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Neuroscience

基于旋转加速大鼠漫射性无羟基脑损伤的诱导

doi: 10.3791/61198 Published: May 9, 2020
* These authors contributed equally

Summary

该协议验证了大脑扩散性连体损伤 (DAI) 的可靠、易于执行和可重复的啮齿动物模型,这种模型可引起大范围的白质损伤,而不会造成颅骨骨折或挫伤。

Abstract

创伤性脑损伤 (TBI) 是导致死亡和残疾的主要原因。扩散性斧伤 (DAI) 是需要住院的很大一部分 TBI 患者的主要伤害机制。DAI 涉及因晃动、旋转或爆炸伤害而造成的广泛斧头损伤,导致快速的斧头拉伸损伤和与功能恢复的长期影响相关的二次斧头变化。从历史上看,没有焦伤的DAI实验模型一直难以设计。在这里,我们验证了DAI的简单、可重复和可靠的啮齿动物模型,该模型不会造成广泛的白质损伤,而不会造成颅骨骨折或挫伤。

Introduction

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创伤性脑损伤 (TBI) 是美国死亡和残疾的主要原因。结核病占所有与伤害有关的死亡1,22的约30%。TBI的主要原因因年龄组而异,包括跌倒、运动期间高速碰撞、故意自残、机动车碰撞和袭击11、2、3。2,3

脑扩散性斧头损伤(DAI)是一种特殊类型的TBI,由旋转加速、晃动或爆炸损伤引起的大脑在受伤后瞬间不受限制的头部运动44,5,6,7,8。5,6,7,8DAI涉及广泛的斧子损伤,导致长期神经损伤,与不良的结果,沉重的医疗费用,和33-64%的死亡率1,1,2,4,5,9,10,11。2,4,5,9,10,11尽管最近对DAI的发病机制进行了大量研究,但关于最佳治疗方案11、12、13、14,12,13,14仍没有达成共识。

在过去的几十年里,许多实验模型试图准确地复制DAI11、12、15、1612,15,16的不同方面。11然而,与其他焦伤相比,DAI 具有独特的表现方式,这些模型存在局限性。这些以前的模型不仅在白质区域造成斧伤,而且还会导致焦点脑损伤。临床上,DAI伴有微出血,这可能是白质损伤的主要原因。

只有两种动物模型被证明复制DAI的主要临床特征。Gennarelli和他的同事在1982年制造了第一个侧头旋转装置,使用非冲击头旋转加速诱导昏迷与DAI在非人类灵长类动物模型15。这种灵长类动物模型采用控制的单次旋转来加速和减速,在10-20毫秒内将头部通过60°取代。 这项技术能够模拟意识受损和广泛的斧头损伤,类似于在人类大脑中观察到的严重TBI的影响。然而,灵长类动物模型是非常昂贵的44,11,16。11,16部分基于以前的模型,猪模型旋转加速脑损伤是在1994年(罗斯等人)设计,类似的结果14。

这两种动物模型虽然产生了不同的典型病理学的介绍,但大大增加了DAI发病机制的概念。快速头部旋转被公认为诱导DAI的最好方法,啮齿动物为快速头部旋转研究11、16,16提供了一个更便宜的模型。在这里,我们验证了DAI的简单、可复制和可靠的啮齿动物模型,该模型在不造成颅骨骨折或挫伤的情况下造成广泛的白质损伤。目前的模型将使人们更好地了解DAI的病理生理学和更有效的治疗方法的发展。

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Protocol

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这些实验是在《赫尔辛基和东京宣言》和欧洲共同体《使用实验动物准则》的建议下进行的。这些实验得到了内盖夫本-古里安大学动物护理委员会的批准。

1. 为实验程序准备大鼠

注:选择成年雄性斯普拉格-达利大鼠体重300-350克。

  1. 获得机构动物护理和使用委员会的批准,以进行这些实验。
  2. 将大鼠保持在 22 ± 1 °C 的室温下,12 小时照明和 12 小时暗循环。提供鼠肉和水的盐水。
  3. 在上午 6:00 到下午 12:00 之间执行所有实验。
  4. 使用连续的等体管理系统诱导麻醉。确保蒸发器系统充满等体。
    1. 用2%的二分之一类物麻醉大鼠。
    2. 通过观察对外部刺激缺乏运动或踏板反射,确认大鼠完全麻醉。

2. 弥漫性斧伤的诱导

注:该装置由以下部件组成:1)透明塑料缸,2)铁重(1308克),3)旋转机构由圆柱形管、轴旋转的两个轴承和一个头固定(用于耳针);4) 固定两个轴承的水平平台。

  1. 将设备放在重、稳定的实验室桌子上。
  2. 将重量附加到高度为 120 厘米的字符串上。
  3. 允许自由下降的重量击中螺栓,激活旋转机构。使用侧头旋转装置,啮齿动物的头部从 0 迅速转向 90°。
  4. 诱导扩散性无氧脑损伤后,将大鼠转移到恢复室。

3. 旋转运动学/生物力学参数的测量。

  1. 测量旋转运动学/生物力学参数,如下所示:
    Equation 1
    Equation 2
    Equation 3
    施用动物头部的Fo力(千克);M = 力矩;K = 动能;m = 重量下降的质量;g - 重力加速度;h = 高度(厘米);D = 耳针(厘米)之间的距离。
    注:要计算应用于动物头部(Fo)的力,必须了解下降重量的质量、重量下降的高度以及耳针之间的距离。其他参数保持不变。

4. 48小时后神经严重性评分评估

注:神经缺陷是使用神经严重性评分进行评估和分级的,如先前描述的17、18、19。17,18,19运动功能和行为的变化由点系统评估,因此最高得分为24表示严重的神经功能障碍。分数 0 表示完整的神经系统状态。评估以下行为功能。

  1. 评估大鼠在位于其中心时无法从圆(直径50厘米)退出。执行三次持续 30 分钟、60 分钟和 60 分钟以上的单独会话。
  2. 测试大鼠在持续20分钟、40分钟和60分钟以上的三个疗程中,有右反射的丧失。
  3. 执行对异位性测试,大鼠无法抵抗位置的强制变化。
  4. 用尾巴抬起老鼠,以测试后肢的弯曲。
  5. 把老鼠放在地板上,以测试它直行的能力。
  6. 测试三个独立的反射:针刺反射,角膜反射,和肛门反射。
  7. 根据寻求行为和垂化损失对具有临床等级的大鼠进行评分。
  8. 测试放置肢体反射。在左前肢和右前肢,然后进行左和右后肢测试。
  9. 通过光束平衡任务执行功能测试。光束应宽 1.5 厘米。运行 20 s、40 和 60 s 以上的会话的测试。
  10. 对三个不同宽度的光束进行光束行走测试:8.5 厘米宽、5 厘米宽和 2.5 厘米宽。

5. 48小时后进行组织学检查的大脑收集

  1. 在受伤后48小时,用20%O2/80% CO2替换受启发的气体混合物,对大鼠进行安乐死。确保 CO2按照机构动物护理和使用委员会准则以预定费率交付。
    1. 确保根据机构动物护理和使用委员会准则确认死亡。
  2. 在温度 4 °C 下,在大鼠中注入 0.9% 的肝素盐水,随后在 0.1 M 磷酸盐缓冲盐水(pH 7.4)中注入 500 mL 的 4% 甲醛。
  3. 灌注后,用断头台进行斩首。
  4. 通过用骨切钳去除钙质,以避免损坏脑组织,从而进行大脑采集。
  5. 立即取出大脑,在4°C下固定在4%缓冲甲醛溶液中48小时。
  6. 将大脑从嗅球面块块块成5毫米的冠状部分,从视觉皮层和一部分分小脑和脑茎。
  7. 在石蜡嵌入后,通过微托姆切片切割日冕和下垂部分(5 μm),远离丘状人。

6. 免疫化学染色和检查

  1. 用软刷轻轻将切片放在玻璃幻灯片上,每张幻灯片 1 片。
  2. 生产βAPP的免疫化学染色。
    1. 用二甲苯脱硫切片(每片3次,每次5分钟),在室温下用逐渐降低乙醇浓度补充水分:3分钟在100%乙醇中两次,3分钟在95%乙醇中两次,3分钟在90%乙醇中,3分钟在70%乙醇中,3分钟在DDW中。
    2. 在室温下用3%H2O2治疗去石蜡和再水化脑部分15分钟,以阻止内源性过氧化物酶活性。
    3. 在98°C下用0.01M柠度钠(pH 6.0)孵育部分5分钟,用于抗原检索。
    4. 在室温下将滑片放在缓冲器中 20 分钟以冷却。
    5. 使用磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 溶液清洗部分两次,5 分钟。
    6. 在室温下用2.5%正常马血清将部分块1小时,并在原兔抗APP(1:4000)中在4°C下孵育一夜。
    7. 在原抗体中孵育后,在室温下洗涤PBS部分。
    8. 在适当稀释的生物微化二次抗体中孵育部分15分钟,在室温下用PBS洗涤3分钟两次。
    9. 在链球菌中孵育15分钟,在室温下再次在PBS中洗涤3分钟。
    10. 用缓冲基底溶液(pH 7.5)孵育含有过氧化氢和3,3-二氨基苯铬原溶液的部分,并保护光,直到颜色形成。
    11. 在室温下用 DDW 孵育幻灯片 5 分钟,以停止反应。
    12. 在室温下用血氧林对块进行3分钟,用流动的自来水洗涤5分钟。
    13. 在室温下,乙醇浓度逐渐增加,脱水:DDW 2 分钟,70% 乙醇 2 分钟,90% 乙醇 2 分钟,乙醇 2 分钟 95%,100% 乙醇 2 分钟,二甲苯 3 分钟。
    14. 用安装介质干燥并安装。
  3. 使用显微镜使用 20 mm 目标透镜在显微镜放大 200 倍下检查切片。

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Representative Results

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表 1说明了协议时间线。DAI模型的死亡率为0%。Mann-Whitney的一项测试表明,15只DAI大鼠的神经缺陷明显大于干预后48小时15只假鼠(Mdn = 1 vs. 0),U = 22.5,p < 0.001,r = 0.78(见表2)。数据以计数为单位进行测量,并呈现为中位数和 25-75 个百分位数范围。

图1显示了脑组织下部具有代表性的显微图。与对照组(67.46 × 30 vs. 0) 相比,微显图显示,在大鼠48小时后分离DAI后,xxon和神经元βAPP免疫反应,与对照组(67.46 × 30 vs. ± 0),U = 0,p < 1.1E-06,r = 0.92。数据以计数为单位进行测量,并呈现为均值 = SD。

时间 程序
DAI (15 只大鼠) 0 小时 感应扩散性无羟为损伤
沙姆 (15 只大鼠) 48 小时 神经严重性评分评估,
DAI (15 只大鼠) BAPP的免疫化学染色。

表 1:协议时间表的演示。实验开始时,显示不同时期的大鼠组:DAI = 扩散性斧脑损伤;48时,确定神经严重性评分,并在两组进行βAPP的免疫化学染色。

各个组的 NSS 值在 48 小时内
动物集团 N NSS 在 DAI 之后 48 小时
15 0 (0-0)
15 1 (1-1)*

表2::神经严重性评分。神经缺陷 48 小时后 DAI 为 2 个研究组。Mann-Whitney的一项测试表明,15只DAI大鼠的神经缺陷明显大于干预后48小时15只假鼠(Mdn = 1 vs. 0),U = 22.5,p < 0.001,r = 0.78。数据以计数为单位进行测量,并呈现为中位数和 25-75 个百分位数范围。

Figure 1
图1:免疫化学检查。与对照组(A)相比,脑组织下山面部分的代表性光显微图显示,在大鼠(B)受伤后48小时分离DAI后,xxonal和神经元免疫反应。*APP免疫反应在所有15只DAI大鼠感兴趣的区域被检测到,而在任何假操作的大鼠中则根本不检测。曼-惠特尼测试表明,15只DAI大鼠的βAPP阳性斧子数量明显高于戴大后48小时受伤的动物(67.46× 30 vs. ± 0),U = 0,p < 1.1E-06,r = 0.92。图像在原始放大倍率 = 200。数据以计数为单位进行测量,并呈现为平均值 = SD。请点击此处查看此数字的较大版本。

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Discussion

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该协议描述了DAI的啮齿动物模型。在DAI中,大脑旋转加速导致剪切效应,触发斧和生化变化,导致在渐进过程中失去六角函数。二次斧子变化是由快速的斧子拉伸损伤产生的,其范围和严重程度44、5、105,10是可变的。在主损伤后几到数天内,生化变化将导致斧功能44、5、105,10的丧失。损伤后,斧子膜的渗透性发生变化,允许大量钙流入。钙的摄入导致线粒体膨胀和断裂,释放卡帕塞,并触发caspase介导渐进细胞死亡454,5,10,11,20。,10,11,20,继发性斧伤可以呈现在破裂的末端的斧状灯泡的形式,或沿斧子44,21,2221,22的长度的静脉曲张的形式出现。神经冲动转换的丧失表现在β-淀粉样蛋白(#APP)的聚合,这是一种存在于大多数细胞和组织中的单一跨膜蛋白44、23、24、25、26。,23,24,25,26βAPP积累的免疫共化学分析是目前用于评估,DAI4、9、10、20、279,10的金标准临床和实验技术。,20427研究报告说,在受伤后约2小时开始,app免疫反应,但有证据表明,持续的变化持续一年或一年以上后,伤害23,28,29。23,28,29最脆弱的区域是脑干、脑皮层的寄生虫白质和体素11。

DAI体内常见的动物模型有横向流体打击模型30、31、31冲击加速度损伤32、33,33和受控皮质冲击模型3034、35、36。34,35,36这些模型提供了一些有用的结果,但存在显著限制。

动物模型中的流体打击模型通过将不同体积的盐水注入中线的封闭颅腔,特别是在猫和兔子模型中,或横向在啮齿动物模型30,31,31中,导致脑损伤。通过调节流体压力,伤害严重程度可能从轻微到严重不等。虽然这个模型是可靠和可重复的,它不是人类DAI的理想模型,因为打击损伤产生挫伤和/或亚性出血和主要影响的类型不同于现实生活中的伤害37,38。37,此外,大脑几何和颅内结构对方向、位移和速度的影响使得很难对损伤进行精确的生物力学分析

冲击加速伤害模型32,33,33使用分段黄铜重量自由下降从指定高度通过Plexiglas导管到金属头盔固定由牙科丙烯酸到大鼠的头骨顶点。该模型价格低廉,易于执行,可产生分级的DAI,但也有挫断和颅骨骨折的可能性,影响模型的可重复性。此外,诱导性损伤涉及的大脑体积比人类小不成比例。

受控皮质撞击模型采用气动或电磁冲击装置,通过单边颅骨切除术将刚性冲击器驱动到暴露的整个杜拉上,从而导致底层皮层16、17,17变形。气压负责冲击速度,皮质变形深度由连接气缸的横杆的垂直调节调节。与流体打击模型一样,它主要导致焦力损伤。

关于这些缺点,一个新的改良啮齿动物模型已经开发与在反边半球打开杜拉母体,产生更广泛的斧伤40。然而,大多数以前的模型需要颅骨切除术,和六角病的产生结果可能受挫伤和出血的影响,通常出现在以前的模型。此外,这些模型中的损伤机制与大脑加速减速运动引起的人类DAI不同。

协议中有几个步骤至关重要,值得认真考虑。应考虑大鼠的头部应紧紧固定在耳针上,否则大鼠可能会从设备中掉下来。坠落时,其他力可能起到影响任何计算准确性的作用。此外,铁的重量必须是特定的重量,并在该协议中所述的特定高度下降。这些测量是经过经验确定的,是模型复制的强制性条件。塑料气缸的安装应与旋转机构(即螺栓)相比角度为 90°。这是因为驱动旋转机构的是螺栓的命中。否则,引入铁重量相对于塑料缸的摩擦,这将导致施加在大鼠头部的力的减小。

此模型存在一些限制。DAI在人类中的发展主要与另一个物体的影响是次要的。在这种情况下,人员向对象移动,对象向人移动,或者它们彼此移动。在这样的碰撞中,患者会形成头部综合损伤,其中扩散性斧头损伤只是 TBI 的一部分。在这里,应用旋转加速度是导致DAI发展的主要机制,没有其他头部受伤的元素。

这里提出的模型似乎可以缓解颅骨骨折和挫伤的并发症,这些并发症在不加额外伤害的情况下造成广泛的白质损伤。与其他最近的啮齿动物模型类似,此模型有效,并提供低 (0%)死亡率。这是一种可重复和负担得起的技术,可以作为一个宝贵的资源,更好地了解DAI的病理生理学,以开发更有效的治疗方法。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

作者感谢内森·克利奥林博士(内盖夫本-古里安大学机械工程系)在生物力学测量方面的协助。此外,我们还感谢乌克兰德尼普罗大学生理学系的奥莱娜·斯潘诺夫斯卡教授、玛丽安娜·库舍里亚瓦教授、马克西姆·克里沃诺索夫教授、达里娜·亚库缅科教授和叶夫根尼亚·贡恰雷克教授对我们的讨论给予的支持和有益贡献。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.01 M sodium citrate SIGMA - ALDRICH
2.5% normal horse serum SIGMA - ALDRICH H0146 Liquid
4 % buffered formaldehyde solution
Anti-Amyloid Precursor Protein, C - terminal antibodyproduced in rabbit SIGMA - ALDRICH Lot 056M4867V
biotinylated secondary antibody Vector BA-1000-1.5 10 mM sodium phosphate, pH 7.8, 0.15 M NaCl, 0.08% sodium azide, 3 mg/ml bovine serum albumin
bone-cutting forceps
DAB Peroxidase (HRP) Substrate Kit (with Nickel), 3,3’-diaminobenzidine vector laboratory
embedding cassettes
ethanol 99.9 % ROMICAL Flammable Liquid
guillotine
Hematoxylin SIGMA - ALDRICH H3136-25G
Hydrogen peroxide solution Millipore 88597-100ML-F
Isofluran, USP 100% Piramamal Critical Care, Inc
Olympus BX 40 microscope Olympus
paraffine paraplast plus leica biosystem Tissue embedding medium
phosphate-buffered saline (PBS) SIGMA - ALDRICH P5368-10PAK Contents of one pouch, when dissolved in one liter of distilled or deionized water, will yield 0.01 M phosphate buffered saline (NaCl 0.138 M; KCl - 0.0027 M); pH 7.4, at 25 °C.
Streptavidin HRP ABCAM ab64269 Streptavidin-HRP for use with biotinylated secondary antibodies during IHC / immunohistochemistry.
xylene

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References

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基于旋转加速大鼠漫射性无羟基脑损伤的诱导
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Frank, D., Melamed, I., Gruenbaum, B. F., Grinshpun, J., Kuts, R., Shvartsur, R., Azab, A. N., Assadi, M. H., Vinokur, M., Boyko, M. Induction of Diffuse Axonal Brain Injury in Rats Based on Rotational Acceleration. J. Vis. Exp. (159), e61198, doi:10.3791/61198 (2020).More

Frank, D., Melamed, I., Gruenbaum, B. F., Grinshpun, J., Kuts, R., Shvartsur, R., Azab, A. N., Assadi, M. H., Vinokur, M., Boyko, M. Induction of Diffuse Axonal Brain Injury in Rats Based on Rotational Acceleration. J. Vis. Exp. (159), e61198, doi:10.3791/61198 (2020).

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