Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
I Vivo Kvantificering af protein omsætning i Aging C. Elegans bruger Photoconvertible Dendra2
Chapters
Summary June 13th, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Præsenteret her er en protokol til at overvåge nedbrydningen af proteinet huntingtin smeltet til fotokonvertible fluorophore Dendra2.
Transcript
Denne protokol giver mulighed for sporing og kvantificering af nedbrydningen af et protein af interesse i levende og aldrende C.elegans. Denne in vivo og noninvasive teknik kræver kun lidt mikroskopi oprettet til pålideligt at konvertere Dendra2 til en lys og stabil fluorophore. Metoden kan tilpasses pattedyrsystemer samt zebrafisk.
At studere, sætte i omsætning inden for proteostatis nettet samt transport og menneskehandel. Pas på ikke at fremprovokere uønsket konvertering af Dendra2, mens du scanner med den blå lyslaser, og for at teste og optimere anskaffelsesindstillingerne og konverteringsindstillingerne for hvert system og fusionsprotein. Begynd med at dyrke aldersmatchede nematoder ved 20 grader Celsius til den ønskede alder for eksperimentet.
På dagen for billedforsøget smeltes den generelle kvalitet agarose ved en koncentration på 3 % i dobbeltdestilleret vand. Mens agarose er køling, skæres spidsen af en milliliter pipette spids for at lette aspiration af ca 400 mikroliter af den smeltede agarose. Tilsæt forsigtigt et par dråber agarose på et rent glas dias og straks placere en anden slide på toppen af dråberne for at skabe en tynd pude af agarose mellem de to glasstykker.
Når agarose er tørret, skal du forsigtigt fjerne den øverste slide. Når der er forberedt nok dias, skal du åbne konfokale mikroskopsoftware og indstille lysvejen til excitation og emission. For grøn Dendra2 tilføje 486 til 553 nanometer, og for rød Dendra2 tilføje 580 til 740 nanometer.
Juster kraften og gevinsten af begge kanaler i henhold til intensiteten af fluorophore og sæt pinhole til fuldt ud at åbne. Vælg en sekventiel kanaltilstand, og indstil sporet til at skifte hver ramme. Indstil scanningstilstanden som ramme og rammestørrelsen som 1024 i 1024 med et linjetrin på et.
Indstil gennemsnit til to og til gennemsnittet med den gennemsnitlige metode og tilstand af ensrettet linje. Indstil bitdybden til otte bit. Definer den flerdimensionale anskaffelsesindstilling for konverteringen af Dendra2.
Til konvertering og blegning skal du bruge 405 nanometerdiodelaseren indstillet til 60 % energikraft. Vælg en tidsserie med to cyklusser med et interval på 0,0 millisekund mellem cyklusserne og en normal start og stop. Indstil blegning til at starte efter scanning en af to, at gentage for 30 iterationer og til at stoppe, når intensiteten falder til 50%Derefter definere hastigheden af erhvervelse pixel dvæle til hurtig for konvertering og til medium for at fange et snap billede.
For at montere nematoderne på objektglassene skal du bruge en permanent markør til at tegne og nummerere et vindue med fire firkanter på det modsatte af agarosepuden på hvert objektglas. Tilsæt 15 mikroliter levamisole til midten af agarosepuden, og brug et stereomikroskop og et tråds pick til overførsel for aldersmatchede nematoder i dråben. Brug en øjenvipper pick til forsigtigt at flytte hver nematode i et vindue på pladsen.
Når alle nematoder er blevet flyttet, vente, indtil ormene er holdt op med at bevæge sig, før du placerer et dæksel slip over væsken til at immobilisere nematoder under billeddannelse. Placer derefter sliden på konfokale mikroskopstadiet. For grøn Dendra2 konvertering, skal du bruge okularet af 20 X mål under grøn fluorescens at finde den første nematode og fokusere på hovedet eller halen.
Skift til konfokal tilstand og øge eller mindske gevinst og laser magt for at opnå en mættet, men ikke overeksponeret billede. Tegn en region af interesse omkring den valgte neuron og tegne en anden større region af interesse omkring halen, der omfatter den første region af interesse. Indstil den første region, der skal erhverves, bleges og analyseres.
Indstil den anden region af interesse, der skal erhverves og analyseres, men ikke bleget. Indstil scanningshastigheden til maksimum og start scanningen for at konvertere de valgte Dendra2 neuroner. Umiddelbart efter konvertering, begynde live scanning med den grønne 561 nanometer laser til at visualisere Dendra2 i den røde kanal og finde fokus og respektive maksimale projektion af den konverterede neuron.
Indstil hurtigt scanningshastigheden til en lavere pixelbondehastighed, og få et snapshotbillede af begge kanaler med en højere opløsning. Dette billede betragtes på tid nul efter konvertering. Gem derefter scanningen med et identificerbart navn og eller tal efterfulgt af tids zero-etiketten.
For at spore Dendra2 nedbrydning over tid, åbne gange nul billede af de respektive nematode neuron. Brug den samme billedindstilling, begynde at scanne live i den røde kanal og bringe den konverterede røde neuron i fokus. Derefter, uden at ændre nogen erhvervelse parametre, få et øjebliksbillede med samme hastighed som det første billede.
Sørg for at definere din konverteringsindstilling omhyggeligt for at konvertere Dendra2 effektivt og tilstrækkeligt og for at opretholde de samme anskaffelsesparametre på forskellige tidspunkter. Hvis du vil analysere de konverterede Dendra2-billeder, skal du åbne tids zero- og second time point-billederne i Fiji og åbne Analyser og Indstil målinger. Vælg funktionerne Område og Integreret Tæthed, og vælg det billede, der er hentet med den røde kanal.
Brug Polygon Selection Tool, tegne en region af interesse omkring det tidspunkt nul konverteret neuron. Hvis du vil identificere neuronens konturer korrekt, skal du vælge Billede, Juster og Tærskel for at fremhæve intensitetstærsklerne. Når markeringen er defineret, skal du klikke på Analysér og målér.
Der vises et pop up-resultatvindue, herunder området, integreret tæthed og råintegrerede tæthedsværdier for den valgte interesseregion. Udfør den samme udvælgelses- og måleproces for billedet fra det andet tidspunkt. Kopier derefter værdierne til regnearket.
I denne repræsentative analyse før konvertering var der ikke synligt rødt signal, da prøven var ophidset i den røde kanal. Ved bestråling faldt det grønne signal, da HTT-D2 blev konverteret, og der dukkede efterfølgende et rødt signal op. HTT-D2-udtrykket forringet over tid, hvilket resulterer i en reduktion i niveauet af rødt HTT-D2-signal og en mulig stigning i det grønne HTT-D2-signal, efterhånden som mere fusionsprotein for nylig blev syntetiseret.
Især, neuroner i halen regionen blev bestemt til at være betydeligt mere aktive i forhold til hovedet. Yderligere, der var betydeligt mere nedbrydning af kontrol HTTQ25-D2 24 timer efter konvertering, derefter efter to timer i både hoved og hale neuroner. Denne forskel blev ikke observeret i patogene HTTQ97-D2, men tyder på, at proteostase netværket ikke var i stand til at fjerne HTT-D2 indeholder længere glutamin strækninger i hele nervesystemet.
HTTQ97-D2 blev ikke nedbrudt så effektivt som HTTQ25-D2 i meget gamle nematoder, hvilket fremhævede proteostasenetværkets manglende evne til at fjerne aggregerede og muligvis giftige arter af Huntingtin hos ældre dyr. Vigtigere, hale neuroner var i stand til at klare giftige HTTQ97-D2 i unge nematoder, hvilket tyder på, at forskellige samtidige proteostase netværk mekanismer kan være på arbejde for at fjerne HTT-D2. For hver prøve erhverve og ikke-overeksponeret og ikke-mættet billede umiddelbart efter konvertering og genbruge den samme indstilling for den pågældende prøve gennem tiden.
Med denne protokol er det muligt at teste ændringer i et proteostatisnetværk og også ved hjælp af superopløsningsmikroskopi at spore spredningen af sygdomsrelaterede proteiner.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
