Summary
نُظهر اختبار سمية الطحالب للمواد الصعبة (مثل المواد الملونة أو المواد النانوية) باستخدام إعداد مضاء عموديًا بمُدرّي.
Abstract
13 - بيانات السمية الإيكولوجية هي شرط لتسجيل المواد الكيميائية قبل السوق وما بعدها بواسطة اللوائح الأوروبية والدولية (مثل نظام REACH). وكثيراً ما يستخدم اختبار سمية الطحالب في التقييم التنظيمي للمخاطر الكيميائية. ومن أجل تحقيق موثوقية عالية وقابلية استنساخ عالية، يعد وضع مبادئ توجيهية موحدة أمرا حيويا. وبالنسبة لاختبار السمية الطحالب، تتطلب المبادئ التوجيهية ظروفاً مستقرة وموحدة من المعلمات مثل درجة الحرارة ودرجة الحرارة ومستويات ثاني أكسيد الكربون وكثافة الضوء. ويمكن أن تتداخل المواد النانوية وغيرها من المواد التي تسمى بمواد صعبة مع الضوء مما يسبب تباينا كبيرا في النتائج التي تم الحصول عليها مما يعوق قبولها التنظيمي. ولمعالجة هذه التحديات، قمنا بتطوير LEVITATT (جدول الإضاءة العمودي LED لاختبارات سمية الطحالب). يستخدم الإعداد إضاءة LED من الأسفل مما يسمح بتوزيع الضوء المتجانس والتحكم في درجة الحرارة مع تقليل تظليل العينة الداخلية. الإعداد يحسن حجم العينة للكتلة الحيوية الكم ولا في الوقت نفسه ضمان تدفق كافية من CO2 لدعم النمو الأسي للطحالب. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تصميم مواد حاويات الاختبار لتقليل الامتزاز والتطاير. عند اختبار المواد الملونة أو تعليق الجسيمات، واستخدام أضواء LED يسمح أيضا لزيادة شدة الضوء دون توليد الحرارة إضافية. يزيد التصميم المدمج والمتطلبات الدنيا من المعدات من إمكانيات تنفيذ نظام LEVITATT في مجموعة واسعة من المختبرات. في حين أن الامتثال للمبادئ التوجيهية ISO ومنظمة التعاون والتنمية في الميدان الاقتصادي لاختبار السمية الطحالب، أظهرت LEVITATT أيضا انخفاض في التغير بين العينات لمادتين مرجعيتين (3،5-ديكولوروبفينول وK2Cr2O7)وثلاثة المواد النانوية (ZnO، CeO2،وBaSO4)مقارنة مع قارورة إرلنماير وألواح microtiter.
Introduction
اختبار السمية الطحالب هو واحد من ثلاثة اختبارات إلزامية فقط تستخدم لتوليد بيانات السمية الإيكولوجية المطلوبة لتسجيل المواد الكيميائية قبل وبعد السوق بواسطة اللوائح الأوروبية والدولية (مثل REACH1 و TSCA (الولايات المتحدة الأمريكية)). ولهذا الغرض، وضعت المنظمات الدولية مبادئ توجيهية موحدة لاختبار الطحالب (مثل المنظمة الدولية للتوحيد القياسي ومنظمة التعاون والتنمية في الميدان الاقتصادي). هذه المعايير والمبادئ التوجيهية اختبار يصف ظروف الاختبار المثالي من حيث درجة الحرارة ودرجة الحرارة، ومستويات ثاني أكسيد الكربون وكثافة الضوء. غير أن الحفاظ على ظروف اختبار مستقرة أثناء اختبار الطحالب أمر صعب في الممارسة العملية، وتعاني النتائج من مشاكل في قابلية التكاثر والموثوقية لمجموعة من المواد الكيميائية والمواد النانوية (التي يشار إليها في كثير من الأحيان باسم "المواد الصعبة")2. معظم الاجهزة القائمة اختبار السمية الطحالب تعمل مع كميات كبيرة نسبيا (100-250 مل) تقع على شاكر المدارية داخل حاضنة. ويحد هذا الإعداد من عدد تركيزات الاختبار ويستنسخ كميات كبيرة وقابلة للتحقيق من ثقافة الطحالب ومواد الاختبار. بالإضافة إلى ذلك، نادراً ما يكون لهذه الاجهزة حقل ضوء موحد وظروف الإضاءة الموثوقة هي كذلك من الصعب الحصول عليها في قارورات كبيرة، جزئياً حيث تقلل كثافة الضوء بشكل كبير من زيادة الرحلات الخفيفة وجزئياً بسبب هندسة القارورة. وتشمل الاجهزة البديلةألواح 3 من البلاستيك التي تحتوي على أحجام عينات صغيرة لا تسمح بأحجام كافية لأخذ العينات لقياس رقمH أو قياسات إضافية للكتلة الحيوية أو استخراج الصباغ أو غيرها من التحليلات التي تتطلب أخذ عينات مدمرة. أحد التحديات الخاصة باستخدام الاجهزة الموجودة لاختبار سمية الطحالب من المواد النانوية والمواد التي تشكل التعليقات الملونة هو التدخل أو حجب الضوء المتوفر للخلايا الطحالب ، وغالبا ما يشار إليها باسم "التظليل"4،5. قد يحدث التظليل داخل قوارير بواسطة مادة الاختبار و/أو التفاعلات بين مادة الاختبار وخلايا الطحالب، أو يمكن أن يحدث التظليل بين القنينات، بسبب تحديد موضعها بالنسبة لبعضها البعض ومصدر الضوء.
وتستند هذه الطريقة على إعداد اختبار السمية الطحالب على نطاق صغير الذي قدمه أرينسبرغ وآخرون6 الذي يسمح بإجراء الاختبار وفقا لمعايير مثل OECD 2017، وISO 86928. والطريقة هي أكثر الأمثل لمعالجة القيود المذكورة أعلاه من خلال: 1) استخدام تكنولوجيا ضوء LED لضمان ظروف ضوئية موحدة مع توليد الحرارة الحد الأدنى، 2) توفير حجم عينة كافية للتحليل الكيميائي / البيولوجي مع الحفاظ على درجة حرارة ثابتة، ومستويات CO2، و 3) تمكين استخدام مواد حاوية اختبار متعددة الاستخدامات لاختبار المواد المتطايرة أو المواد ذات الإمكانية العالية للفحص.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. وصف الإعداد LEVITATT
- استخدام 20 مل قنينات الزجاج التلألؤ(الشكل 1، إدراج 1) السماح للاختراق الضوء. بدلا من ذلك، يمكن استخدام قارورة بلاستيكية خفيفة قابلة لل ركلة. كمّيّة ال [اّينتّر هّدّدّدّيّرّيّ].
- استخدام تعليق اختبار 4 مل على الأقل في بداية الاختبار للسماح بالتجريد الكمي للكتلة الحيوية وتحديد الخواص/القياس الكمي للمواد النانوية أثناء وبعد الاحتضان(الشكل 1، إدراج 2).
- تناسب قوارير مل 20 مل مع قبعة (الشكل 1، إدراج 3) حيث يتم حفر ثقب صغير (ما يقرب من 1 مم في القطر) للسماح لتبادل CO2 مع الغلاف الجوي. هذا التبادل أمر بالغ الأهمية لضمان مستويات ثابتة من مستويات الـ PH وCO2 أثناء الاختبار.
- للمواد المتطايرة، استخدم غطاء مغلفة تفلون محكم الهواء للسماح CO2 إثراء من headspace باستخدام حقنة9 أو قارورة مغلقة تماما مع عدم وجود مرحلة الغاز الذي يتم الحفاظ على CO2 في الحل من قبل بيكربونات الصوديوم المخصب (NaHCO3) نظامعازلة 10.
- ربط القوارير مع المشابك التي شنت على الغلاف الخارجي (الشكل 1، إدراج 4).
- استخدام مصدر ضوء LED الموجود تحت قوارير الاختبار(الشكل 1، إدراج 5) توفير إضاءة فلورية موحدة من نوع "بارد أبيض" أو "ضوء النهار" وشدة الضوء في نطاق 60-120 μE∙m-2•s-1 تقاس في نطاق الطول الموجي الفعال للضوء من 400 نانومتر إلى 700 نانومتر. يستخدم الإعداد كثافة الضوء قابل للتعديل في نطاق 5-160 μE•m -2•s-1 عن طريق تركيب باهتة الضوء إلى المصدر. وهذا يسمح للاختبار في كثافة الضوء أعلى وأقل.
- جبل الإعداد على شاكر المدارية لتهيج العينات طوال مدة الاختبار. هذا يحافظ على الخلايا في تعليق حر ويسهل CO2 نقل الشامل من الهواء إلى الماء(الشكل 1, إدراج 6).
- وضع الإعداد في غرفة درجة الحرارة التي تسيطر عليها أو مجلس الوزراء الحرارة للحفاظ على درجات حرارة مستقرة طوال الاختبار(الشكل 1، إدراج 7).
الشكل 1: صورة جدول الإضاءة العمودي LED لاختبارات سمية الطحالب (LEVITATT). 1) 20 مل قنينات التسجيل الزجاجي للحضانة، 2) عينة 4 مل للتحليل، 3) غطاء مع ثقب حفر لتبادل CO2، 4) غلاف لظروف الضوء المحدد، 5) مصدر ضوء LED الموجود في وسط الغلاف، 6) شاكر المداري للهياج أثناء التجربة، و 7) مجلس الوزراء thermostatic. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
2- إعداد وسيط نمو الطحالب
- و ISO 8692 الطحالب نمو المتوسطة يتكون من أربعة حلول مختلفة للأسهم. تزن كمية مناسبة من الأملاح وتمييع في المياه فائقة الpure وفقا للجدول 1.
| حلول الأسهم | المغذيات | التركيز في محلول المخزون | التركيز في محلول الاختبار |
| 1: المغذيات الكبيرة | NH4Cl | 1.5 غرام/لتر | 15 ملغم / لتر (ن: 3.9 ملغ / لتر) |
| MgCl2• 6H2O | 1.2 غرام/لتر | 12 ملغم / لتر (ملغ: 2.9 ملغ / لتر) | |
| CaCl2• 2H2O | 1.8 غرام/لتر | 18 ملغم / لتر (كاليفورنيا: 4.9 ملغ / لتر) | |
| MgSO4• 7H2O | 1.5 غرام/لتر | 15 ملغم / لتر (S: 1.95 ملغ / لتر) | |
| KH2PO4 | 0.16 غ/لتر | 1.6 ملغم / لتر (P: 0,36 ملغ / لتر) | |
| 2: Fe-EDTA | FeCl3• 6H2O | 64 ملغم / لتر | 64 ميكروغرام/لتر (في: 13 ميكروغرام/لتر) |
| Na2EDTA• 2H2O | 100 ملغ / لتر | 100 ميكروغرام/لتر | |
| 3: عناصر تتبع | H3BO3a | 185 ملغم / لتر | 185 ميكروغرام/لتر (ب: 32 ميكروغرام/لتر) |
| MnCl2∙ 4H2O | 415 ملغ/ لتر | 415 ميكروغرام/لتر (عدد الغمات: 115 ميكروغرام/لتر) | |
| ZnCl2 | 3 ملغ / لتر | 3 ميكروغرام/لتر (زنة: 1.4 ميكروغرام/لتر) | |
| CoCl2• 6H2O | 1.5 ملغم/لتر | 1.5 ميكروغرام/لتر (Co: 0.37 ميكروغرام/لتر) | |
| CuCl2• 2H2O | 0.01 ملغم/لتر | 0.01 ميكروغرام/لتر (مكعب: 3.7 نانوغرام/لتر) | |
| Na2MoO4• 2H2O | 7 ملغ / لتر | 7 ميكروغرام/لتر (مو: 2.8 ميكروغرام/لتر) | |
| 4: NaHCO3 | NaHCO3 | 50 غرام /لتر | 50 ملغم / لتر (ج: 7.14 ملغ / لتر) |
الجدول 1: تركيزات المغذيات في حلول المخزون من أجل متوسط نمو الطحالب
ملاحظة: H3BO3 يمكن أن تذوب بإضافة 0.1 M NaOH. يجب إزالة EDTA عند اختبار المعادن، لتجنب التعقيد مع أيونات المعادن. تعقيم حلول الأسهم عن طريق الترشيح غشاء (متوسط قطر المسام 0.2 μm) أو عن طريق autoclaving (120 درجة مئوية، 15 دقيقة). لا يوجد حلول الأسهم الأوتوكلاف 2 و 4، ولكن تعقيم لهم عن طريق الترشيح غشاء. تخزين الحلول في الظلام عند 4 درجة مئوية.
- لإنتاج 1 لتر من الطحالب متوسطة النمو، ونقل 500 مل تعقيم المياه فائقة السخاء في 1 L تعقيم قارورة الحجمية وإضافة 10 مل من الأسهم الحل 1: المغذيات الكبيرة، 1 مل من الأسهم الحل 2: Fe-EDTA، 1 مل من الأسهم الحل 3: العناصر النادرة، و 1 مل من الأسهم الحل 4: NaHCO3.
- ملء ما يصل إلى 1 لتر مع المياه فائقة الطهر تعقيم، سدادة قارورة ويهز جيدا لتجانس متوسطة نمو الطحالب.
- اكويبيل الحل قبل الاستخدام عن طريق تركها بين عشية وضحاها في اتصال مع الهواء أو عن طريق محتدما مع العقيمة، وتصفية الهواء لمدة 30 دقيقة. بعد التوازن، قم بضبط درجة حُكَرَة النفايات، إذا لزم الأمر، إلى 8.1 ± 0.2، إما بـ 1 M HCl أو 1 M NaOH.
3. إعداد اختبار الطحالب
ملاحظة: يتم عرض مخطط تدفق إجراء اختبار الطحالب في الشكل 2.
الشكل 2: رسم تخطيطي للتدفق لإعداد اختبار الطحالب. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
- إعداد حل الأسهم من مجمع اختبار في التركيز اختبار أعلى المطلوب في متوسط نمو الطحالب أعدت وفقا للخطوة 2. لإعداد حلول الأسهم / التعليقات، اتبع منظمة التعاون والتنمية في الميدان الاقتصادي 201 (للمركبات القابلة للذوبان) أو OECD 318 (للمواد النانوية).
- قياس في مستوى الأسهم في حل الأسهم. إذا كان ينحرف أكثر من وحدة واحدة من متوسط نمو الطحالب، ضبط درجة ح H إلى 8 مع إما 1 M HCl أو 1 M NaOH.
- احسب حجم التلقين اللازم للوصول إلى تركيز الخلية النهائي من 1 × 104 خلايا /مل في حل اختبار 25 مل.
ملاحظة: يجب أن تأتي inoculum من ثقافة غير ملوثة تزايداً أسياً Raphidocelis رأس المال الفرعي نمت باستخدام إعداد LEVITATT. - حساب كمية من محلول الأسهم لإضافة إلى كل قارورة حجم 25 مل الحجمي للحصول على تركيزات الاختبار المطلوب. وينبغي ألا يتجاوز العامل بين كل تركيز 3.2.
- مارك واحد 25 مل قارورة الحجم لكل تركيز المختارة و 25 مل إضافية تحكم الحجمي قارورة ملحوظ.
- إضافة كمية من محلول المخزون من مجمع الاختبار اللازمة للوصول إلى التركيزات المطلوبة إلى قارورة حجم 25 مل. لا تقم بإضافة حل الأسهم إلى عنصر التحكم.
- أضف المتوسط إلى كل قارورة حجمية 25 مل للوصول إلى حجم 20 مل تقريبا.
- إضافة حجم inoculum المحسوبة في الخطوة 3.3 إلى كل قارورة حجمية 25 مل. أضف المتوسط إلى كل قارورة حجمية 25 مل إلى حجم إجمالي نهائي قدره 25 مل.
- سداد القارورة وخلط جيدا عن طريق تحويل القارورة مرتين عموديا.
- نقل 0.4 مل من كل قارورة إلى قارورة قبعة المسمار الفردية وإضافة 1.6 مل من الأسيتون (المشبعة مع MgCO3):عينة واحدة لكل تركيز الاختبار والسيطرة. أغلق الأغطية بإحكام واحفظها في الظلام في درجة حرارة الغرفة حتى قياسات الفلور (القسم 4).
- Pipet 4 مل من كل حل اختبار في 20 مل قنينات التلألؤ (3 يكرر لكل تركيز و 5 يكرر للسيطرة). أغطية المسمار على قوارير التلألؤ. تذكر أن الأغطية يجب أن يكون لها ثقب حفر (ما يقرب من 1 مم في القطر) للسماح لتبادل CO2.
- بعد 24 ح، 48 ح، و 72 ساعة، pipet 0.4 مل من كل قارورة إلى قنينات قبعة المسمار وإضافة 1.6 مل من الأسيتون (المشبعة مع MgCO3). أغلق الأغطية بإحكام واحفظها في الظلام في درجة حرارة الغرفة حتى قياسات الفلور (القسم 4).
- بعد أخذ العينة الأخيرة في 72 ساعة، تجمع بلطف التكرارات الثلاثة لتركيز معين في قارورة واحدة وقياس درجة ح. كرر لجميع التركيزات والسيطرة. وينبغي أن لا ينحرف درجة حُرْر أكثر من 1.5 وحدة عن درجة حَسِّيِّه الأولي لأي من العينات المقاسة.
- تصريف السوائل المتبقية في حاوية نفايات وفقا للقواعد والأنظمة المؤسسية الخاصة بك.
4. تحليل عينات اختبار الطحالب
- استخدام مطياف الفلوريسنس لقياس الكتلة الحيوية الطحالب (هنا كما هو الكلورو فيريل A). وتبلغ ذروة الانبعاثات بالنسبة للكلورووفيل ألف 420 نانومتر الطول الموجي للإثارة و671 نانومتر الطول الموجي للانبعاثات.
- قياس الفلورية لكل عينة على حدة ثلاث مرات وحساب متوسط قيمة كل عينة.
- استخدم المعادلة 1 لحساب معدل النمو. ويمكن استخدام الفلورس (الوحدات النسبية) المقاسة مباشرة كمعلمة الكتلة الحيوية في المعادلة 1.
المعادلة 1: μ = (ln Nt – ln N0) / t
حيث μ هو معدل النمو (د-1)،N0 هو الكتلة الحيوية الأولية، Nt هو الكتلة الحيوية في الوقت t، و t هو طول فترة الاختبار (d). ملاحظة، N0 و Nر ينبغي أن أعرب في نفس الوحدة. - استخدام برنامج إحصائي لتناسب منحنى الانحدار غير الخطي (على سبيل المثال، وظيفة log-logistic أو Weibull) لبيانات معدل النمو للحصول على قيم تركيز فعالة عند 10٪، 20٪، و 50٪ تثبيط. في المعلومات التكميلية، يُعطى مثال على رمز لتركيبه في البرنامج الإحصائي R باستخدام حزمة DRC11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يتم إجراء اختبار أولي مع مادة مرجعية لتحديد حساسية سلالة الطحالب. المواد المرجعية المستخدمة بانتظام لر. 10000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 7,8 ويبين الشكل 3 والجدول 2 نتيجة تمثيلية لاختبار الطحالب بما في ذلك تركيب المنحنى والنواتج الإحصائية عندما تطبق حزمة جمهورية الكونغو الديمقراطية في R على معدلات النمو.
الشكل 3: منحنى استجابة تركيز ممثل لـ 72 ساعة من التعرض لمركب كيميائي للطحالب(R. subcapitata). يمثل الخط المصمت تناسب log-logistic والمنطقة المظللة هي الفاصل الزمني الثقة 95% للاحتواء. تمثل الدوائر المفتوحة معدل النمو المحسوب لكل نسخة متماثلة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| EC10 | EC20 | EC50 | |
| [ملغ/لتر] | [ملغ/لتر] | [ملغ/لتر] | |
| مركب كيميائي | 4.6 [1.8-7.5] | 7.4 [4.1-11] | 16.9 [11-22] |
الجدول 2: التركيزات الفعالة التمثيلية لـ 10% و20% و50% تثبيط معدل نمو مركب كيميائي باستخدام الطحالب (R. القيمة بين قوسين تمثل فاصل الثقة 95% من تركيب log-logistic.
سيكون للاختبار الناجح معدلات نمو أعلى من 0.9 د-1 للامتثال للمبدأ التوجيهي لمنظمة التعاون والتنمية في الميدان الاقتصادي و 1.5 د-1 للامتثال للمبادئ التوجيهية ISO 8692 وينبغي أن تحتوي على تركيز واحد على الأقل بين 0٪ و 100٪ تثبيط. قد تحدث معدلات نمو منخفضة نتيجة لقضايا مختلفة مثل التلوث البكتيري أو عدم وجود حقنة في مرحلة النمو الأسي في بداية الاختبار. وينبغي أن التحقيق المجهري من التكرارات تظهر فقط موحدة المنجلي على شكل الطحالب الخضراء(R. subcapitata)مع أبعاد حوالي 2 ميكرومتر العرض و8 μm طول. وإذا كان هناك تكرار واحد ملوث، يمكن حذفه ويمكن إجراء التحليل بدون هذه البيانات. ومع ذلك، إذا كانت العديد من النسخ المتماثلة ملوثة، كرر التجربة مع inoculum المتزايد بشكل كبير غير ملوث. لتقييم ما إذا كان inoculum في مرحلة النمو الأسي في بداية الاختبار، وحساب معدل النمو من السيطرة يتكرر في فترات 24 ساعة واستخدام الفترة الزمنية فقط التي نمو الطحالب من عنصر التحكم أسي للتحليل الإحصائي.
لاختبار مدى قوة الإعداد، تم تكرار اختبار السمية باستخدام مادتين مرجعيتين (K2Cr2O7 و 3,5-Dichlorophenol) وثلاث مواد نانوية ثلاث مرات (3،5-ثنائي كلوروفينول، BaSO4 الجسيمات النانوية (NM-220)، و جسيمات نانوية ZnO (NM-111)) وأربع مرات (K2Cr2O7 و CeO2 الجسيمات النانوية (NM-212)). وأظهرت النتائج معامل تباين في50-القيم EC بين 11٪ و 39٪، مع أدنى معامل تباين لوحظ لجسيمات نانوية ZnO (NM-111) وأعلى معامل للتباين للجسيمات النانوية CeO2 (NM-212)(الجدول 3).
| مجمع | # من التجارب | معامل التغير بين العينات لمعدل النمو % |
EC50 (متوسط) ملغم/ لتر |
معامل التغير لقيم EC50 % |
| K2Cr2O7 | 4 | 4.5 | 0.73 | 13 |
| 3،5-ثنائي كلوروفينول | 3 | 3.4 | 1.9 | 21 |
| BaSO4 NP (NM-220) | 3 | 5.6 | 22 | 20 |
| CeO2 NP (NM-212) | 4 | 4.3 | 13 | 39 |
| ZnO NP (NM-111) | 3 | 3.4 | 0.13 | 11 |
الجدول 3: نتائج اختبار داخلي للسمية المختبرية مع رأس تحت غطاء تحت الرأس R. معرض لمدة 72 ساعة إلى مادتين مرجعيتين وثلاث مواد نانوية من مستودع JRC
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
العوالق النباتية تحول الطاقة الشمسية وثاني أكسيد الكربون إلى مادة عضوية، وبالتالي لها دور محوري في النظام الإيكولوجي المائي. ولهذا السبب، تدرج اختبارات تثبيط نمو الطحالب كأحد ثلاثة اختبارات إلزامية للسمية المائية اللازمة لتقييم المخاطر التنظيمية للمواد الكيميائية. والقدرة على إجراء اختبار سمية الطحالب الموثوق به والقابلة للتكرار أمر أساسي في هذا الصدد. اختبار الاجهزة باستخدام قارورة Erlenmeyer يقدم مجموعة من variabilities والمضايقات كما هو موضح في المقدمة. للتحايل على هذه المسألة، تم اقتراح لوحات microtiter3. وفي حين أن لوحات الأجهزة الصغيرة تقلل من حجم ومساحة الاختبار، فقد أثيرت شواغل في المؤلفات فيما يتعلق بمدى امتثال هذه المنشآت لمعايير صلاحية الاختبار للمبادئ التوجيهيةللاختبار 6. على سبيل المثال، فقد تم مؤخراً إثبات خسارة كبيرة للمواد الكيميائية شبه الكهربائية وكذلك الآبار الأخرى في ألواح الأجهزة الدقيقة عند 37 درجة مئوية في وسائط النمو الخلوي (DMEM GluteMAX و Opti-MEM وHams F12 GlutaMAX) مؤخرًا من قبل بيرش وآخرون12. اختبار المواد المتطايرة يمكن إجراؤه بنجاح مع إعداد LEVITATT باستخدام 1) قنينات مغلقة مع CO2 المخصب headspace9، 2) مباشرة القذف المركب المتطاير من خلال headspace13 أو في قارورة اختبار10. من حيث متطلبات المساحة، توفر LEVITATT إعداد اختبار يسد الفجوة بين لوحات microtiter و قارورة Erlenmeyer الاجهزة في حين لا تزال توفر فوائد من كل من الاجهزة ، على سبيل المثال ، والحفاظ على بيئة اختبار موجزة وصغيرة الحجم كافية لأخذ العينات المدمرة (على سبيل المثال ، لتوصيف المواد النانوية أثناء الاختبار).
وتراوحت التقلبات بين العينات لنظام اختبار LEVITATT بين 3.4 في المائة (3.5-ثنائي كلوروفينول وزانو NP) و5.6 في المائة (BaSO4 NP). وهذا ضمن شرط معامل تفاوت متوسط النمو في ثقافات التحكم المتماثلة بنسبة 15% التي أشار إليها المبدأ التوجيهي7 لمنظمة التعاون الاقتصادي والتنمية (OECD 201) (بالنسبة للتباين بين العينات التي تم تضمينها في LEVITATT).
وأظهرت قابلية التكاثر فيما يتعلق بـEC 50-قيم إعداد الاختبار للمواد المرجعية معامل تباين بنسبة 13% بالنسبة لـ K2Cr2O7 (n = 4) و21% لـ 3,5-ثنائي كلوروفينول (n = 3). وهذا يماثل الاختبارات التي أجريت مع قارورة Erlenmeyer التقليدية 250 مل bioassays للمادة المرجعية K2Cr77 تبين 16.8٪14 و 25.4٪15 معامل الاختلاف لEC50-values. وقد أظهرت ألواح المُتَرَقّة الصغر معامل تباين أقل لبعض المواد المرجعية (على سبيل المثال، K2Cr2O7 (9٪14،15)، في حين لوحظت معاملات أعلى للتباين في الفينول (34.9٪16)و Dichlorophenol (38٪17). ولا تتوافر سوى معلومات محدودة فيما يتعلق بقابلية استنساخ الدراسات ذات المواد النانوية. ومع ذلك، مقارنة معامل التباين بين العينات لـ ZnO NPs باستخدام نظام LEVITATT (3.4%) مع لوحات microtiter (67٪18) أو قارورة Erlenmeyer (13٪19 و 35٪20)لديها أقل الاختلاف. ولمزيد من الاختبار مدى قوة نظام LEVITATT، بدأت دراسة مستديرة لمواد اختبار (مادة مرجعية واحدة والأخرى يصعب اختبارها.
الحفاظ على ثقافة الطحالب غير الملوثة يمكن أن يكون صعبا إذا لم يتم التعامل معها في ظروف عقيمة. نمو الطحالب الأسي هو شرط أساسي لأداء اختبار الطحالب التوجيهية. قياس النمو في نقاط زمنية متعددة (على سبيل المثال، 24 h، 48 h، 72 h) يمكن تحديد ما إذا كان النمو الأسي يحدث طوال فترة الاختبار. تقلبات في درجة الحرارة ودرجة الحرارة يمكن أن تؤثر على نمو الطحالب; وبالتالي، يجب أن تكون هذه المعلمات مستقرة خلال فترة الاختبار. وفي أحجام صغيرة من عينة الاختبار، تحدث التقلبات في درجة الحرارة ودرجة الحرارة بسرعة أكبر مقارنة بالأحجام الكبيرة، وتزداد صعوبة المشاكل العملية لقياس هذه المعلمات مع انخفاض حجم الاختبار. وكانت المعلمات مثل درجة حَسْني ودرجة الحرارة باستخدام 4 مل اختبار حجم مستقر طوال فترة اختبار 72 ساعة في LEVITATT سواء في غرفة درجة حرارة تسيطر عليها عند 20 درجة مئوية ± 2 درجة مئوية وفي حاضنة في ظروف مماثلة.
الطرق التحليلية لقياس كمية نمو الطحالب كثيرة: عد الخلايا في مقياس الهيموزيت، أو مضادة كولتر، أو الفلور من مستخلصات الصباغ. وفيما يتعلق بالمواد الصعبة، ينبغي النظر في أنسب طريقة لتحديد كمية الكتلة الأحيائية. بالنسبة للجسيمات النانوية أكسيد المعادن، تم العثور على الفلوريسنس من مستخلصات الصباغ لأداء أفضل بسبب تدخل من أججلوميرات عند عد الطحالب بواسطة قياس الهيموسيت أو coulter عداد21. وعلى النقيض من ذلك، وجد Farkas و22 أن القياس الكمي للكتلة الحيوية بواسطة الفلورسينس لم يكن طريقة مناسبة لاختبار السمية الإيكولوجية للمواد النانوية الكربونية بسبب الفلوروسومومومبسنس وامتصاص الصبغات للمواد النانوية. وبالنسبة للمواد الملونة، قد يكون هناك أيضا تداخل للون مع إشارة الانبعاثات المفلورة، وبالتالي، تتطلب ضوابط إضافية أو تخفيف إلى مستوى حيث يكون هذا التداخل لا يكاد يذكر.
في وثيقة التوجيه لاختبار السمية المائية للمواد الصعبة2، واحدة من التوصيات لاختبار المواد الملونة هو زيادة كثافة الضوء. وبالمثل، فقد ذكر زيادة كثافة الضوء للتحايل على قضايا التظليل عند اختبار المواد النانوية23،24. ومع ذلك، غالباً ما ترتبط هذه التعديلات مع ارتفاع درجات الحرارة، وبالتالي، تتطلب تبريد أو تهوية إضافية للعينات. في إعداد LEVITATT ، يتم حل هذا باستخدام ضوء LED الذي ينتج حرارة صغيرة مقارنة بالمصابيح الكهربائية التقليدية أو أنابيب الفلورسنت. بالإضافة إلى ذلك، اختيار الصمام مع ارتفاع درجة عالية من الانتاج كثافة الضوء وتركيب باهتة تسمح لزيادة كثافة الضوء لاختبار المواد الملونة أو المواد النانوية والمواد الكيميائية العادية دون تغيير الإعداد العام بين الاختبارات. وعلاوة على ذلك، فإن وضع مصدر الضوء تحت العينات وفي أغلفة منفصلة يسمح بوجود حقل ضوئي متسق ومتجانس.
وفي الختام، يوفر LEVITATT منصة مدمجة لاختبار سمية الطحالب للمواد الكيميائية العادية المتوافقة مع المبادئ التوجيهية الدولية الموحدة. وعلاوة على ذلك، يوفر الإعداد منصة قوية لاختبار المواد الصعبة التي تتداخل مع مرور الضوء نحو الطحالب، مثل المواد النانوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
تم تمويل هذا البحث من قبل PATROLS - الأدوات المتقدمة لاختبار NanoSafety ، اتفاقية المنحة 760813 في إطار برنامج البحث والابتكار في أفق 2020.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Sigma-Aldrich | V179124 | |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | 254134 | |
| BlueCap bottles (1L) | Buch & Holm A/S | 9072335 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B0394 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | 208290 | |
| Clear acrylic sheet (40x40 cm) | |||
| Cobalt(II) chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 255599 | |
| Copper(II) chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | 307483 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Fluorescence Spectrophotometer F-7000 | Hitachi | ||
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| Iron(III) chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 236489 | |
| LED light source | Helmholt Elektronik A/S | H35161 | Neutral White, 6500K |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Manganese(II) chloride tetrahydrate | Sigma-Aldrich | 221279 | |
| Orbital shaker | IKA | 2980200 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Raphidocelis subcapitata | NORCCA | NIVA-CHL1 strain | |
| Scintillation vials (20 mL) | Fisherscientific | 11526325 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 415413 | |
| Sodium molybdate dihydrate | Sigma-Aldrich | 331058 | |
| Spring clamp | Frederiksen Scientific A/S | 472002 | |
| Thermostatic cabinet | VWR | WTWA208450 | Alternative: temperature controlled room |
| Ventilation pipe (Ø125 mm) | Silvan | 22605630165 | |
| Volumetric flasks (25 mL) | DWK Life Sciences | 246781455 | |
| Zinc chloride | Sigma-Aldrich | 208086 |
References
- European Chemicals Agency. Guidance on Registration. European Chemicals Agency. , Helsinki, Finland. (2016).
- Organisation for Economic Cooperation and Development. Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. Organisation for Economic Cooperation and Development. , (2019).
- Blaise, C., Legault, R., Bermingham, N., Van Coillie, R., Vasseur, P. A simple microplate algal assay technique for aquatic toxicity assessment. Toxicity Assessment. 1 (3), 261-281 (1986).
- Hjorth, R., Sorensen, S. N., Olsson, M. E., Baun, A., Hartmann, N. B. A certain shade of green: can algal pigments reveal shading effects of nanoparticles. Integrated Environmental Assessment and Management. 12 (1), 200-202 (2016).
- Chen, F., et al. Algae response to engineered nanoparticles: current understanding{,} mechanisms and implications. Environmental Science: Nano. 6 (4), 1026-1042 (2019).
- Arensberg, P., Hemmingsen, V. H., Nyholm, N. A miniscale algal toxicity test. Chemosphere. 30 (11), 2103-2115 (1995).
- Organisation for Economic Cooperation and Development. Test No. 201: Freshwater Alga and Cyanobacteria, Growth Inhibition Test. Organisation for Economic Cooperation and Development. , (2011).
- International Organization for Standardization (ISO). Water Quality - Fresh Water Algal Growth Inhibition Test with Unicellular Green Algae. International Organization for Standardization (ISO). , (2012).
- Halling-Sørensen, B., Nyhohn, N., Baun, A. Algal toxicity tests with volatile and hazardous compounds in air-tight test flasks with CO2 enriched headspace. Chemosphere. 32 (8), 1513-1526 (1996).
- Mayer, P., Nyholm, N., Verbruggen, E. M. J., Hermens, J. L. M., Tolls, J. Algal growth inhibition test in filled, closed bottles for volatile and sorptive materials. Environmental Toxicology and Chemistry. 19 (10), 2551-2556 (2000).
- Ritz, C., Baty, F., Streibig, J. C., Gerhard, D. Dose-response analysis using R. PloS One. 10 (12), 0146021 (2015).
- Birch, H., Kramer, N. I., Mayer, P. Time-resolved freely dissolved concentrations of semivolatile and hydrophobic test chemicals in in vitro assays-measuring high losses and crossover by headspace solid-phase microextraction. Chemical Research in Toxicology. 32 (9), 1780-1790 (2019).
- Trac, L. N., Schmidt, S. N., Mayer, P. Headspace passive dosing of volatile hydrophobic chemicals - toxicity testing exactly at the saturation level. Chemosphere. 211, 694-700 (2018).
- Eisentraeger, A., Dott, W., Klein, J., Hahn, S. Comparative studies on algal toxicity testing using fluorometric microplate and Erlenmeyer flask growth-inhibition assays. Ecotoxicology and Environmental Safety. 54 (3), 346-354 (2003).
- Paixao, S. M., Silva, L., Fernandes, A., O'Rourke, K., Mendonca, E., Picado, A. Performance of a miniaturized algal bioassay in phytotoxicity screening. Ecotoxicology. 17 (3), 165-171 (2008).
- Thellen, C., Blaise, C., Roy, Y., Hickey, C. Round-robin testing with the selenastrum--capricornutum microplate toxicity assay. Hydrobiologia. 188, 259-268 (1989).
- Nagai, T., Taya, K., Annoh, H., Ishihara, S. Application of a fluorometric microplate algal toxicity assay for riverine periphytic algal species. Ecotoxicology and Environmental Safety. 94, 37-44 (2013).
- Lee, W. M., An, Y. J. Effects of zinc oxide and titanium dioxide nanoparticles on green algae under visible, UVA, and UVB irradiations: no evidence of enhanced algal toxicity under UV pre-irradiation. Chemosphere. 91 (4), 536-544 (2013).
- Samei, M., Sarrafzadeh, M. H., Faramarzi, M. A. The impact of morphology and size of zinc oxide nanoparticles on its toxicity to the freshwater microalga, Raphidocelis subcapitata. Environmental Science and Pollution Research. 26 (3), 2409-2420 (2019).
- Neale, P. A., Jaemting, A. K., O'Malley, E., Herrmann, J., Escher, B. I. Behaviour of titanium dioxide and zinc oxide nanoparticles in the presence of wastewater-derived organic matter and implications for algal toxicity. Environmental Science: Nano. 2 (1), 86-93 (2015).
- Hartmann, N. B., et al. The challenges of testing metal and metal oxide nanoparticles in algal bioassays: titanium dioxide and gold nanoparticles as case studies. Nanotoxicology. 7 (6), 1082-1094 (2013).
- Farkas, J., Booth, A. M. Are fluorescence-based chlorophyll quantification methods suitable for algae toxicity assessment of carbon nanomaterials. Nanotoxicology. 11 (4), 569-577 (2017).
- Handy, R. D., et al. Practical considerations for conducting ecotoxicity test methods with manufactured nanomaterials: what have we learnt so far. Ecotoxicology. 21 (4), 933-972 (2012).
- Handy, R. D., et al. Ecotoxicity test methods for engineered nanomaterials: practical experiences and recommendations from the bench. Environmental Toxicology and Chemistry. 31 (1), 15-31 (2012).
