Summary
Apresentado aqui é um protocolo para monitorar a degradação da proteína huntingtin fundida ao fluorohore fotoconvertível Dendra2.
Abstract
As proteínas são sintetizadas e degradadas constantemente dentro de uma célula para manter a homeostase. Ser capaz de monitorar a degradação de uma proteína de interesse é fundamental para entender não apenas seu ciclo de vida, mas também para descobrir desequilíbrios na rede de proteostase. Este método mostra como rastrear a degradação da inseção de proteínas causadoras de doenças. Duas versões de huntingtin fundidas a Dendra2 são expressas no sistema nervoso C. elegans: uma versão fisiológica ou uma com um trecho expandido e patogênico de glutaminas. Dendra2 é uma proteína fluorescente fotoconvertível; após um pulso de irradiação ultravioleta curto (UV), o Dendra2 muda seu espectro de excitação/emissão de verde para vermelho. Semelhante a um experimento de perseguição de pulso, o volume de negócios do Convertido red-Dendra2 pode ser monitorado e quantificado, independentemente da interferência do recém-sintetizado green-Dendra2. Utilizando microscopia baseada em confocal e devido à transparência óptica de C. elegans,é possível monitorar e quantificar a degradação da huntingtin-Dendra2 em um organismo vivo e envelhecido. A caça neuronaltin-Dendra2 é parcialmente degradada logo após a conversão e liberada mais ao longo do tempo. Os sistemas que controlam a degradação são deficientes na presença de caça mutante e são ainda mais prejudicados com o envelhecimento. Subtipos neuronais dentro do mesmo sistema nervoso apresentam diferentes capacidades de rotatividade para huntingtin-Dendra2. No geral, o monitoramento de qualquer proteína de interesse fundida à Dendra2 pode fornecer informações importantes não apenas sobre sua degradação e os atores da rede de proteostase envolvida, mas também sobre sua localização, tráfico e transporte.
Introduction
O proteome de um organismo vivo está constantemente se renovando. As proteínas são continuamente degradadas e sintetizadas de acordo com a demanda fisiológica de uma célula. Algumas proteínas são rapidamente eliminadas, enquanto outras são mais vividas. Monitorar a dinâmica proteica é uma tarefa mais simples, mais precisa e menos invasiva ao usar proteínas fluorescentes geneticamente codificadas (FPs). Os FPs formam-se autocatalyticamente e podem ser fundidos a qualquer proteína de interesse (POI), mas não requerem enzimas para dobrar ou precisam de cofatores para economizar oxigênio1. Uma nova geração de FPs foi recentemente projetada para mudar de cor após a irradiação com um pulso leve de determinado comprimento de onda. Esses FPs fotoativados (PAFPs) permitem a rotulagem e rastreamento de POIs, ou as organelas ou células em que residem, e examinar seus parâmetros quantitativos e/ou qualitativos2. Os FPs possibilitam rastrear qualquer movimento, direcionalidade, taxa de locomoção, coeficiente de difusão, frações móveis versus imóveis, o tempo em que reside em um compartimento celular, bem como sua taxa de rotatividade. Para organelas específicas, podem ser determinadas atividades de locomoção e transporte, ou eventos de fissão e fusão. Para um determinado tipo de célula, a posição de uma célula, a taxa de divisão, o volume e a forma podem ser estabelecidos. Crucialmente, o uso de PAFPs permite o rastreamento sem visualização contínua e sem interferência de qualquer sonda recém-sintetizada. Estudos tanto em células quanto em organismos inteiros têm utilizado com sucesso PAFPs para abordar questões biológicas in vivo, como o desenvolvimento de câncer e metástase, montagem ou desmontagem do citoesqueleto, e interações RNA-DNA/proteína3. Neste manuscrito, microscopia leve e PAFPs são usados para descobrir as taxas de rotatividade da caça de proteínas propensas à agregação (HTT) in vivo em um modelo C. elegans de doença neurodegenerativa.
O protocolo aqui descrito quantifica a estabilidade e a degradação da proteína de fusão huntingtin-Dendra2 (HTT-D2). Dendra2 é um PAFP4 monomédico de segunda geração que muda irreversivelmente seu espectro de emissão/excitação de verde para vermelho em resposta à luz azul UV ou visível, com um aumento em sua intensidade de até 4.000vezes 5,6. Huntingtin é a proteína responsável por causar a doença de Huntington (HD), uma doença neurodegenerativa hereditária fatal. Huntingtin exon-1 contém um trecho de glutaminas (CAG, Q). Quando a proteína é expressa com mais de 39T, ela se dobra em uma proteína mutante, tóxica e patogênica. O HTT mutante é propenso à agregação e leva à morte e degeneração celular neuronal, seja como espécies oligomericas curtas ou como amiloides altamente estruturados7.
O nematoide é um sistema modelo para estudar o envelhecimento e a neurodegeneração graças à sua facilidade de manipulação, natureza isogênica, vida útil curta e sua transparência óptica8. Para estudar a estabilidade do HTT in vivo, uma construção de fusão foi expressa no sistema nervoso de C. elegans. Um transgene HTT-D2 contendo um trecho fisiológico de 25Qs (HTTQ25-D2) ou um trecho patológico de 97Qs (HTTQ97-D2) é superexpresso pan-neuronalmente durante toda a vida do nematodo9. Ao submeter C. elegans ao vivo a um breve e focado ponto de luz, um único neurônio é fotowitched e o HTT-D2 convertido é rastreado ao longo do tempo. Para estabelecer a quantidade de HTT-D2 degradada, a diferença entre o sinal vermelho do HTT-D2 recém-convertido é comparada com o sinal vermelho restante de HTT-D2 após um determinado período de tempo. Portanto, torna-se possível investigar como a cantina é degradada quando encontrada em sua forma expandida e tóxica em comparação com sua forma fisiológica; como os neurônios anteriores ou posteriores respondem de forma diferente à presença do Q97 versus Q25, especialmente em períodos de tempo prolongados; e como o colapso da rede de proteostase (PN) durante o envelhecimento contribui para as diferenças nas taxas de degradação. Estes resultados descrevem apenas um pequeno conjunto de observações sobre o volume de negócios do HTT-D2. No entanto, muitas outras questões biológicas relevantes tanto para o campo da agregação de proteínas quanto para a proteostase podem ser abordadas com essa aplicação in vivo.
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Protocol
1. Geração de C. elegans expressando proteína de fusão Neuronal Huntingtin-Dendra2
- Clone o gene codificando o POI em um vetor de expressão nematoide (ou seja, pPD95_75, Addgene #1494), pela enzima de restrição tradicional digestão10, conjunto Gibson11, ou qualquer método de escolha. Insira um promotor para conduzir a expressão em um tecido desejado ou em um estágio de desenvolvimento desejado. Insira o fluoróforo Dendra2 em n ou C-terminalmente na estrutura com o POI.
- Gerar C. elegans transgênicos expressando o construto de fusão (por exemplo, via microinjeção)12.
NOTA: O plasmídeo que carrega o transgene permanecerá como uma matriz extracromosomal. A integração da construção não é necessária, mas pode ser realizada se desejar13. Neste protocolo, C. elegans foram microinjetados com um plasmídeo carregando a construção de fusão huntingtin exon 1-Dendra2 (HTT-D2) sob o controle do promotor pan-neuronal Prgef-1. A espinha dorsal da expressão C. elegans foi obtida de Kreis et al.14, o garon huntingtin 1 com Q25 ou Q97 foi obtido de Juenemann et al.15, e Dendra2 foi obtido de Hamer et al.16.
2. Correspondência etária e manutenção de C. elegans
- A idade corresponde a todos os nematoides sincronizando com o tratamento da solução alcalina hipoclorito17 ou através de ovo deitado por 4h a 20 °C. Para a colocação de ovos, coloque 10 adultos gravid em uma placa de mídia de crescimento de nematode (NGM) recém-semeada e deixe por 4h antes de remover. Os ovos colocados neste tempo-de-tempo darão origem a nematoides sincronizados.
- Mantenha c. elegans experimentais em placas de mídia de crescimento de nematoide (NGM) semeadas com a fonte de alimento bacteriano E. coli OP50, seguindo a criação padrão de nematoides18.
- Cresça nematoides a 20 °C até o estágio desejado. Para este protocolo, as idades exigidas são dias 4 e 10.
NOTA: Os adultos jovens no dia 4 podem ser identificados pela presença de ovos em suas gôngas e sua alta mobilidade. Os nematoides do dia 10 são pós-férteis, e sofrem deterioração tecidual e declínio da locomotiva19. - Para o dia 10 nematoides, passagem diária após a etapa L4 no dia 3, uma vez que os nematoides são férteis, para evitar uma população mista.
3. Preparação de slides de microscopia para imagem
- Prepare os slides de microscopia no dia da imagem. Em um micro-ondas, derreta o grau geral agarose a uma concentração de 3% (w/v) em ddH2O. Deixe esfriar ligeiramente.
- Corte a ponta de uma ponta de pipeta de 1 mL e aspire cerca de 400 μL de agarose derretida. Coloque delicadamente algumas gotas de agarose em um escorregador de vidro limpo e coloque imediatamente outro slide em cima, certificando-se de que uma fina almofada de agarose seja criada entre os dois. Deixe secar antes de deslizar suavemente ou levantar a parte superior.
- Coloque os slides da almofada agarose em um recipiente umidificado para evitar que eles sequem. Estes podem ser usados dentro de 2-3 h.
NOTA: Evite a formação de pequenas bolhas na ágarose, pois os nematoides podem ficar presos dentro.
4. Definição de parâmetros de microscópio confocal
NOTA: Antes de montar os nematoides e a aquisição de dados, defina todas as configurações do software de aquisição confocal. As configurações podem ser adaptadas ao hardware de imagem e software de escolha.
- Abra o software confocal e defina as configurações de imagem a laser. Defina o caminho de luz para excitação/emissão para Dendra2 verde em 486-553 nm e para Dendra2 vermelho em 580-740 nm. Ajuste a potência e o ganho de ambos os canais/lasers de acordo com a intensidade do fluoróforo. Não altere o ganho digital ou deslocamento e coloque o pinhole totalmente aberto.
- Defina a configuração de aquisição: selecione um modo de canal sequencial e alterne cada quadro. Defina o modo de varredura como quadro, e o tamanho do quadro como 1.024 x 1.024, com um passo de linha de 1. Defina a média para 2, e média por método médio e modo de linha unidirecional. Ajuste a profundidade da broca para 8 bits.
- Defina as configurações de aquisições multidimensionais para a conversão de Dendra2. Para conversão e branqueamento use o conjunto de laser de diodo de 405 nm a 60% de energia. Se disponível, ative o GaAsP de branqueamento seguro para proteger os detectores.
- Selecione uma série temporal de dois ciclos, com um intervalo de 0,0 ms no meio, e início e parada normais. Comece a branquear após a varredura 1 de 2 e repita para 30 iterações. Pare de branquear quando a intensidade cair para 50%.
- Defina a velocidade de aquisição/pixel como rápida (por exemplo, máxima = 12) para conversão e velocidade média (por exemplo, média = 5) para capturar uma imagem snap.
NOTA: Os parâmetros de branqueamento definidos aqui são as diretrizes. Para outros POIs marcados por Dendra2, as configurações de energia a laser e as iterações e valores branqueados devem ser estabelecidos empiricamente.
5. Montagem de C. elegans em slides de microscopia
NOTA: Se possível, coloque um estereótipo de montagem perto da configuração do microscópio confocal e monte os nematoides pouco antes da imagem.
- No deslizamento de tampa de vidro no lado oposto da almofada de agarose, desenhe uma janela com quatro quadrados com um marcador permanente e numera-os.
- Pipeta 15 μL de levamisole no meio da almofada agarose. A concentração de levamisole vai variar de acordo com a idade do nematoide: Quando a imagem dia 4 nematoides usarem levamisole de 2 mM; quando a imagem dia 10 nematoides usam 0,5 mM levamisole.
- Transfira quatro nematoides para o líquido usando uma picareta de arame. Com a ajuda de uma picareta de cílios, mova suavemente cada nematoide individual para um quadrado da janela. Gire o cílio para que qualquer traço de E. coli OP50 seja diluído e seu fundo fluorescente não interfira na aquisição de sinal.
- Espere que os nematoides quase parem de se mover e coloque suavemente um deslizamento de cobertura em cima do líquido para imobilizar os nematoides na camada de levamisole entre a almofada de agarose e o deslizamento de cobertura.
- Coloque o slide invertido no estágio confocal para a imagem dos nematoides.
6. Conversão de Dendra2 verde: Aquisição de dados no momento zero
NOTA: Os experimentos de perseguição de pulso começam convertendo irreversivelmente a proteína de fusão Dendra2 de um fluoróforo emissor verde para um vermelho.
- Usando a ocular do microscópio, localize o primeiro nematoides com um objetivo de 20x sob fluorescência verde. Concentre-se na cabeça ou na cauda e mude para o modo confocal.
- Inicie a varredura a laser ao vivo com o laser azul de 488 nm para visualizar o Dendra2 verde no canal verde EGFP (ex/em = 486-553 nm). Selecione um único neurônio e o deixe em foco. Amplie em 3x e aumente a meta do raio laser4.
NOTA: Selecione um neurônio por nematoide. Cada neurônio constituirá uma amostra ou ponto de dados. - Encontre o plano de projeção máxima e, de acordo com o brilho do fluoróforo, aumente ou diminua o ganho ou a potência do laser para obter uma imagem saturada, mas não superexposta identificável pelo indicador de faixa de cor. Uma vez que isso seja definido, pare a varredura.
NOTA: Não irradie a amostra por muito tempo ou com muita potência, pois a excitação com luz azul visível de 488 nm também pode converter Dendra2, embora lentamente e menoseficientemente 4. - No software, abra a guia para selecionar as regiões de interesse (ROIs) e desenhar um primeiro ROI em torno do neurônio selecionado. Defina uma segunda região maior de interesse abrangendo a cabeça do nematoide e incluindo o primeiro ROI.
- Nas configurações de branqueamento, selecione para que o primeiro ROI seja adquirido, branqueado e analisado. Selecione para o segundo ROI a ser adquirido e analisado, mas não branqueado.
- Defina a velocidade da varredura ao máximo (ou seja, ponto de pixel rápido) e inicie o experimento para converter os neurônios Dendra2 selecionados.
NOTA: Uma vez feito o experimento, a imagem adquirida resultará em duas imagens: uma antes e outra após a conversão. Para o canal verde, a primeira imagem deve ter um sinal verde maior que diminui na segunda imagem devido à conversão do Dendra2 verde. Para o canal vermelho, a primeira imagem deve ser negativa e não mostrar nenhum sinal, com um sinal vermelho aparecendo na imagem após a conversão. Se o sinal verde não diminuir, a conversão não ocorreu, e as configurações, como a potência laser 405 ou o número de iterações, devem ser modificadas. Se há um sinal vermelho na primeira imagem, então a potência laser de 488 nm usada era muito alta e uma parte do Dendra2 verde já foi convertida em vermelha. Neste caso, deve ser selecionado um novo neurônio/nematoide. - Imediatamente após a conversão, comece a digitalizar ao vivo com o laser verde de 561 nm para visualizar Dendra2 no canal vermelho (ex/em = 580-740 nm). Encontre o foco e a respectiva projeção máxima do neurônio convertido usando o indicador de cor de faixa para evitar a superexposição.
- Defina rapidamente a taxa de varredura para uma velocidade de moradia de pixels mais baixa (por exemplo, 5x) e adquira uma imagem instantânea de ambos os canais em uma resolução mais alta. Esta imagem é definida como ponto de tempo zero (T0) após a conversão.
NOTA: A velocidade de aquisição da imagem convertida pode ser variada. No entanto, uma vez escolhida, essa velocidade precisa permanecer constante durante toda a coleta de dados. - Salve a varredura com um nome e/ou número identificáveis, seguido pelo rótulo time zero (T0).
NOTA: É aconselhável também salvar a imagem do experimento de conversão (etapa 6.6) para ilustrar a falta de sinal vermelho antes da conversão e sua aparência posteriormente.
7. Imagem de Dendra2 vermelho convertido para aquisição de dados em um ponto de segunda tempo selecionado
- Para rastrear a degradação de Dendra2 ao longo do tempo, defina um segundo ponto de tempo para reimagem o mesmo nematode/neurônio. Selecione o segundo ponto de tempo experimentalmente para abordar qualquer questão biológica relevante. Para o protocolo descrito aqui, Dendra2 é imaged tanto a 2 h (T2) quanto 24 h (T24) pós-conversão.
- No ponto de tempo selecionado, encontre o mesmo nematodo/neurônio com o uso da ocular e fluorescência vermelha.
- Abra a imagem T0 do respectivo nematode/neurônio e recarregue/reuuse as configurações da imagem. Certifique-se de que as configurações de aquisição do snapshot são precisamente as mesmas ao adquirir as imagens T0, T2 e T24 h.
- Escaneando ao vivo no canal vermelho, trazer o neurônio vermelho convertido em foco. Como o Dendra2 vermelho degrada com o tempo o indicador de faixa mostrará uma projeção máxima menos intensa. Não altere nenhum parâmetro de aquisição e obtenha um instantâneo na mesma velocidade (por exemplo, 5x) como a primeira imagem.
- Para acompanhar a degradação de Dendra2 após 4h ou mais, resgate os nematoides após a conversão.
- Remova o slide do microscópio imediatamente após a conversão e imagem dos quatro nematoides. Remova suavemente a tampa e com o uso de uma picareta de arame, levante cada nematoide da almofada agarose.
- Coloque cada nematoide individualmente em uma placa NGM devidamente rotulada e identificável.
- Para o segundo ponto, monte o nematoide novamente em uma nova almofada de agarose e prossiga com a imagem do Dendra2 vermelho convertido seguindo as instruções na seção 6.
8. Análise de imagem do Dendra2 convertido
NOTA: A análise da degradação do Dendra2 é realizada com o software Fiji/ImageJ20.
- Abra Fiji e arraste e solte o arquivo .lsm na barra de Fiji. Abra a imagem T0 tirada logo após a conversão e a imagem do mesmo nematoide tirada no ponto de tempo selecionado após a conversão (T2 ou T24 h).
NOTA: Para acompanhar a degradação da proteína de interesse fundida ao Dendra2 apenas o canal vermelho precisa ser analisado. - Estabeleça os parâmetros de medição a partir do menu: Analisar | Medidas de conjunto. Selecione as funções Área e Densidade Integrada.
- Selecione a imagem obtida com o canal vermelho. Selecione a Ferramenta de Seleção de Polígono na barra de Fiji.
- Identifique o neurônio convertido na imagem T0 e desenhe um ROI ao seu redor usando a ferramenta de seleção.
- Para identificar corretamente os contornos do neurônio, destaque os limiares de intensidade selecionando na barra Imagem | Ajuste | Limiar. Arraste o cursor da barra para delinear o limiar e rastreie ao redor desta área com a ferramenta polígono. Para gerar um ROI preciso, também é possível usar o contorno do neurônio selecionado a partir do canal verde.
- Uma vez que a seleção tenha sido feita na janela do canal vermelho, pressione Analisar | Medida. Uma janela pop-up chamada Results aparecerá e incluirá os valores de ROI para Area, IntDene RawIntDen.
- Realize o mesmo processo de seleção e medição para a imagem do segundo ponto de tempo (T2 ou T24 h).
- Copie os valores obtidos em um software de planilha, tomando o cuidado de registrar adequadamente os valores em T0 após a conversão, e em T2 ou T24 h após a conversão.
9. Calculando a razão da degradação de Dendra2
- Para calcular a razão de degradação, primeiro atribua um valor de 1 (ou 100%) até o momento a degradação do ponto zero do tempo (ou seja, logo após a conversão, quando todo o Dendra2 vermelho convertido ainda está presente). Isso resulta da divisão do valor de IntRawDen de T0 por si só.
- Para calcular a redução do sinal de intensidade de Dendra2 vermelho ao longo do tempo, e a degradação, divida o valor de RawIntDen do segundo ponto de tempo (por exemplo, T2 ou T24 h) pelo valor do RawIntDen de T0. O número resultante deve ser inferior a 1. Esses valores também podem ser expressos em percentuais, definindo T0 como 100%.
- Repita a seção 7 para cada nematoide convertido. Para uma representação gráfica da degradação de Dendra2, mapeie um gráfico de gráfico de dispersão ou barra com os valores percentuais ou de razão de diminuição da fluorescência obtidos no eixo y. Aplique qualquer análise estatística desejada e ilustre-a no gráfico.
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Representative Results
Duas cepas de nematoides expressando o fragmento de proteína de 5on-1 de huntingtina em quadro com a proteína fotoconvertível Dendra2 foram obtidas via microinjeção e os plasmídeos foram mantidos como uma matriz extracromosomal. A construção de fusão foi expressa em todo o sistema nervoso C. elegans a partir do desenvolvimento ao longo do envelhecimento. Aqui, o HTT-D2 continha o estiramento fisiológico de 25 poliglutamina (HTTQ25-D2, Figura 1A) ou uma repetição totalmente penetrante e patogênica com 97 glutaminas (HTTQ97-D2, Figura 1B). Inicialmente, a proteína de fusão foi testada para garantir que ela mudasse de seu espectro verde para seu espectro vermelho após a irradiação UV. HTT-D2 mudou com sucesso de verde para vermelho exclusivamente dentro da região iluminada. De acordo com a potência e iterações do pulso UV, e dependendo do z-plano e penetração do raio laser através da cutícula do nematoide, uma porção definida de HTT-D2 foi convertida, mas não todas. Um sinal vermelho apareceu dentro dos neurônios fotoconvertidos, colocalizando-se com o HTT-D2 verde não convertido (Figura 1C,D). Devido à precisão dos feixes de fótons de varredura a laser, foi possível converter um ROI preciso correspondente a um único neurônio. Antes da conversão, nenhum sinal vermelho era visível quando a amostra estava excitada no canal vermelho(Figura 2A). Após a irradiação UV, o sinal verde diminuiu à medida que o HTT-D2 foi convertido e um sinal vermelho finalmente apareceu(Figura 2B). O HTT-D2 foi então degradado ao longo do tempo, resultando em uma redução nos níveis de HTT-D2 vermelho (Figura 2C) e um possível aumento do sinal HTT-D2 verde, à medida que mais proteína de fusão foi recentemente sintetizada. Como uma diminuição significativa já era proeminente em 2h após a conversão, este intervalo para detecção e quantificação da degradação do HTT-D2 foi mantido. É importante notar que a degradação não é o único processo que pode ocorrer após a conversão do HTT-D2. O HTT-D2 convertido pode ser traficado e transportado ao longo dos axônios, resultando em uma diminuição do sinal vermelho não devido à liberação. No entanto, com as configurações empregadas aqui e ao longo do curto período de tempo de 2h, não foi observada propagação do sinal vermelho, possivelmente devido ao fato de que o pequeno HTT-D2 foi movido da soma para o axônio. Além disso, a conversão e a imagem de uma única soma neuronal inteira ajudou a excluir os efeitos da difusão HTT-D2 dentro do mesmo neurônio, pois todos os compartimentos celulares estavam sendo analisados simultaneamente. Para estudar tanto a difusão quanto o transporte/tráfico é aconselhável obter imagens de ampliação rápidas e mais altas e rastrear uma fração menor e possivelmente mais motil da proteína de interesse. Também é importante notar que dentro de um conjunto de experimentos, cada animal representava uma repetição biológica. Apenas um neurônio por nematoide foi imageado, cada animal foi imageado uma vez por sessão, e a imagem ocorreu ao longo de três sessões, o que constitui repetições técnicas. As três sessões exigiram que os animais fossem sincronizados em placas frescas antes de cada experimento no dia 4 ou no dia 10, permitindo qualquer variabilidade ambiental imposta aos nematoides. Três sessões também explicam qualquer variabilidade decorrente da configuração de imagem (por exemplo, o poder do laser variando devido a uma temperatura diferente entre os experimentos). Todas as réplicas biológicas obtidas durante as três sessões (mínimo de 20 animais) foram consideradas amostras individuais e utilizadas para estabelecer significância estatística.
Após confirmar que ambas as cepas de C. elegans HTT-D2 foram eficazes e estabeleceram os parâmetros de conversão ideais, foram investigadas as diferenças entre o volume de negócios de uma proteína HTT-D2 causadora da doença (ou seja, HTTQ97-D2) em comparação com seu controle fisiologicamente relevante (HTTQ25-D2). Primeiro, observou-se a degradação do HTT-D2 em diferentes neurônios (Figura 3). Sabe-se que os subtipos de neurônios dentro do sistema nervoso do nematoide variam em sua atividade metabólica e morfologia21, possivelmente fazendo a diferença na degradação e reequilíbrio do proteome. Os neurônios da região da cauda foram comparados com os da cabeça e constataram ser significativamente mais ativos(Figura 3A). Este achado foi válido apenas para HTTQ25-D2 e não para HTTQ97-D2 patogênico, sugerindo que o PN foi incapaz de remover HTT-D2 contendo trechos de glutamina mais longos em todo o sistema nervoso(Figura 3B).
Para confirmar ainda que o sistema modelo se comportou como esperado, os experimentos de conversão foram realizados por um período mais longo, permitindo que as vias de degradação das células eliminassem a proteína de interesse quase completamente(Figura 4). De fato, houve significativamente mais degradação do controle HTTQ25-D2 24 h após a conversão do que depois de 2 h nos neurônios da cabeça, e extensivamente mais nos neurônios da cauda(Figura 4A). Novamente, os neurônios posteriores da cauda removeram mais ativamente htt-D2 vermelho, mesmo durante um aumento de tempo. Uma tendência semelhante foi detectada para o HTTQ97-D2 causador da doença, com uma redução muito leve do sinal HTT-D2 vermelho acima de 24 horas. No entanto, o HTTQ97-D2 não foi removido tão facilmente quanto o HTTQ25-D2, especialmente depois das 24 horas. Pode ser que apenas a fração solúvel HTTQ97-D2 esteja eficientemente degradada, representando a diminuição inicial do sinal vermelho e sua diminuição mais leve ao longo do tempo. É importante ressaltar que havia duas populações de neurônios após 24 h: uma com maior taxa de degradação e outra onde o sinal HTT-D2 vermelho não foi degradado, ou potencialmente até mesmo aumentado(Figura 4B). O sinal aumentado e estável possivelmente representa espécies já agregadas ou continuamente agregadas que eram substancialmente mais difíceis de limpar das células devido à sua natureza amiloide bem embalada. Essas inclusões, presentes exclusivamente quando os trechos de glutamina excederam o limiar de repetição de 40, e que apareceram microscopicamente como focos, têm sido hipóteses para acumular como depósitos que não podem ser facilmente removidos22. Também é possível que um aumento no sinal fluorescente vermelho tenha sido um artefato resultante de problemas técnicos (por exemplo, uso de parâmetros de aquisição errados, desempenho sub-par da configuração de microscopia ou um processo de recuperação/montagem errônea). Ao adquirir imagens por períodos mais longos de tempo, essas variáveis devem ser levadas em conta.
Finalmente, como foram observados distúrbios neurodegenerativos como o HD na vida adulta, observou-se o efeito do envelhecimento na taxa de degradação do HTT-D2. Experimentos de conversão foram realizados na cabeça e nas regiões traseiras de nematoides jovens (dia 4) versus antigos (dia 10) em ambas as cepas HTT-D2(Figura 5). Para os neurônios da cabeça, não houve mudança significativa na taxa de degradação devido ao envelhecimento durante a vida de HTTQ25-D2 e HTTQ97-D2, possivelmente porque o HTT-D2 foi removido igualmente ao longo da vida de cada nematoide. No entanto, uma mudança muito significativa foi registrada ao comparar antigos nematoides contendo um estiramento patológico ou fisiológico de glutamina. O HTTQ97-D2 não foi degradado tão eficientemente quanto o HTTQ25-D2, destacando a incapacidade do PN de remover espécies agregadas e possivelmente tóxicas de huntingtin em nematoides mais antigos(Figura 5A). Mais uma vez, observou-se uma rotatividade mais ativa e significativa nos neurônios da cauda. Como nos neurônios da cabeça, um volume de negócios mais robusto de HTTQ25-D2 não foi observado nos neurônios tail de nematoides jovens em comparação com a coorte mais antiga, e a degradação foi igual no dia 4 e dia 10. Por outro lado, mudanças significativas nas taxas de degradação entre o controle e as cepas patogênicas de HTT-D2 apareceram no dia 4 dos nematoides, tornando-se ainda mais significativas no dia 10. É importante ressaltar que os neurônios da cauda foram capazes de lidar com HTTQ97-D2 tóxicos em nematoides jovens, ilustrando que vários mecanismos PN concomitantees podem estar em ação para remover o HTT-D2 (Figura 5B). No geral, a atividade PN diminuiu ao longo do tempo, possivelmente devido aos efeitos prejudiciais causados tanto pelo envelhecimento quanto pela presença de agregados.
Figura 1: C. elegans expressou huntingtin exon-1 fundido a Dendra2 no sistema nervoso. (A) Jovem, dia 4 C. elegans pan-neuronalmente expressando huntingtin exon-1 contendo 25 glutaminas, fundido a Dendra2 em seu estado de excitação/emissão verde não convertido. Barra de escala = 100 μm. Os insets mostram uma imagem ampliada dos neurônios da cabeça (superior) e da cauda (inferior). Barra de escala de inset = 10 μm. (B) Jovem, dia 4 C. elegans pan-neuronalmente expressando huntingtin exon-1 contendo 97 glutaminas, fundido a Dendra2 em seu estado de excitação/emissão verde não convertido. Barra de escala = 100 μm. Os insets mostram uma imagem ampliada dos neurônios da cauda (superior) e da cabeça (inferior) e da cabeça de um nematoide dia 7 (extrema direita). Barra de escala de entrada = 10 μm. Pontas de flecha branca apontam para focos HTTQ97-D2, representando agregados de huntingtin. (C) Imagem de fusão do canal de HTTQ25-D2 com conversão da região da cabeça. A caixa representa a porção de toda a C. elegans que foi irradiada UV. Barra de escala = 100 μm. O inset mostra a emissão de Dendra2 a 488 nm (superior, verde) e a de 561 nm (inferior, vermelho). Barra de escala = 10 μm. (D) Imagem de fusão do canal de HTTQ97-D2 com conversão da região da cabeça. Barra de escala = 100 μm. A caixa representa a porção de toda a C. elegans que foi irradiada UV. O inset mostra a emissão de Dendra2 a 488 nm (superior, verde) e a de 561 nm (inferior, vermelho). Barra de escala = 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: HTT-D2 vermelho convertido diminuiu ao longo do tempo em neurônios únicos. Neurônios de cauda de HTTQ25-D2. Dois neurônios são mostrados simultaneamente e independentemente fotoconvertidos. As imagens retratam sequencialmente três pontos de tempo: (A) Antes da irradiação (antes),(B)imediatamente após a irradiação (conversão) e (C) 2 h após a irradiação (depois). O painel superior (canal verde) representa o sinal HTT-D2 coletado em 486-553 nm excitação/emissão. A região branca de interesse delineia os neurônios que foram irradiados. O painel do meio (canal vermelho) mostra o sinal HTT-D2 convertido coletado em 580-740 nm excitação/emissão. O painel inferior é uma fusão dos dois canais. Barra de escala = 5 μm para todas as imagens. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Os neurônios de cabeça e cauda apresentaram diferentes taxas de degradação. Os gráficos da barra de coluna mostram a porcentagem de intensidade vermelha em relação ao valor inicial no momento da conversão (ou seja, 100%). O sinal de Dendra2 vermelho convertido diminuiu globalmente durante o intervalo de 2 h, uma vez que o HTT-D2 foi degradado dentro dos neurônios de C. elegans. Dentro do sistema nervoso do nematodo os subtipos neuronais apresentaram diferentes taxas de degradação, com neurônios tail mostrando uma rotatividade mais ativa, mas apenas em nematoides carregando um estiramento de poliglutamina nãopatômica. (A) Quantificação da degradação na cabeça HTTQ25-D2 versus neurônios da cauda. Média ± SD, não foi testado o teste t do aluno de duas caudas. N = 23-28 amostras/nematoides imagens por região, *P < 0,05. (B) Quantificação da degradação na cabeça HTTQ97-D2 versus neurônios da cauda. Média ± SD, não foi testado o teste t do aluno de duas caudas. N = 23-28 amostras/nematoides imagens por região, ns = não significante. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: HTTQ97-D2 não foi significativamente limpo após 24 h. Os gráficos da barra de coluna mostram a porcentagem de intensidade vermelha em relação ao valor inicial no momento da conversão (ou seja, 100%). O sinal de Dendra2 vermelho convertido diminuiu à medida que o HTT-D2 foi degradado dentro dos neurônios de C. elegans. HTT-D2 apresentou diferentes taxas de degradação. Mesmo durante períodos mais longos de tempo após a conversão, o HTT-D2 patogênico não pôde ser removido em comparação com seu controle saudável. (A) Quantificação da taxa de degradação em HTTQ25-D2 em dois pontos de tempo após a conversão (2 h e 24 h) nos neurônios da cabeça e da cauda. Média ± SD, análise unidirecional de variância (ANOVA). N = 21-28 amostras/nematoides imagens por tempo/região, *P < 0,05, ****P < 0,0001. (B) Quantificação da taxa de degradação em HTTQ97-D2 em dois pontos de tempo após a conversão (2 h e 24 h) nos neurônios da cabeça e da cauda. Média ± SD, análise unidirecional de variância (ANOVA) seguida pelo teste pós-hoc de comparação múltipla de Tukey. N = 21-28 amostras/nematoides imagens por tempo/região, ns = não significante. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Nematoides antigos e jovens expressando o HTT-D2 patogênico não o degradaram eficientemente. Os gráficos da barra de coluna mostram a porcentagem de intensidade vermelha em relação ao valor inicial no momento da conversão (ou seja, 100%). O sinal de Dendra2 vermelho convertido diminuiu à medida que o HTT-D2 foi degradado dentro dos neurônios. À medida que o nematoide envelhecia, sua capacidade de degradar o HTT-D2 patogênico foi adicionalmente prejudicada em todo o seu sistema nervoso. (A) Quantificação da taxa de degradação nos neurônios da cabeça de nematoides HTTQ25-D2 antigos (dia 10) HTTQ25-D2 em comparação com os nematoides HTTQ97-D2 com correspondência etária. Média ± SD, análise unidirecional de variância (ANOVA). N = 23-28 amostras/nematoides imagens por cepa/dia, ****P < 0,0001. (B) Taxa de degradação 2 h após conversão nos neurônios de cauda de nematoides HTTQ97-D2 antigos (dia 10) HTTQ25-D2, em comparação com os nematoides HTTQ97-D2 com correspondência etária. Média ± SD, análise unidirecional de variância (ANOVA) seguida pelo teste pós-hoc de comparação múltipla de Tukey. N = 23-28 amostras/nematoides imagens por cepa/dia, *P < 0,05, ***P < 0,001, ****P < 0,0001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Para compreender a função de uma proteína é importante entender sua síntese, localização e degradação. Com o desenvolvimento de FPs novos, estáveis e brilhantes, visualizar e monitorar POIs tornou-se mais fácil e eficiente. PAFPs de fusão geneticamente expressos como o Dendra2 estão posicionados exclusivamente para estudar a estabilidade de um POI. Após a exposição à luz azul-roxa, Dendra2 quebra em um local preciso dentro de uma tríade de aminoácidos conservados. O fluoróforo sofre uma pequena mudança estrutural, resultando em uma mudança completa de espectros de verde para vermelho23. Esta mudança permite a detecção e monitoramento de qualquer POI ligado ao Dendra2. De fato, esses construtos de fusão foram usados pela primeira vez para criar uma cepa de repórter C. elegans para estudar o sistema ubiquitin-proteasome in vivo16. A Dendra2 também foi empregada para compreender a vulnerabilidade dos subtipos neuronais seletivos e sua capacidade de lidar com proteínas de poliglutamina expandidas24, ou monitorar a indução da autofagia em modelos de doença do neurônio motor25.
Um protocolo é apresentado aqui para monitorar in vivo a degradação da huntingtin, uma proteína propensa à agregação relacionada à doença de forma não invasiva. Depois de gerar com sucesso um modelo de C. elegans neuronal de HD, expressando HTT-D2 pan-neuronalmente, as taxas de degradação do HTT expandido e patogênico em comparação com sua contraparte fisiológica foram quantificadas. Diferenças marcantes foram observadas entre subtipos neuronais, entre nematoides jovens e idosos, e entre a capacidade da PN de lidar com cargas tóxicas de glutamina ao longo do tempo. Esta técnica também pode ser aplicada para acompanhar a localização e o movimento da huntingtin, bem como seu destino quando as perturbações ao PN são introduzidas. o knockdown siRNA de acompanhantes-chave ou administração de compostos que inibem a atividade proteasome pode descobrir a função e a importância desses componentes em proteínas propensas à agregação: por exemplo, se o PN ativa nós específicos para compensar as deficiências26. Também pode explicar os efeitos prejudiciais causados por uma doença em comparação com os do envelhecimento normal.
Embora muitas questões diferentes possam ser abordadas usando essa técnica, uma vez que um modelo desejado tenha sido gerado, parâmetros corretos de conversão e detecção devem ser estabelecidos para obter dados confiáveis. Também é crucial determinar configurações de conversão que permitam o rendimento suficiente da proteína ativada sem fotobólica ou fototoxicidade e sem conversão indesejada. Além disso, para cada proteína estudada dentro de um sistema de modelo específico, seja ex vivo ou in vivo, é necessário estabelecer experimentalmente um período de tempo suficientemente grande para permitir uma quantificação precisa da taxa de degradação.
A Dendra2 oferece uma série de vantagens sobre outros PAFPs: 1) é monomérica e muito brilhante; 2) possui uma fotoconversão de alto contraste e um sinal fotoconvertido estável; 3) pode ser ativado com baixa fototoxicidade por um laser azul de 488 nm, que faz parte da maioria das configurações de hardware confocal; 4) amadurece eficientemente a 37 °C para aplicação em células de mamíferos; 5) não tem efeitos colaterais tóxicos quando expresso por longos períodos de tempo23,27; e 6) o sistema não é afetado por variações nos níveis de expressão entre ou dentro de um organismo ou célula, pois apenas a razão do sinal Dendra2 antes e depois da conversão é quantificada. Todas as propriedades listadas fazem do Dendra2 um fluoróforo ideal para rastrear a dinâmica proteica em tempo real e monitorar o destino celular.
Infelizmente, as proteínas de fusão Dendra2 sofrem de algumas limitações comuns da rotulagem de proteínas fluorescentes. A construção é uma espécie quimrica frequentemente superexpressa experimentalmente em sistemas biológicos, embora a expressão endógena pudesse ser estabelecida através da engenharia genômica. A taxa de degradação do próprio Dendra2 influencia potencialmente a degradação da proteína alvo, embora tenha sido descrita como uma proteína altamente estável e de longa duração27. Além disso, a Dendra2 não é adequada para rastrear proteínas com volumes de negócios muito rápidos, pois pode não ter tempo para sua própria maturação adequada. Por fim, os lasers de 405 nm, que são incomuns, são preferidos para fotosssaritching eficiente, embora sejam mais tóxicos para a amostra. De fato, menos luz azul fototóxica pode ser utilizada para visualizar dendra2 verde e convertê-la quando a potência laser está em alta intensidade. Este recurso em particular deve ser sempre mantido em mente, pois a exposição prolongada produzirá conversão indesejada e medidas potencialmente erradas. Finalmente, pode ser problemático usar Dendra2 em combinação com fluoroforos verdes ou vermelhos. No entanto, muitos PAFPs diferentes estão disponíveis para investigar a dinâmica de várias proteínas simultaneamente.
Experimentos utilizando Dendra2 e outros PAFPs foram ligados à recuperação de fluorescência após fotobleaching (FRAP) e técnicas radioativas de rotulagem de perseguição de pulso. Em um ambiente FRAP é impossível distinguir proteínas reentrando em um ROI de proteína fluorescente recém-formada, e é necessário monitoramento e visualização constante da amostra. Com o Dendra2, duas populações claramente distintas são geradas que podem ser observadas independentemente ao longo do tempo para que a forma "inativa" "inativa" substituída e recém-sintetizada de Dendra2 verde possa ser rastreada e quantificada16. Dendra2 também é uma sonda útil em microscopia de super resolução, como microscopia fluorescente de reflexo interno total (TIRF)28 e microscopia de localização de fotoativação (PALM)29. Em um futuro próximo, tais avanços permitirão uma melhor localização e rastreamento potencialmente único de moléculas de qualquer POI, permitindo descobrir diferenças mais sutis dentro e entre amostras e, finalmente, produzindo novas informações sobre a vida e o destino de qualquer POI dentro de um sistema biológico.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Reconhecemos o DFG (KI-1988/5-1 à JK, bolsa de doutorado da NeuroCure pelo NeuroCure Cluster of Excellence to MLP) para financiamento. Também reconhecemos a Instalação do Núcleo de Imagens do Leibniz Research Institute for Molecular Pharmacology Berlin (FMP) por fornecer a configuração de imagens. Além disso, gostaríamos de agradecer a Diogo Feleciano que estabeleceu o sistema Dendra2 no laboratório e forneceu instruções.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar-Agar Kobe I | Carl Roth GmbH + Co. KG | 5210.2 | NGM component |
| Agarose, Universal Grade | Bio & Sell GmbH | BS20.46.500 | Mounting slide component |
| BD Bacto Peptone | BD-Bionsciences | 211677 | NGM component |
| Deckgläser-18x18mm | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0657.2 | Cover slips |
| EC Plan-Neufluar 20x/0.50 Ph2 M27 | Carl Zeiss AG | Objective | |
| Fiji/ImageJ 1.52p | NIH | Analysis Software | |
| Levamisole Hydrochloride | AppliChem GmbH | A4341 | Anesthetic |
| LSM710-ConfoCor3 | Carl Zeiss AG | Laser Scanning Confocal Micoscope | |
| Mounting stereomicroscope | Leica Camera AG | Mounting microscope | |
| neuronal-HTTQ25-Dendra2 | this paper | C. elegans strain | |
| neuronal-HTTQ97-Dendra2 | this paper | C. elegans strain | |
| OP50 Escherichia coli | CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC) | OP50 | Nematode food source |
| Sodium Chloride | Carl Roth GmbH + Co. KG | 3957.2 | NGM component |
| Standard-Objektträger | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0656.1 | Glass slides |
| ZEN2010 B SP1 | Carl Zeiss AG | Confocal acquisition software |
References
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