Este protocolo valida um modelo de roedor confiável, fácil de executar e reprodutível da lesão axonal difusa cerebral (DAI) que induz danos generalizados de matéria branca sem fraturas no crânio ou contusões.
Lesão cerebral traumática (TCE) é uma das principais causas de morte e incapacidade. A lesão axonal difusa (DAI) é o mecanismo predominante de lesão em uma grande porcentagem de pacientes com TCE que necessitam de internação. Dai envolve danos axonais generalizados por tremor, rotação ou lesão de explosão, levando a lesões rápidas de estiramento axonal e alterações axonais secundárias que estão associadas a um impacto duradouro na recuperação funcional. Historicamente, modelos experimentais de DAI sem lesão focal têm sido difíceis de projetar. Aqui validamos um modelo de roedor simples, reprodutível e confiável do DAI que causa danos generalizados de matéria branca sem fraturas no crânio ou contusões.
A lesão cerebral traumática (TCE) é uma das principais causas de morte e incapacidade nos Estados Unidos. Os TBIs contribuem para cerca de 30% de todas as mortes relacionadas a lesões1,2. As principais causas de TCE diferem entre as faixas etárias e incluem quedas, colisões em alta velocidade durante esportes, automutilação intencional, acidentes de veículos automotores e assaltos1,2,3.
A lesão axonal difusa cerebral (DAI) é um tipo específico de TCE induzido pela aceleração rotacional, tremor ou lesão de explosão do cérebro resultante do movimento irrestrito da cabeça no instante após a lesão4,5,6,7,8. O DAI envolve danos axonais generalizados que levam a um comprometimento neurológico de longa duração que está associado a um desfecho ruim, custos de saúde pesados e uma taxa de mortalidadede33-64% 1,2,4,5,9,10,11. Apesar de pesquisas recentes significativas sobre a patogênese do DAI, não houve consenso sobre as melhores opções de tratamento11,12,13,14.
Ao longo das últimas décadas, inúmeros modelos experimentais tentaram replicar com precisão diferentes aspectos do DAI11,,12,,15,,16. No entanto, esses modelos têm limitações dada a apresentação única do DAI em comparação com outras lesões focais. Esses modelos anteriores não só causam lesões axonais em regiões de matéria branca, mas também resultam em lesões cerebrais focais. Clinicamente, o DAI é acompanhado por micro hemorragias, que podem constituir uma grande causa de danos à matéria branca.
Apenas dois modelos animais foram mostrados para replicar as principais características clínicas do DAI. Gennarelli e colegas produziram o primeiro dispositivo de rotação de cabeça lateral em 1982, usando aceleração rotacional de cabeça sem impacto para induzir o coma com dai em um primata não humano modelo15. Este modelo primata utilizou rotação única controlada para aceleração e desaceleração para deslocar a cabeça através de 60° dentro de 10-20 ms. Esta técnica foi capaz de emular consciência prejudicada e dano axonal generalizado que se assemelhava aos efeitos do Tce grave observado em cérebros humanos. No entanto, os4modelos primatas são muito caros4,11,,16. Baseado em parte no modelo anterior, um modelo suíno de lesão cerebral de aceleração rotacional foi projetado em 1994 (Ross et al.) com resultados semelhantes14.
Esses dois modelos animais, embora tenham produzido diferentes apresentações de patologia típica, têm adicionado muito aos conceitos de patogênese da DAI. A rotação rápida da cabeça é geralmente aceita como o melhor método para induzir o DAI, e os roedores fornecem um modelo mais barato para os estudos rápidos de rotação da cabeça11,16. Aqui, validamos um modelo de roedor simples, reprodutível e confiável do DAI que causa danos generalizados de matéria branca sem fraturas no crânio ou contusões. Este modelo atual permitirá uma melhor compreensão da fisiopatologia do DAI e desenvolvimento de tratamentos mais eficazes.
Este protocolo descreve um modelo de roedor da DAI. No DAI, a aceleração rotacional no cérebro causa um efeito de cisalhamento que desencadeia alterações axonais e bioquímicas que levam à perda da função axonal em um processo progressivo. As alterações axonais secundárias são produzidas por uma lesão de estiramento axonal rápida e são variáveis em sua extensão e gravidade4,5,10. Dentro de horas a dias após a l…
The authors have nothing to disclose.
Os autores reconhecem com gratidão o Dr. Nathan Kleeorin (Departamento de Engenharia Mecânica da Universidade Ben-Gurion do Negev) por sua ajuda com as medidas biomecânicas. Além disso, agradecemos à professora Olena Severynovska, Maryna Kuscheriava, Maksym Kryvonosov, Daryna Yakumenko e Evgenia Goncharyk do Departamento de Fisiologia, Faculdade de Biologia, Ecologia e Medicina, Universidade Oles Honchar Dnipro, Dnipro, Ucrânia por seu apoio e contribuições úteis às nossas discussões.
0.01 M sodium citrate | SIGMA – ALDRICH | ||
2.5% normal horse serum | SIGMA – ALDRICH | H0146 | Liquid |
4 % buffered formaldehyde solution | |||
Anti-Amyloid Precursor Protein, C – terminal antibodyproduced in rabbit | SIGMA – ALDRICH | Lot 056M4867V | |
biotinylated secondary antibody | Vector | BA-1000-1.5 | 10 mM sodium phosphate, pH 7.8, 0.15 M NaCl, 0.08% sodium azide, 3 mg/ml bovine serum albumin |
bone-cutting forceps | |||
DAB Peroxidase (HRP) Substrate Kit (with Nickel), 3,3’-diaminobenzidine | vector laboratory | ||
embedding cassettes | |||
ethanol 99.9 % | ROMICAL | Flammable Liquid | |
guillotine | |||
Hematoxylin | SIGMA – ALDRICH | H3136-25G | |
Hydrogen peroxide solution | Millipore | 88597-100ML-F | |
Isofluran, USP 100% | Piramamal Critical Care, Inc | ||
Olympus BX 40 microscope | Olympus | ||
paraffine | paraplast plus leica biosystem | Tissue embedding medium | |
phosphate-buffered saline (PBS) | SIGMA – ALDRICH | P5368-10PAK | Contents of one pouch, when dissolved in one liter of distilled or deionized water, will yield 0.01 M phosphate buffered saline (NaCl 0.138 M; KCl – 0.0027 M); pH 7.4, at 25 °C. |
Streptavidin HRP | ABCAM | ab64269 | Streptavidin-HRP for use with biotinylated secondary antibodies during IHC / immunohistochemistry. |
xylene |