Detta protokoll validerar en pålitlig, lätt att utföra och reproducerbara gnagare modell av hjärnan diffusa axonal skada (DAI) som inducerar utbredd vit fråga skada utan skalle frakturer eller kontusioner.
Traumatisk hjärnskada (TBI) är en viktig orsak till dödsfall och funktionshinder. Diffusa axonal skada (DAI) är den dominerande mekanismen för skada i en stor andel av TBI patienter som kräver sjukhusvistelse. DAI innebär omfattande axonal skador från skakningar, rotation eller blast skada, vilket leder till snabb axonal stretch skada och sekundära axonal förändringar som är associerade med en långvarig inverkan på funktionella återhämtning. Historiskt sett har experimentella modeller av DAI utan fokal skada varit svåra att utforma. Här validerar vi en enkel, reproducerbar och pålitlig gnagare modell av DAI som orsakar omfattande vit materia skada utan skallfrakturer eller kontusioner.
Traumatisk hjärnskada (TBI) är en viktig orsak till dödsfall och funktionshinder i USA. Tbi bidrar till cirka 30 % av alla skaderelaterade dödsfall1,2. De främsta orsakerna till TBI skiljer sig mellan åldersgrupper och inkluderar fall, snabba kollisioner under sport, avsiktlig självskada, motorfordon kraschar och överfall1,2,3.
Hjärnan diffusa axonal skada (DAI) är en specifik typ av TBI framkallas av rotationsacceleration, skakning eller blast skada i hjärnan till följd av obegränsad huvudrörelse i omedelbar efter skada4,5,6,7,8. DAI innebär omfattande axonal skador som leder till långvariga neurologiska nedskrivningar som är förknippade med dåligt resultat, betungande sjukvårdskostnader, och en 33-64% dödlighet1,,2,4,5,9,10,11. Trots betydande ny forskning om patogenesen vid DAI, har det inte funnits en enighet om bästa behandlingsalternativ11,12,13,14.
Under de senaste decennierna har många experimentella modeller försökt att exakt replikera olika aspekter av DAI11,12,15,16. Dessa modeller har dock begränsningar med tanke på den unika presentationen av DAI jämfört med andra fokalskador. Dessa tidigare modeller inte bara orsaka axonal skada i vita frågor regioner men också resultera i fokal cerebrala skador. Kliniskt åtföljs DAI av mikro blödningar, som kan utgöra en viktig orsak till skador på vit materia.
Endast två djurmodeller har visat sig replikera de viktigaste kliniska funktionerna i DAI. Gennarelli och kollegor producerade den första laterala huvudrotationsenheten 1982, med hjälp av icke-effekt huvudrotationsacceleration för att inducera koma med DAI i en icke-mänsklig primatmodell15. Denna primat modell används kontrollerad enda rotation för acceleration och retardation att tränga huvudet genom 60 ° inom 10-20 ms. Denna teknik kunde efterlikna nedsatt medvetande och utbredd axonal skada som liknade effekterna av allvarliga TBI observerats i mänskliga hjärnor. Men primatmodeller är mycket dyra4,,11,16. Baserat delvis på den tidigare modellen, en gris modell av roterande acceleration hjärnskada utformades 1994 (Ross et al.) med liknande resultat14.
Dessa två djurmodeller, även om de producerade olika presentationer av typiska patologi, har lagt mycket till begreppen DAI patogenes. Snabb huvudrotation är allmänt accepterad som den bästa metoden för att inducera DAI, och gnagare ger en billigare modell för de snabba huvudrotationsstudierna11,16. Här validerar vi en enkel, reproducerbar och pålitlig gnagare modell av DAI som orsakar omfattande vit materia skada utan skallfrakturer eller kontusioner. Denna nuvarande modell kommer att möjliggöra bättre förståelse av patofysiologi av DAI och utveckling av effektivare behandlingar.
Detta protokoll beskriver en gnagare modell av DAI. I DAI, roterande acceleration på hjärnan orsakar en skjuvning effekt som utlöser axonal och biokemiska förändringar som leder till förlust av axonal funktion i en progressiv process. Sekundära axonal förändringar produceras av en snabb axonal stretch skada och varierar i sin omfattning och svårighetsgrad4,5,10. Inom några timmar till dagar efter den primära skadan, …
The authors have nothing to disclose.
Författarna erkänner tacksamt Dr Nathan Kleeorin (Institutionen för maskinteknik, Ben-Gurion University of the Negev) för hans hjälp med biomekaniska mätningar. Vi tackar också professor Olena Severynovska, Maryna Kuscheriava, Maksym Kryvonosov, Daryna Yakumenko och Evgenia Goncharyk vid institutionen för fysiologi, fakulteten för biologi, ekologi och medicin, Oles Honchar Dnipro University, Dnipro, Ukraina för hennes stöd och användbara bidrag till våra diskussioner.
0.01 M sodium citrate | SIGMA – ALDRICH | ||
2.5% normal horse serum | SIGMA – ALDRICH | H0146 | Liquid |
4 % buffered formaldehyde solution | |||
Anti-Amyloid Precursor Protein, C – terminal antibodyproduced in rabbit | SIGMA – ALDRICH | Lot 056M4867V | |
biotinylated secondary antibody | Vector | BA-1000-1.5 | 10 mM sodium phosphate, pH 7.8, 0.15 M NaCl, 0.08% sodium azide, 3 mg/ml bovine serum albumin |
bone-cutting forceps | |||
DAB Peroxidase (HRP) Substrate Kit (with Nickel), 3,3’-diaminobenzidine | vector laboratory | ||
embedding cassettes | |||
ethanol 99.9 % | ROMICAL | Flammable Liquid | |
guillotine | |||
Hematoxylin | SIGMA – ALDRICH | H3136-25G | |
Hydrogen peroxide solution | Millipore | 88597-100ML-F | |
Isofluran, USP 100% | Piramamal Critical Care, Inc | ||
Olympus BX 40 microscope | Olympus | ||
paraffine | paraplast plus leica biosystem | Tissue embedding medium | |
phosphate-buffered saline (PBS) | SIGMA – ALDRICH | P5368-10PAK | Contents of one pouch, when dissolved in one liter of distilled or deionized water, will yield 0.01 M phosphate buffered saline (NaCl 0.138 M; KCl – 0.0027 M); pH 7.4, at 25 °C. |
Streptavidin HRP | ABCAM | ab64269 | Streptavidin-HRP for use with biotinylated secondary antibodies during IHC / immunohistochemistry. |
xylene |