Summary
Nous démontrons des tests de toxicité des algues pour des substances difficiles (p. ex., substances colorées ou nanomatériaux) à l’aide d’une configuration éclairée verticalement par une LED.
Abstract
Les données sur l’écotoxicité sont une exigence pour l’enregistrement avant et après la mise sur le marché des produits chimiques par les réglementations européennes et internationales (p. ex., REACH). Le test de toxicité des algues est fréquemment utilisé dans l’évaluation des risques réglementaires des produits chimiques. Afin d’atteindre une fiabilité et une reproductibilité élevées, l’élaboration de lignes directrices normalisées est essentielle. Pour les essais de toxicité des algues, les lignes directrices exigent des conditions stables et uniformes de paramètres tels que le pH, la température, les niveaux de dioxyde de carbone et l’intensité lumineuse. Les nanomatériaux et autres substances dites difficiles peuvent interférer avec la lumière, ce qui entraîne une grande variation des résultats obtenus qui entravent leur acceptation réglementaire. Pour relever ces défis, nous avons développé LEVITATT (LED Vertical Illumination Table for Algal Toxicity Tests). La configuration utilise l’éclairage LED d’en bas permettant une distribution homogène de la lumière et le contrôle de la température tout en minimisant l’ombrage intra-échantillon. La configuration optimise le volume de l’échantillon pour la quantification de la biomasse et assure en même temps un afflux suffisant de CO2 pour soutenir la croissance exponentielle des algues. En outre, le matériel des conteneurs d’essai peut être adapté pour minimiser l’adsorption et la volatilisation. Lors de l’essai de substances colorées ou de suspensions de particules, l’utilisation de lumières LED permet également d’augmenter l’intensité lumineuse sans production de chaleur supplémentaire. La conception compacte et les exigences minimales en matière d’équipement augmentent les possibilités de mise en œuvre du LEVITATT dans un large éventail de laboratoires. Bien qu’il soit conforme aux lignes directrices normalisées de l’ISO et de l’OCDE pour les tests de toxicité des algues, LEVITATT a également montré une variabilité interinstompale plus faible pour deux substances de référence (3,5-Dicholorophénol et K2Cr2O7) et trois nanomatériaux (ZnO, CeO2et BaSO4)par rapport aux flacons et plaques de microtiter Erlenmeyer.
Introduction
Le test de toxicité des algues est l’un des trois seuls tests obligatoires utilisés pour générer les données d’écotoxicité requises pour l’enregistrement des produits chimiques avant et après la mise sur le marché par les réglementations européennes et internationales (p. ex., REACH1 et TSCA (États-Unis)). À cette fin, des organisations internationales ont élaboré des lignes directrices normalisées sur les tests d’algues (p. ex., l’ISO et l’OCDE). Ces normes et lignes directrices prescrivent des conditions d’essai idéales en termes de pH, de température, de dioxyde de carbone et d’intensité lumineuse. Toutefois, le maintien de conditions d’essai stables pendant les essais d’algues est en pratique difficile et les résultats souffrent de problèmes de reproductibilité et de fiabilité pour une gamme de substances chimiques et de nanomatériaux (souvent appelés « ubstances difficile »)2. La plupart des installations existantes d’essais de toxicité des algues fonctionnent avec des volumes relativement importants (100–250 mL) situés sur un shaker orbital à l’intérieur d’un incubateur. Une telle configuration limite le nombre de concentrations d’essai et reproduit des volumes réalisables et élevés de culture d’algues et de matériel d’essai. En outre, ces configurations ont rarement un champ de lumière uniforme et des conditions d’éclairage fiables sont en outre difficiles à obtenir dans les grandes fioles, en partie parce que l’intensité lumineuse diminue exponentiellement plus la lumière se déplace et en partie en raison de la géométrie de la fiole. Les configurations alternatives comprennent des plaques de microtiter en plastique3 contenant de petits volumes d’échantillons qui ne permettent pas des volumes d’échantillonnage adéquats pour mesurer le pH, des mesures supplémentaires de la biomasse, l’extraction de pigments ou d’autres analyses nécessitant un échantillonnage destructeur. Un défi particulier utilisant les configurations existantes pour l’essai de toxicité des algues des nanomatériaux et des substances formant des suspensions colorées est l’interférence ou le blocage de la lumière disponible pour les cellules d’algues, souvent appelée « ombrage »4,5. L’ombrage peut se produire dans les flacons par le matériel d’essai et/ou les interactions entre le matériau d’essai et les cellules algales, ou l’ombrage peut se produire entre les flacons, en raison de leur positionnement les uns par rapport aux autres et de la source lumineuse.
La méthode est basée sur la configuration des essais de toxicité des algues à petite échelle introduit par Arensberg et al.6 qui permet de tester en conformité avec des normes telles que l’OCDE 2017, et ISO 86928. La méthode est en outre optimisée pour répondre aux limites indiquées ci-dessus par : 1) en utilisant la technologie de lumière DEL pour assurer des conditions lumineuses uniformes avec une production minimale de chaleur, 2) fournissant un volume d’échantillon adéquat pour l’analyse chimique/biologique tout en maintenant le pH constant, les niveaux de CO2, et 3) permettant l’utilisation de matériel polyvalent de récipient d’essai pour l’essai des substances volatiles ou des substances avec un potentiel de sorption élevé.
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Protocol
1. Description de la configuration de LEVITATT
- Utiliser des flacons en verre de scintillation de 20 mL(figure 1, insert 1) permettant la pénétration de la lumière. Alternativement, des flacons en plastique à pénétration légère peuvent être utilisés. Quantifier l’intensité lumineuse à l’aide d’un photomètre.
- Utiliser au moins une suspension d’essai de 4 mL au début de l’essai pour permettre la quantification de la biomasse et pour la caractérisation/quantification des nanomatériaux pendant et après l’incubation (figure 1, insertion 2).
- Adapter les flacons de scintillation de 20 mL à l’aided’un bouchon (figure 1, insert 3) où un petit trou est foré (environ 1 mm de diamètre) pour permettre l’échange de CO2 avec l’atmosphère. Cet échange est crucial pour assurer des niveaux stables de pH et de CO2 pendant les essais.
- Pour les substances volatiles, utilisez un bouchon recouvert de téflon étanche à l’air pour permettre l’enrichissement du CO2 de l’espace de tête à l’aide d’une seringue9 ou de flacons complètement fermés sans phase de gaz dans lequel le CO2 est maintenu en solution par un système tampon de bicarbonate de sodium enrichi (NaHCO3)10.
- Attachez les flacons avec des pinces montées sur le boîtier extérieur (figure 1, insert 4).
- Utiliser une source lumineuse LED située sous les flacons d’essai(figure 1, insert 5) fournissant un éclairage fluorescent uniforme de type « blanc froid » ou « lumière du jour » et une intensité lumineuse de la plage de 60 à 120 μE-m-2•s-1 mesurée dans la plage de longueur d’onde photosynthétiquement efficace de 400 nm à 700 nm. La configuration utilise une intensité lumineuse réglable dans la gamme 5–160 μE•m-2•s-1 en ajustant un gradateur de lumière à la source. Cela permet de tester à des intensités de lumière de plus en plus faibles.
- Montez la configuration sur un shaker orbital pour agiter des échantillons pendant toute la durée de l’essai. Cela maintient les cellules en suspension libre et facilite le transfert de masse de CO2 de l’air à l’eau (Figure 1, insert 6).
- Placez l’installation dans une pièce à température contrôlée ou une armoire thermostatique pour maintenir des températures stables tout au long des essais (figure 1, insérer 7).
Figure 1 : Image de la table d’éclairage vertical LED pour les essais de toxicité des algues (LEVITATT). 1) 20 flacons de scintillation de verre de mL pour l’incubation, 2) échantillon de 4 mL pour l’analyse, 3) couvercle avec trou percé pour l’échange de CO2, 4) boîtier pour des conditions de lumière définies, 5) source lumineuse DEL située au centre du boîtier, 6) shaker orbitale pour l’agitation pendant l’expérience, et 7) une armoire thermostatique. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
2. Préparation du milieu de croissance des algues
- Le milieu de croissance des algues ISO 8692 se compose de quatre solutions de stock différentes. Peser la quantité appropriée de sels et diluer dans l’eau ultrapure selon le tableau 1.
| Solutions stock | Nutriments | Concentration dans la solution de stock | Concentration dans la solution d’essai |
| 1: Macronutriments | NH4Cl | 1,5 g/L | 15 mg/L (N: 3,9 mg/L) |
| MgCl2•6H2O | 1,2 g/L | 12 mg/L (Mg: 2,9 mg/L) | |
| CaCl2•2H2O | 1,8 g/L | 18 mg/L (Ca: 4,9 mg/L) | |
| MgSO4•7H2O | 1,5 g/L | 15 mg/L (S: 1,95 mg/L) | |
| KH2PO4 | 0,16 g/L | 1,6 mg/L (P : 0,36 mg/L) | |
| 2: Fe-EDTA | FeCl3•6H2O | 64 mg/L | 64 μg/L (Fe: 13 μg/L) |
| Na2EDTA-2H2O | 100 mg/L | 100 μg/L | |
| 3: Oligo-éléments | H3BO3a | 185 mg/L | 185 μg/L (B: 32 μg/L) |
| MnCl2•4H2O | 415 mg/L | 415 μg/L (Mn: 115 μg/L) | |
| ZnCl2 | 3 mg/l | 3 μg/L (Zn: 1,4 μg/L) | |
| CoCl2•6H2O | 1,5 mg/l | 1,5 μg/L (Co: 0,37 μg/L) | |
| CuCl2•2H2O | 0,01 mg/L | 0,01 μg/L (Cu: 3,7 ng/L) | |
| Na2MoO4•2H2O | 7 mg/L | 7 μg/L (Mo: 2,8 μg/L) | |
| 4: NaHCO3 | NaHCO3 | 50 g/L | 50 mg/L (C: 7,14 mg/L) |
Tableau 1 : Concentrations de nutriments dans les solutions de stock pour le milieu de croissance des algues
REMARQUE : H3BO3 peut être dissous en ajoutant 0,1 M NaOH. EdTA doit être enlevé lors de l’essai des métaux, afin d’éviter la complexation avec des ions métalliques. Stériliser les solutions de stock par filtration membranaire (diamètre moyen des pores 0,2 μm) ou par autoclavage (120 °C, 15 min). Ne faites pas de solutions de stock autoclave 2 et 4, mais stérilisez-les par filtration membranaire. Rangez les solutions dans l’obscurité à 4 °C.
- Pour produire 1 L de milieu de croissance d’algues, transférer 500 ml d’eau ultrapure stérilisée dans une fiole volumétrique stérilisée de 1 L et ajouter 10 ml de solution de stock 1: Macronutriments, 1 ml de solution de stock 2: Fe-EDTA, 1 mL de solution stock 3: Oligo-éléments, et 1 mL de solution stock 4: NaHCO3.
- Remplissez jusqu’à 1 L d’eau ultrapure stérilisée, arrêtez la fiole et secouez soigneusement pour homogénéiser le milieu de croissance des algues.
- Équilibrez la solution avant l’utilisation en la laissant toute la nuit en contact avec l’air ou en bouillonnant d’air stérile et filtré pendant 30 min. Après l’équilibre, ajuster le pH, si nécessaire, au pH 8,1 ± 0,2, avec 1 M HCl ou 1 M NaOH.
3. Mise en place du test d’algues
REMARQUE : Un diagramme d’écoulement de la procédure d’essai des algues est indiqué à la figure 2.
Figure 2 : Diagramme d’écoulement de la configuration du test d’algues. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
- Préparer une solution de stock du composé d’essai à la concentration d’essai la plus élevée souhaitée dans le milieu de croissance des algues préparé selon l’étape 2. Pour la préparation de solutions/suspensions de stock, suivez l’OCDE 201 (pour les composés solubles) ou l’OCDE 318 (pour les nanomatériaux).
- Mesurer le pH dans la solution stock. S’il dévie plus d’une unité du milieu de croissance des algues, ajuster le pH à 8 avec 1 M HCl ou 1 M NaOH.
- Calculer le volume d’inoculum nécessaire pour atteindre une concentration cellulaire finale de 1 x 104 cellules/mL dans une solution d’essai de 25 mL.
NOTE: L’inoculum devrait provenir d’une culture de Raphidocelis sous-capitata à croissance exponentielle non contaminée cultivée à l’aide de la configuration LEVITATT. - Calculez la quantité de solution de stock à ajouter à chaque flacon volumétrique de 25 mL pour obtenir les concentrations d’essai souhaitées. Le facteur entre chaque concentration ne doit pas dépasser 3,2.
- Marquez un flacon volumétrique de 25 mL pour chaque concentration choisie et un contrôle marqué de 25 mL de la fiole volumétrique supplémentaire.
- Ajoutez la quantité de solution de stock du composé d’essai nécessaire pour atteindre les concentrations désirées à la fiole volumétrique de 25 mL. N’ajoutez pas de solution de stock au contrôle.
- Ajouter le milieu à chaque flacon volumétrique de 25 mL pour atteindre un volume d’environ 20 ml.
- Ajoutez le volume d’inoculum calculé à l’étape 3.3 à chaque flacon volumétrique de 25 mL. Ajouter le milieu à chaque flacon volumétrique de 25 mL à un volume total final de 25 ml.
- Arrêter les flacons et bien mélanger en tournant les flacons deux fois verticalement.
- Transférer 0,4 ml de chaque flacon dans des flacons à vis individuels et ajouter 1,6 ml d’acétone (saturé de MgCO3): un échantillon pour chaque concentration d’essai et la commande. Fermer les couvercles hermétiquement et les conserver dans l’obscurité à température ambiante jusqu’à ce que la fluorescence mesure (section 4).
- Pipet 4 mL de chaque solution d’essai en flacons de scintillation de 20 mL (3 répliques par concentration et 5 répliques pour le contrôle). Couvercles à vis sur les flacons de scintillation. N’oubliez pas que les couvercles doivent avoir un trou percé (environ 1 mm de diamètre) pour permettre l’échange de CO2.
- Après 24 h, 48 h et 72 h, pipet 0,4 mL de chaque flacon en flacons à capuchon à vis et ajouter 1,6 mL d’acétone (saturé de MgCO3). Fermer les couvercles hermétiquement et les conserver dans l’obscurité à température ambiante jusqu’à ce que la fluorescence mesure (section 4).
- Après que le dernier échantillon est prélevé à 72 h, mettre en commun délicatement les trois répliques pour une concentration donnée dans un flacon et mesurer le pH. Répétez pour toutes les concentrations et le contrôle. Le pH ne doit pas dévier plus de 1,5 unité du pH initial pour l’un des échantillons mesurés.
- Déchargez les liquides restants dans un conteneur à déchets conformément à vos règles et règlements institutionnels.
4. Analyse des échantillons d’essais d’algues
- Utiliser un spectrophotomètre de fluorescence pour mesurer la biomasse d’algues (ici exprimée sous forme de chlorophylle A). L’émission maximale de chlorophylle A est de 420 nm pour la longueur d’onde d’excitation et de 671 nm pour la longueur d’onde d’émission.
- Mesurer la fluorescence de chaque échantillon trois fois et calculer la valeur moyenne de chaque échantillon.
- Utilisez l’équation 1 pour calculer le taux de croissance. La fluorescence mesurée (unités relatives) peut être utilisée directement comme paramètre de biomasse dans l’équation 1.
Équation 1 : μ = (ln Nt – ln N0) / t
où μ est le taux de croissance (d-1),N0 est la biomasse initiale, Nt est la biomasse au moment t, et t est la longueur de la période d’essai (d). Notez que N0 et Nt doivent être exprimés dans la même unité. - Utilisez un logiciel statistique pour adapter une courbe de régression non linéaire (p. ex., une fonction log-logistique ou Weibull) aux données du taux de croissance pour obtenir des valeurs de concentration efficaces à 10 %, 20 % et 50 % d’inhibition. Dans les informations complémentaires, un exemple de code pour s’adapter au logiciel statistique R utilisant le paquet11 de la RDC est donné.
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Representative Results
Un premier test avec une substance de référence est effectué pour déterminer la sensibilité de la souche d’algues. Les substances de référence régulièrement utilisées pour R. subcapitata sont le dichromate de potassium et le dichlorphénol7,8. Les figures 3 et 2 montrent un résultat représentatif d’un test d’algues, y compris l’ajustement des courbes et les extrants statistiques lorsque le paquet RDC en R est appliqué aux taux de croissance.
Figure 3 : Courbe représentative concentration-réponse pour exposition à 72 h d’un composé chimique aux algues (R. subcapitata). La ligne solide représente l’ajustement log-logistique et la zone ombragée est l’intervalle de confiance de 95% pour l’ajustement. Les cercles ouverts représentent le taux de croissance calculé pour chaque réplique. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| EC10 | EC20 | EC50 | |
| [mg/L] | [mg/L] | [mg/L] | |
| Composé chimique | 4.6 [1.8-7.5] | 7.4 [4.1-11] | 16.9 [11-22] |
Tableau 2 : Concentrations efficaces représentatives pour 10 %, 20 % et 50 % d’inhibition du taux de croissance d’un composé chimique utilisant des algues (R. subcapitata). La valeur entre parenthèses représente l’intervalle de confiance de 95 % d’un raccord log-logistique.
Un test réussi aura des taux de croissance supérieurs à 0,9 d-1 pour se conformer aux lignes directrices de l’OCDE et 1,5 d-1 pour se conformer aux lignes directrices iso 8692 et devrait contenir au moins une concentration entre 0% et 100% d’inhibition. De faibles taux de croissance peuvent résulter de divers problèmes tels que la contamination bactérienne ou l’inoculum qui n’est pas en phase de croissance exponentielle au début de l’essai. L’étude microscopique des répliques ne doit montrer que des algues vertes uniformes en forme de faucille (R. subcapitata) avec des dimensions d’environ 2 μm de largeur et 8 μm de longueur. Si une seule réplique est contaminée, elle peut être omise et l’analyse peut être effectuée sans ces données. Toutefois, si plusieurs répliques sont contaminées, répétez l’expérience avec l’inoculum de croissance exponentielle non contaminé. Pour évaluer si l’inoculum était dans la phase de croissance exponentielle au début de l’essai, calculer le taux de croissance du contrôle se reproduit à intervalles de 24 h et n’utiliser que l’intervalle de temps à partir duquel la croissance des algues du contrôle est exponentielle pour l’analyse statistique.
Pour tester la robustesse de la configuration, un test de toxicité utilisant deux substances de référence (K2Cr2O7 et 3,5-Dichlorophénol) et trois nanomatériaux a été répété trois fois (3,5-Dichlorophénol, Nanoparticules BaSO4 (NM-220) et nanoparticules ZnO (NM-111)) et quatre fois (nanoparticules K2Cr2O7 et CeO2 (NM-212)). Les résultats ont montré un coefficient de variation des valeurs EC50entre 11 % et 39 %, avec le coefficient de variation le plus faible observé pour les nanoparticules ZnO (NM-111) et le coefficient de variation le plus élevé pour les nanoparticules CeO2 (NM-212) (tableau 3).
| Composé | # d’expériences | Coefficient inter-échantillon de variation pour le taux de croissance % |
EC50 (moyenne) mg/L |
Coefficient de variation pour les valeurs EC50 % |
| K2Cr2O7 | 4 | 4.5 | 0.73 | 13 |
| 3,5-Dichlorophénol | 3 | 3.4 | 1.9 | 21 |
| BaSO4 NP (NM-220) | 3 | 5.6 | 22 | 20 |
| Ceo2 NP (NM-212) | 4 | 4.3 | 13 | 39 |
| ZnO NP (NM-111) | 3 | 3.4 | 0.13 | 11 |
Tableau 3 : Résultats d’un test interne de toxicité en laboratoire avec R. subcapitata exposé pour 72 h à deux substances de référence et trois nanomatériaux du dépôt du CCR
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Discussion
Le phytoplancton convertit l’énergie solaire et le dioxyde de carbone en matière organique et joue ainsi un rôle central dans l’écosystème aquatique. Pour cette raison, les tests d’inhibition du taux de croissance des algues sont inclus comme l’un des trois tests de toxicité aquatique obligatoires requis pour l’évaluation réglementaire des risques des produits chimiques. La capacité d’effectuer un test fiable et reproductible de toxicité des algues est essentielle à cet égard. Les configurations de test à l’aide de flacons Erlenmeyer introduisent une gamme de variétés et d’inconvénients tels que décrits dans l’introduction. Pour contourner ce problème, des plaques de microtitre ont été proposées3. Bien que les plaques de microtitre minimisent le volume et l’espace requis pour les essais, des préoccupations ont été soulevées dans la littérature en ce qui concerne la conformité de ces configurations aux critères de validité des essais des lignes directrices d’essai6. Par exemple, une perte importante de produits chimiques semi-volo-sociaux ainsi que le passage à d’autres puits dans des plaques de microtitre à 37 °C dans les milieux de croissance cellulaire (DMEM GluteMAX, Opti-MEM et Hams F12 GlutaMAX) a récemment été démontrée par Birch et al.12. Les essais de substances volatiles peuvent être effectués avec succès avec la configuration de LEVITATT à l’aide de 1) flacons fermés avec co2 enrichi headspace9, 2) en assant directement le composé volatil à travers l’espace de tête13 ou dans un flacon de test rempli10. En termes d’espace requis, LEVITATT fournit une configuration d’essai qui comble l’écart entre les plaques de microtitre et les configurations de flacons Erlenmeyer tout en offrant des avantages des deux configurations, par exemple, en maintenant un environnement d’essai concis et compact et un volume d’essai suffisant pour l’échantillonnage destructeur (par exemple, pour la caractérisation des nanomatériaux pendant l’essai).
La variabilité entre les échantillons du système d’essai LEVITATT variait de 3,4 % (3,5-Dichlorophénol et ZnO NP) à 5,6 % (BaSO4 NP). Cela s’inscrit dans l’exigence d’un coefficient de variation de la croissance moyenne dans les cultures témoins par réplique de 15 % indiqué par la ligne directrice7 de l’OCDE 201 (pour la variabilité inter-échantillons de LEVITATT, toutes les expositions ont également été incluses).
La reproductibilité en ce qui concerne les valeurs EC50de la configuration d’essai pour les substances de référence a montré un coefficient de variance de 13 % pour K2Cr2O7 (n = 4) et de 21 % pour 3,5-Dichlorophénol (n = 3). Ceci est comparable aux essais effectués avec des biosassays conventionnels de 250 ml Erlenmeyer pour la substance de référence K2Cr2O7 montrant 16,8 %14 et 25,4 %15 coefficient de variation pour les valeurs EC50. Les plaques de microtitre ont montré un coefficient de variation plus faible pour certaines substances de référence (p. ex., K2Cr2O7 (9 %14,15),tandis que des coefficients de variation plus élevés ont été observés pour le phénol (34,9 %16) et le dichlorophénonol (38 %17). Des informations limitées sont disponibles en ce qui concerne la reproductibilité des études avec des nanomatériaux. Toutefois, en comparant le coefficient de variation entre échantillons pour les NP ZnO à l’aide du système LEVITATT (3,4 %) avec des plaques de microtiter (67%18) ou des flacons Erlenmeyer (13%19 et 35%20)il a moins de variation. Afin de tester davantage la robustesse du système LEVITATT, une étude à la ronde de deux matériaux d’essai (une substance de référence et une substance difficile à tester) a été lancée.
Le maintien d’une culture algale non contaminée peut être difficile s’il n’est pas manipulé dans des conditions stériles. La croissance exponentielle des algues est une condition préalable essentielle à l’exécution des tests d’algues. La mesure de la croissance à plusieurs moments (p. ex., 24 h, 48 h, 72 h) peut déterminer si une croissance exponentielle se produit tout au long de la période d’essai. Les fluctuations de température et de pH peuvent influer sur la croissance des algues; par conséquent, ces paramètres doivent être stables tout au long de la période d’essai. Dans de petits volumes d’échantillons d’essai, les fluctuations de température et de pH se produisent plus rapidement que les volumes plus importants et les problèmes pratiques de mesure de ces paramètres sont de plus en plus difficiles avec la diminution du volume d’essai. Des paramètres tels que le pH et la température utilisant un volume d’essai de 4 mL étaient stables tout au long d’une période d’essai de 72 h dans le LEVITATT, tant dans une pièce à température contrôlée à 20 °C ± 2 °C et dans un incubateur dans des conditions similaires.
Les méthodes analytiques de quantification de la croissance des algues sont nombreuses : comptage cellulaire dans un hémocytomètre, compteur coulter ou fluorescence des extraits pigmentaires. Pour les substances difficiles, il convient de tenir compte de la méthode la plus appropriée pour la quantification de la biomasse. Pour les nanoparticules d’oxyde métallique, la fluorescence des extraits de pigments s’est avérée plus performante en raison de l’interférence des agglomères lors du comptage des algues par hémocytomètre ou compteurcoulter 21. En revanche, Farkas et Booth22 ont constaté que la quantification de la biomasse par fluorescence n’était pas une méthode appropriée pour l’essai de l’écotoxicité des nanomatériaux à base de carbone en raison de l’autofluorescence et de l’absorption des pigments aux nanomatériaux. Pour les substances colorées, il peut également y avoir interférence de la couleur avec le signal d’émission de fluorescence, donc, nécessitant des contrôles supplémentaires ou la dilution à un niveau où cette interférence est négligeable.
Dans le document d’orientation pour les tests de toxicité aquatique des substances difficiles2, l’une des recommandations pour tester les matériaux colorés est d’augmenter l’intensité lumineuse. De même, l’augmentation de l’intensité lumineuse a été mentionnée pour contourner les problèmes d’ombrage lors de l’essai des nanomatériaux23,24. Toutefois, ces modifications sont souvent associées à une augmentation des températures, ce qui nécessite un refroidissement ou une ventilation supplémentaire des échantillons. Dans la configuration LEVITATT, ceci est résolu en utilisant la lumière DEL qui produit peu de chaleur par rapport aux ampoules conventionnelles ou aux tubes fluorescents. En outre, le choix d’une LED avec une puissance lumineuse suffisamment élevée et l’installation d’un gradateur permettent d’augmenter l’intensité lumineuse pour tester des substances colorées ou des nanomatériaux et des produits chimiques réguliers sans modifier la configuration globale entre les tests. En outre, le placement de la source lumineuse sous les échantillons et dans des enveloppes séparées permet un champ lumineux cohérent et homogène.
En conclusion, le LEVITATT fournit une plate-forme compacte pour l’essai de toxicité des algues de produits chimiques réguliers conforme aux lignes directrices internationales normalisées. En outre, la configuration fournit une plate-forme robuste pour tester des substances difficiles qui interfèrent avec le passage de la lumière vers les algues, par exemple, les nanomatériaux.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à révéler.
Acknowledgments
Cette recherche a été financée par PATROLS – Advanced Tools for NanoSafety Testing, Grant agreement 760813 dans le cadre du programme de recherche et d’innovation Horizon 2020.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Sigma-Aldrich | V179124 | |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | 254134 | |
| BlueCap bottles (1L) | Buch & Holm A/S | 9072335 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B0394 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | 208290 | |
| Clear acrylic sheet (40x40 cm) | |||
| Cobalt(II) chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 255599 | |
| Copper(II) chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | 307483 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Fluorescence Spectrophotometer F-7000 | Hitachi | ||
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| Iron(III) chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 236489 | |
| LED light source | Helmholt Elektronik A/S | H35161 | Neutral White, 6500K |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Manganese(II) chloride tetrahydrate | Sigma-Aldrich | 221279 | |
| Orbital shaker | IKA | 2980200 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Raphidocelis subcapitata | NORCCA | NIVA-CHL1 strain | |
| Scintillation vials (20 mL) | Fisherscientific | 11526325 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 415413 | |
| Sodium molybdate dihydrate | Sigma-Aldrich | 331058 | |
| Spring clamp | Frederiksen Scientific A/S | 472002 | |
| Thermostatic cabinet | VWR | WTWA208450 | Alternative: temperature controlled room |
| Ventilation pipe (Ø125 mm) | Silvan | 22605630165 | |
| Volumetric flasks (25 mL) | DWK Life Sciences | 246781455 | |
| Zinc chloride | Sigma-Aldrich | 208086 |
References
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- Organisation for Economic Cooperation and Development. Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. Organisation for Economic Cooperation and Development. , (2019).
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