this paper C. elegans strain
OP50 Escherichia coli CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC) OP50 Nematode food source
Sodium Chloride Carl Roth GmbH + Co. KG 3957.2 NGM component
Standard-Objektträger Carl Roth GmbH + Co. KG 0656.1 Glass slides
ZEN2010 B SP1 Carl Zeiss AG Confocal acquisition software

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Cite This Article
Pigazzini, M. L., Kirstein, J. In Vivo Quantification of Protein Turnover in Aging C. Elegans using Photoconvertible Dendra2. J. Vis. Exp. (160), e61196, doi:10.3791/61196 (2020).

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