Summary
Demonstramos testes de toxicidade de algas para substâncias difíceis (por exemplo, substâncias coloridas ou nanomateriais) usando uma configuração iluminada verticalmente com um LED.
Abstract
Os dados de ecotoxicidade são um requisito para o registro pré e pós-mercado de produtos químicos por regulamentos europeus e internacionais (por exemplo, REACH). O teste de toxicidade de algas é frequentemente utilizado na avaliação de risco regulatório de produtos químicos. Para alcançar alta confiabilidade e reprodutibilidade, o desenvolvimento de diretrizes padronizadas é vital. Para testes de toxicidade alga, as diretrizes requerem condições estáveis e uniformes de parâmetros como pH, temperatura, níveis de dióxido de carbono e intensidade de luz. Nanomateriais e outras substâncias chamadas difíceis podem interferir com a luz causando uma grande variação nos resultados obtidos dificultando sua aceitação regulatória. Para enfrentar esses desafios, desenvolvemos o LEVITATT (LED Vertical Illumination Table for Algal Toxicity Tests). A configuração utiliza a iluminação LED de baixo permitindo uma distribuição de luz homogênea e controle de temperatura, minimizando também o sombreamento intra-amostra. A configuração otimiza o volume amostral para quantificação de biomassa e, ao mesmo tempo, garante um influxo suficiente de CO2 para suportar o crescimento exponencial das algas. Além disso, o material dos recipientes de teste pode ser adaptado para minimizar a adsorção e a volatilização. Ao testar substâncias coloridas ou suspensões de partículas, o uso de luzes LED também permite aumentar a intensidade da luz sem geração adicional de calor. O design compacto e os requisitos mínimos de equipamentos aumentam as possibilidades de implementação do LEVITATT em uma ampla gama de laboratórios. Embora em conformidade com as diretrizes padronizadas do ISO e da OCDE para testes de toxicidade alga, a LEVITATT também mostrou uma menor variabilidade inter-amostra para duas substâncias de referência (3,5-Dicholorofenol e K2Cr2O7) e três nanomateriais (ZnO, CeO2e BaSO4) em comparação com frascos erlen e placas de microtídeos.
Introduction
O teste de toxicidade de algas é um dos três únicos testes obrigatórios utilizados para gerar os dados de ecotoxicidade necessários para o registro pré e pós-mercado de produtos químicos por regulamentos europeus e internacionais (por exemplo, REACH1 e TSCA (EUA)." Para isso, foram desenvolvidas diretrizes padronizadas de testes de algas por organismos internacionais (por exemplo, ISO e OCDE). Estes padrões e diretrizes de teste prescrevem condições ideais de teste em termos de pH, temperatura, níveis de dióxido de carbono e intensidade de luz. No entanto, manter condições estáveis de teste durante os testes de algas é na prática difícil e os resultados sofrem de problemas com reprodutibilidade e confiabilidade para uma gama de substâncias químicas e nanomateriais (muitas vezes chamados de "substâncias difíceis")2. A maioria das configurações de teste de toxicidade de algas existentes operam com volumes relativamente grandes (100-250 mL) situados em um agitador orbital dentro de uma incubadora. Tal configuração limita o número de concentrações de teste e replica volumes alcançáveis e altos de cultura alga e material de teste. Além disso, essas configurações raramente têm um campo de luz uniforme e condições de iluminação confiáveis são ainda mais difíceis de obter em frascos grandes, em parte à medida que a intensidade da luz diminui exponencialmente quanto mais a luz viaja e em parte devido à geometria do frasco. As configurações alternativas compreendem microtiter plástico3 placas contendo pequenos volumes de amostra que não permitem volumes de amostragem adequados para medir pH, medições adicionais de biomassa, extração de pigmento ou outras análises que requerem amostragem destrutiva. Um desafio particular usando as configurações existentes para testes de toxicidade de algas de nanomateriais e substâncias que formam suspensões coloridas é a interferência ou bloqueio da luz disponível para as células algas, muitas vezes referidas como "sombreamento"4,,5. O sombreamento pode ocorrer dentro de frascos pelo material de teste e/ou interações entre o material de teste e as células algas, ou sombreamento pode ocorrer entre frascos, devido ao seu posicionamento em relação uns aos outros e à fonte de luz.
O método baseia-se na configuração do teste de toxicidade de algas em pequena escala introduzida por Arensberg et al.6 que permite testar em conformidade com normas como a OCDE 2017e ISO 86928. O método é ainda otimizado para atender às limitações acima indicadas por: 1) utilizando a tecnologia de luz LED para garantir condições uniformes de luz com geração mínima de calor, 2) fornecendo volume amostral adequado para análise química/biológica, mantendo pH constante, níveis de CO2 e 3) permitindo o uso de material de recipiente de teste versátil para testes de substâncias voláteis ou substâncias com alto potencial de sorção.
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Protocol
1. Descrição da configuração LEVITATT
- Use frascos de vidro cintilante de 20 mL(Figura 1, insira 1) permitindo penetração de luz. Alternativamente, podem ser usados frascos de plástico penetráveis leves. Quantifique a intensidade da luz usando um fotômetro.
- Use pelo menos uma suspensão de teste de 4 mL no início do teste para permitir a quantificação da biomassa e para caracterização/quantificação de nanomateriais durante e após a incubação(Figura 1, inserir 2).
- Encaixe os frascos de cintilação de 20 mL com uma tampa(Figura 1, insira 3) onde um pequeno orifício é perfurado (aproximadamente 1 mm de diâmetro) para permitir a troca de CO2 com a atmosfera. Esta troca é crucial para garantir níveis estáveis de pH e CO2 durante os testes.
- Para substâncias voláteis, use uma tampa revestida de Teflon a ar para permitir o enriquecimento de CO2 do espaço para a cabeça usando uma seringa9 ou frascos completamente fechados sem fase de gás em que o CO2 é mantido em solução por um sistema tampão de sódio enriquecido (NaHCO3)sistema tampão 10.
- Aperte os frascos com grampos montados na carcaça externa(Figura 1, insira 4).
- Use uma fonte de luz LED localizada abaixo dos frascos de teste(Figura 1, insira 5) fornecendo uma iluminação fluorescente uniforme do tipo "branco-frio" ou "luz do dia" e uma intensidade de luz na faixa de 60-120 μE∙m-2∙s-1 medida na faixa de comprimento de onda fotointtheticamente eficaz de 400 nm a 700 nm. A configuração emprega intensidade de luz ajustável na faixa de 5-160 μE∙m-2∙s-1, encaixando um dimmer leve na fonte. Isso permite testar em intensidades de luz mais altas e mais baixas.
- Monte a configuração em um agitador orbital para agitar amostras durante toda a duração do teste. Isso mantém as células em suspensão livre e facilita a transferência de massa de CO2 do ar para a água (Figura 1, insira 6).
- Coloque a configuração em uma sala controlada pela temperatura ou em um armário termostático para manter temperaturas estáveis durante os testes (Figura 1, insira 7).
Figura 1: Imagem da tabela de iluminação vertical led para testes de toxicidade de algas (LEVITATT). 1) Frascos de cintilação de vidro de 20 mL para incubação, 2) amostra de 4 mL para análise, 3) tampa com orifício perfurado para troca de CO2, 4) invólucro para condições de luz definidas, 5) fonte de luz LED localizada no centro do invólucro, 6) shaker orbital para agitação durante o experimento e 7) um armário termostático. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
2. Preparação do meio de crescimento de algas
- O meio de crescimento de algas ISO 8692 consiste em quatro soluções de estoque diferentes. Pesar a quantidade apropriada de sais e diluir em água ultrauso de acordo com a Tabela 1.
| Soluções de estoque | Nutrientes | Concentração na solução de estoque | Concentração na solução de teste |
| 1: Macronutrientes | NH4Cl | 1,5 g/L | 15 mg/L (N: 3,9 mg/L) |
| MgCl2∙6H2O | 1,2 g/L | 12 mg/L (Mg: 2,9 mg/L) | |
| CaCl2∙2H2O | 1,8 g/L | 18 mg/L (Ca: 4,9 mg/L) | |
| MgSO4∙7H2O | 1,5 g/L | 15 mg/L (S: 1,95 mg/L) | |
| KH2PO4 | 0,16 g/L | 1,6 mg/L (P: 0,36 mg/L) | |
| 2: Fe-EDTA | FeCl3∙6H2O | 64 mg/L | 64 μg/L (Fe: 13 μg/L) |
| Na2EDTA∙2H2O | 100 mg/L | 100 μg/L | |
| 3: Traços | H3BO3a | 185 mg/L | 185 μg/L (B: 32 μg/L) |
| MnCl2∙4H2O | 415 mg/L | 415 μg/L (Mn: 115 μg/L) | |
| ZnCl2 | 3 mg/L | 3 μg/L (Zn: 1,4 μg/L) | |
| CoCl2∙6H2O | 1,5 mg/L | 1,5 μg/L (Co: 0,37 μg/L) | |
| CuCl2∙2H2O | 0,01 mg/L | 0,01 μg/L (Cu: 3,7 ng/L) | |
| Na2MoO4∙2H2O | 7 mg/L | 7 μg/L (Mo: 2,8 μg/L) | |
| 4: NaHCO3 | NaHCO3 | 50 g/L | 50 mg/L (C: 7,14 mg/L) |
Tabela 1: Concentrações de nutrientes em soluções de estoque para meio de crescimento de algas
NOTA: H3BO3 pode ser dissolvido adicionando 0,1 M NaOH. O EDTA deve ser removido ao testar metais, para evitar a complexação com íons metálicos. Esterilizar as soluções de estoque por filtração de membrana (diâmetro médio de poros 0,2 μm) ou por autoclaving (120 °C, 15 min). Não faça soluções de estoque autoclave 2 e 4, mas esterilize-as por filtragem de membrana. Armazene as soluções no escuro a 4 °C.
- Para produzir 1 L de meio de crescimento algal, transfira 500 mL de água ultrapura esterilizada em um frasco volutrico esterilizado de 1 L e adicione 10 mL de solução de estoque 1: Macronutrientes, 1 mL de solução de estoque 2: Fe-EDTA, 1 mL de solução de estoque 3: Elementos de rastreamento, e 1 mL de solução de estoque 4: NaHCO3.
- Encha até 1 L com água ultrauso esterilizada, roa o frasco e agite bem para homogeneizar o meio de crescimento de algas.
- Equilibre a solução antes de usá-la deixando-a durante a noite em contato com o ar ou borbulhando com ar estéril e filtrado por 30 minutos. Após o equilíbrio, ajuste o pH, se necessário, para pH 8,1 ± 0,2, com 1 M HCl ou 1 M NaOH.
3. Configuração do teste de algas
NOTA: Um diagrama de fluxo do procedimento de teste de algas é mostrado na Figura 2.
Figura 2: Diagrama de fluxo da configuração do teste de algas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Prepare uma solução de estoque do composto de ensaio na maior concentração de teste desejada no meio de crescimento de algas preparada de acordo com a etapa 2. Para a preparação de soluções/suspensões de estoque, siga a OCDE 201 (para compostos solúveis) ou a OCDE 318 (para nanomateriais).
- Meça o pH na solução de estoque. Se ele desviar mais de uma unidade do meio de crescimento de algas, ajuste o pH para 8 com 1 M HCl ou 1 M NaOH.
- Calcule o volume de inóculo necessário para atingir uma concentração celular final de 1 x 104 células/mL em uma solução de teste de 25 mL.
NOTA: O inóculo deve vir de uma cultura de subcapitata Raphidocelis de crescimento exponencial não contaminado cultivada usando a configuração LEVITATT. - Calcule a quantidade de solução de estoque para adicionar a cada frasco volumoso de 25 mL para obter as concentrações desejadas do teste. O fator entre cada concentração não deve exceder 3,2.
- Marque um frasco volumoso de 25 mL para cada concentração escolhida e um controle de frasco volumoso adicional de 25 mL.
- Adicione a quantidade de solução de estoque do composto de teste necessária para alcançar as concentrações desejadas ao frasco volumoso de 25 mL. Não adicione a solução de estoque ao controle.
- Adicione o frasco volumoso médio de 25 mL para atingir um volume de aproximadamente 20 mL.
- Adicione o volume de inóculo calculado na etapa 3.3 a cada frasco volumoso de 25 mL. Adicione o frasco volumoso médio a cada 25 mL de volumer para um volume total final de 25 mL.
- Roa os frascos e misture bem girando os frascos duas vezes verticalmente.
- Transfira 0,4 mL de cada frasco em frascos individuais de tampa de parafuso e adicione 1,6 mL de acetona (saturado com MgCO3): uma amostra para cada concentração de teste e o controle. Feche bem as tampas e armazene no escuro à temperatura ambiente até medições de fluorescência (seção 4).
- Pipet 4 mL de cada solução de teste em frascos de cintilação de 20 mL (3 réplicas por concentração e 5 réplicas para o controle). Enrosque as tampas dos frascos de cintilação. Lembre-se que as tampas devem ter um orifício perfurado (aproximadamente 1 mm de diâmetro) para permitir a troca de CO2.
- Após 24h, 48h e 72h, pipet 0,4 mL de cada frasco em frascos de tampa de parafuso e adicionar 1,6 mL de acetona (saturado com MgCO3). Feche bem as tampas e armazene no escuro à temperatura ambiente até medições de fluorescência (seção 4).
- Após a última amostra ser colhida a 72 h, acumule suavemente as três réplicas para uma dada concentração em um frasco e meça o pH. Repita para todas as concentrações e o controle. O pH não deve desviar mais de 1,5 unidades do pH inicial para qualquer uma das amostras medidas.
- Descarrete os líquidos restantes em um recipiente de resíduos seguindo suas regras e regulamentos institucionais.
4. Analisando amostras de teste de algas
- Use um espectrofotômetro de fluorescência para medir a biomassa alga (aqui expressa como clorofila A). O pico de emissão de clorofila A é de 420 nm para o comprimento de onda de excitação e 671 nm para o comprimento de onda de emissão.
- Meça a fluorescência de cada amostra individual três vezes e calcule o valor médio de cada amostra.
- Use a equação 1 para calcular a taxa de crescimento. A fluorescência medida (unidades relativas) pode ser usada diretamente como parâmetro de biomassa na equação 1.
Equação 1: μ = (ln Nt – ln N0) / t
onde μ é a taxa de crescimento (d-1), N0 é a biomassa inicial, Nt é a biomassa no momento t, e t é a duração do período de teste (d). Nota, N0 e Nt devem ser expressos na mesma unidade. - Use um software estatístico para encaixar uma curva de regressão não linear (por exemplo, uma função log-logistic ou Weibull) aos dados da taxa de crescimento para obter valores efetivos de concentração em 10%, 20% e 50% de inibição. Nas informações complementares é dado um exemplo de código para a montagem no software estatístico R utilizando o pacote RDC11.
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Representative Results
Um teste inicial com uma substância de referência é realizado para determinar a sensibilidade da cepa de algas. As substâncias de referência regularmente utilizadas para R. subcapitata são dicromato de potássio e 3,5-Diclorfenol7,8. A Figura 3 e a Tabela 2 mostram um resultado representativo de um teste de algas, incluindo encaixe de curva e saídas estatísticas quando o pacote RDC em R é aplicado às taxas de crescimento.
Figura 3: Curva representativa de concentração-resposta para exposição de 72 h de um composto químico a algas(R. subcapitata). A linha sólida representa o ajuste log-logístico e a área sombreada é o intervalo de confiança de 95% para o ajuste. Os círculos abertos representam a taxa de crescimento calculada para cada réplica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| EC10 | EC20 | EC50 | |
| [mg/L] | [mg/L] | [mg/L] | |
| Composto químico | 4.6 [1.8-7.5] | 7.4 [4.1-11] | 16.9 [11-22] |
Tabela 2: Concentrações efetivas representativas para 10%, 20% e 50% de inibição da taxa de crescimento de um composto químico utilizando algas (R. subcapitata). O valor entre parênteses representa o intervalo de confiança de 95% de um encaixe log-logístico.
Um teste bem-sucedido terá taxas de crescimento acima de 0,9 d-1 para cumprir a diretriz da OCDE e 1,5 d-1 para cumprir a diretriz iso 8692 e deve conter pelo menos uma concentração entre 0% e 100% de inibição. Baixas taxas de crescimento podem ocorrer como resultado de vários problemas, como contaminação bacteriana ou inóculo não estar em fase de crescimento exponencial no início do teste. A investigação microscópica das réplicas só deve apresentar algas verdes uniformes em forma de foice(R. subcapitata)com dimensões de aproximadamente 2 μm de largura e 8 μm de comprimento. Se uma única réplica estiver contaminada, ela pode ser omitida e a análise pode ser realizada sem esses dados. No entanto, se várias réplicas estiverem contaminadas, repita o experimento com inóculo exponencialmente crescente não contaminado. Para avaliar se o inóculo estava em fase de crescimento exponencial no início do teste, calcular a taxa de crescimento do controle se replica em intervalos de 24h e utilizar apenas o intervalo de tempo em que o crescimento alángico do controle é exponencial para análise estatística.
Para testar a robustez da configuração, um teste de toxicidade usando duas substâncias de referência (K2Cr2O7 e 3,5-Diclorofenol) e três nanomateriais foi repetido três vezes (3,5-Diclorofenol, Nanopartículas BaSO4 (NM-220) e nanopartículas ZnO (NM-111)) e quatro vezes (K2Cr2O7 e CeO2 nanopartículas (NM-212)). Os resultados mostraram um coeficiente de variação da EC50-valores entre 11% e 39%, com o menor coeficiente de variação observado para nanopartículas ZnO (NM-111) e o maior coeficiente de variação para nanopartículas CEO2 (NM-212)(Tabela 3).
| Composto | # de experimentos | Coeficiente inter amostral de variação para taxa de crescimento % |
EC50 (média) mg/L |
Coeficiente de variação para valores EC50 % |
| K2Cr2O7 | 4 | 4.5 | 0.73 | 13 |
| 3,5-Diclorofenol | 3 | 3.4 | 1.9 | 21 |
| Baso4 NP (NM-220) | 3 | 5.6 | 22 | 20 |
| Ceo2 NP (NM-212) | 4 | 4.3 | 13 | 39 |
| ZnO NP (NM-111) | 3 | 3.4 | 0.13 | 11 |
Tabela 3: Resultados de um teste interno de toxicidade laboratorial com R. subcapitata exposto por 72 h a duas substâncias de referência e três nanomateriais do repositório JRC
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Discussion
O fitoplâncton converte energia solar e dióxido de carbono em matéria orgânica e, portanto, tem um papel fundamental no ecossistema aquático. Por essa razão, os testes de inibição da taxa de crescimento de algas são incluídos como um dos três testes de toxicidade aquática obrigatórios necessários para a avaliação de risco regulatório de produtos químicos. A capacidade de realizar um teste de toxicidade algas confiável e reprodutível é fundamental nesse sentido. As configurações de teste usando frascos de Erlenmeyer introduzem uma série de variabilidades e inconvenientes, conforme descrito na introdução. Para contornar essa questão, foram propostas placas de microtiter3. Embora as placas de microtítidas minimizem o volume e o espaço necessários para os testes, foram levantadas preocupações na literatura no que diz respeito ao cumprimento dessas configurações com os critérios de validade do teste das diretrizes de teste6. Por exemplo, a perda significativa de produtos químicos semivolatile, bem como cross-over para outros poços em placas de microtétulas a 37 °C em mídia de crescimento celular (DMEM GluteMAX, Opti-MEM e Hams F12 GlutaMAX) foi recentemente demonstrada por Birch et al.12. Os testes de substâncias voláteis podem ser realizados com sucesso com a configuração LEVITATT usando 1) frascos fechados com espaço para cabeça enriquecido de CO2 9, 2) dosando diretamente o composto volátil através do headspace13 ou em um frasco de teste preenchido10. Em termos de requisitos de espaço, o LEVITATT fornece uma configuração de teste que preenche a lacuna entre placas de microtáticos e configurações de frascos Erlenmeyer, enquanto ainda fornece benefícios de ambas as configurações, por exemplo, mantendo um ambiente de teste conciso e compacto e volume de teste suficiente para amostragem destrutiva (por exemplo, para caracterização de nanomateriais durante o teste).
A variabilidade inter-amostra para o sistema de teste LEVITATT variou de 3,4% (3,5-Dichlorophenol e ZnO NP) a 5,6% (BaSO4 NP). Isso está dentro da exigência de coeficiente de variação do crescimento médio nas culturas de controle de réplica de 15% indicadas pela diretriz da OCDE 2017 (para a variabilidade inter-amostra LEVITATT todas as exposições também foram incluídas).
A reprodutibilidade em relação aos valores EC50-valores da configuração do teste para as substâncias de referência mostrou um coeficiente de variância de 13% para K2Cr2O7 (n = 4) e 21% para 3,5-Diclorofenol (n = 3). Isso é comparável aos testes realizados com bioensações convencionais de frasco de Erlenmeyer de 250 mL para a substância de referência K2Cr2O7 mostrando 16,8%14 e 25,4%15 coeficientes de variação para valores ce50. As placas de microtítmetro têm mostrado menor coeficiente de variação para algumas substâncias de referência (por exemplo, K2Cr2O7 (9%14,15), enquanto coeficientes mais elevados de variação foram observados para fenol (34,9%16)e Dichlorophenol (38%17). Informações limitadas estão disponíveis no que diz respeito à reprodutibilidade de estudos com nanomateriais. No entanto, comparando o coeficiente inter-amostra de variação para NPs ZnO utilizando o sistema LEVITATT (3,4%) com placas de microtítmetro (67%18) ou frascos de Erlenmeyer (13%19 e 35%20) tem menos variação. Para testar ainda mais a robustez do sistema LEVITATT, foi iniciado um estudo de dois materiais de teste (uma substância de referência e uma substância difícil de testar).
Manter uma cultura alga não contaminada pode ser difícil se não manuseado em condições estéreis. O crescimento exponencial de algas é um pré-requisito fundamental para a realização de testes de algas diretrizes. Medir o crescimento em vários pontos de tempo (por exemplo, 24h, 48h, 72 h) pode identificar se o crescimento exponencial está ocorrendo durante o período de teste. Flutuações na temperatura e pH podem influenciar o crescimento das algas; assim, esses parâmetros devem ser estáveis durante todo o período de teste. Em pequenos volumes de amostra de teste, flutuações na temperatura e pH ocorrem mais rapidamente em comparação com volumes maiores e as questões práticas de medição desses parâmetros são cada vez mais difíceis com a diminuição do volume de teste. Parâmetros como pH e temperatura usando volume de teste de 4 mL foram estáveis durante um período de teste de 72 h no LEVITATT, tanto em uma sala controlada pela temperatura a 20 °C ± 2 °C e em uma incubadora em condições semelhantes.
Métodos analíticos para quantificação do crescimento de algas são muitos: contagem de células em um hemoocítômetro, contador de coulter ou fluorescência de extratos de pigmento. Para substâncias difíceis, devem ser feitas considerações em relação ao método mais adequado para quantificação da biomassa. Para nanopartículas de óxido de metal, a fluorescência dos extratos de pigmento tem tido melhor desempenho devido à interferência de aglomerados ao contar algas por hemoocítômetro ou contador de coulter21. Em contraste, Farkas e Booth22 descobriram que a quantificação da biomassa por fluorescência não era um método adequado para testes de ecotoxicidade de nanomateriais à base de carbono devido à autofluorescência e absorção de pigmentos aos nanomateriais. Para substâncias coloridas, também pode haver interferência da cor com o sinal de emissão de fluorescência, exigindo controles adicionais ou diluição a um nível onde essa interferência é insignificante.
No documento de orientação para testes de toxicidade aquática de substâncias difíceis2, uma das recomendações para testar materiais coloridos é aumentar a intensidade da luz. Da mesma forma, o aumento da intensidade da luz foi mencionado para contornar problemas de sombreamento ao testar nanomateriais23,24. No entanto, tais modificações são frequentemente associadas ao aumento das temperaturas, exigindo assim resfriamento adicional ou ventilação das amostras. Na configuração LEVITATT, isso é resolvido usando luz LED que produz pouco calor em comparação com lâmpadas convencionais ou tubos fluorescentes. Além disso, a escolha de um LED com uma saída de intensidade de luz suficientemente alta e a instalação de um dimmer permitem aumentar a intensidade da luz para testar substâncias coloridas ou nanomateriais e produtos químicos regulares sem alterar a configuração geral entre os testes. Além disso, a colocação da fonte de luz abaixo das amostras e em invólucros separados permite um campo de luz consistente e homogêneo.
Em conclusão, o LEVITATT fornece uma plataforma compacta para testes de toxicidade alga de produtos químicos regulares em conformidade com as diretrizes padronizadas internacionais. Além disso, a configuração fornece uma plataforma robusta para testes de substâncias difíceis que interferem com a passagem de luz em direção à alga, por exemplo, nanomateriais.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi financiada pela PATROLS – Advanced Tools for NanoSafety Testing, Grant agreement 760813 sob o programa de pesquisa e inovação Horizon 2020.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Sigma-Aldrich | V179124 | |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | 254134 | |
| BlueCap bottles (1L) | Buch & Holm A/S | 9072335 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B0394 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | 208290 | |
| Clear acrylic sheet (40x40 cm) | |||
| Cobalt(II) chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 255599 | |
| Copper(II) chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | 307483 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Fluorescence Spectrophotometer F-7000 | Hitachi | ||
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| Iron(III) chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 236489 | |
| LED light source | Helmholt Elektronik A/S | H35161 | Neutral White, 6500K |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Manganese(II) chloride tetrahydrate | Sigma-Aldrich | 221279 | |
| Orbital shaker | IKA | 2980200 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Raphidocelis subcapitata | NORCCA | NIVA-CHL1 strain | |
| Scintillation vials (20 mL) | Fisherscientific | 11526325 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 415413 | |
| Sodium molybdate dihydrate | Sigma-Aldrich | 331058 | |
| Spring clamp | Frederiksen Scientific A/S | 472002 | |
| Thermostatic cabinet | VWR | WTWA208450 | Alternative: temperature controlled room |
| Ventilation pipe (Ø125 mm) | Silvan | 22605630165 | |
| Volumetric flasks (25 mL) | DWK Life Sciences | 246781455 | |
| Zinc chloride | Sigma-Aldrich | 208086 |
References
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