Summary
Led ile dikey olarak aydınlatılmış bir kurulum kullanarak zor maddeler (örneğin, renkli maddeler veya nanomalzemeler) için alg toksisite testi gösteriyoruz.
Abstract
Ekotoksisite verileri, kimyasalların Avrupa ve uluslararası düzenlemelere (örneğin REACH) göre pazar öncesi ve sonrası tescili için bir gerekliliktir. Alg toksisite testi kimyasalların düzenleyici risk değerlendirmesinde sıklıkla kullanılmaktadır. Yüksek güvenilirlik ve tekrarlanabilirlik elde etmek için standartlaştırılmış kılavuzların geliştirilmesi hayati önem taşımaktadır. Alg toksisite testi için, kurallar pH, sıcaklık, karbondioksit düzeyleri ve ışık yoğunluğu gibi parametrelerin kararlı ve düzgün koşullarını gerektirir. Nanomalzemeler ve diğer sözde zor maddeler ışık la karışarak elde edilen sonuçlarda büyük bir değişime neden olabilir ve bu da onların düzenleyici kabullerini engelleyebilir. Bu zorlukları gidermek için LEVITATT (Alg Toksisite Testleri için LED Dikey Aydınlatma Tablosu) geliştirdik. Kurulum, aşağıdan LED aydınlatmayı kullanarak homojen bir ışık dağılımı ve sıcaklık kontrolü sağlarken aynı zamanda numune içi gölgelemi en aza indirir. Kurulum biyokütle nicelleştirme için örnek hacmi optimize eder ve aynı zamanda yosun üstel büyümesini desteklemek için CO2 yeterli bir akını sağlamak yok. Ayrıca, test kaplarının malzemesi adsorpsiyon ve volatilization en aza indirmek için özel olarak uyarlanabilir. Renkli maddeler veya partikül süspansiyonlar test ederken, LED ışıklarıkullanımı da ek ısı üretimi olmadan ışık yoğunluğunu artırmak için izin verir. Kompakt tasarım ve minimum ekipman gereksinimleri, LEVITATT'ın çok çeşitli laboratuvarlarda uygulanması olanaklarını artırır. Alg toksisite testi için standart ISO ve OECD yönergelerine uygun olmakla birlikte, LEVITAT ayrıca iki referans madde (3,5-Dicholorophenol ve K2Cr2O7)ve üç nanomalzeme (ZnO, CeO2ve BaSO4)için erlenmeyer şişeleri ve mikrotiter plakalara göre daha düşük bir numune arası değişkenlik gösterdi.
Introduction
Alg toksisite testi, avrupa ve uluslararası düzenlemeler (örneğin REACH1 ve TSCA (ABD) tarafından kimyasalların pazar öncesi ve sonrası kaydı için gerekli olan ekotoksisite verilerini oluşturmak için kullanılan üç zorunlu testten biridir. Bu amaçla, uluslararası kuruluşlar (örneğin, ISO ve OECD) tarafından standartlaştırılmış alg test yönergeleri geliştirilmiştir. Bu test standartları ve yönergeleri, pH, sıcaklık, karbondioksit seviyeleri ve ışık yoğunluğu açısından ideal test koşullarını öngörülmüştür. Ancak, alg testi sırasında istikrarlı test koşullarının korunması pratikte zordur ve sonuçlar kimyasal maddeler ve nanomalzemeler (genellikle "zor maddeler" olarak anılacaktır) bir dizi için tekrarlanabilirlik ve güvenilirlik ile ilgili sorunlar muzdarip2. Mevcut alg toksisite test kurulumlarının çoğu nispeten büyük hacimlerde (100-250 mL) bir kuvöz içinde bir orbital shaker üzerinde bulunan çalışır. Böyle bir kurulum test konsantrasyonlarının sayısını sınırlar ve elde edilebilir ve yüksek hacimli alg kültürü ve test materyalini çoğaltır. Ayrıca, bu kurulumlar nadiren tek tip bir ışık alanı var ve güvenilir aydınlatma koşulları daha büyük şişelerde elde etmek daha zordur, Kısmen ışık yoğunluğu katlanarak azalır daha fazla ışık seyahat ve kısmen şişe geometrisi nedeniyle. Alternatif kurulumlar, pH, ek biyokütle ölçümleri, pigment ekstraksiyonu veya yıkıcı örnekleme gerektiren diğer analizleri ölçmek için yeterli numune alma hacimlerine izin vermeyen küçük numune hacimleri içeren plastik mikrotiter3 plakalardan oluşur. Nanomalzemeler ve renkli süspansiyonlar oluşturan maddelerin alg toksisite testi için mevcut kurulumları kullanarak belirli bir sorun girişim veya alg hücreleri için kullanılabilir ışık engelleme, genellikle "gölgeleme"4,,5olarak anılacaktır . Test materyali ve/veya test materyali ile alg hücreleri arasındaki etkileşimler şişeler içinde gölgeleme oluşabilir veya şişeler arasında birbirlerine ve ışık kaynağına göre konumlamaları nedeniyle gölgeleme oluşabilir.
Yöntem, Arensberg ve ark.6 tarafından tanıtılan ve OECD 2017ve ISO 86928gibi standartlara uygun olarak test edilmesine olanak tanıyan küçük ölçekli alg toksisite testi kurulumuna dayanmaktadır. Yöntem daha yukarıda belirtilen sınırlamaları gidermek için optimize edilmiştir: 1) minimum ısı üretimi ile düzgün ışık koşulları sağlamak için LED ışık teknolojisini kullanarak, 2) sabit pH korurken kimyasal / biyolojik analiz için yeterli örnek hacmi sağlayan, CO2 düzeyleri, ve 3) uçucu maddelerin veya maddelerin test etmek için çok yönlü test konteyner malzeme kullanımını sağlayan yüksek bir sorpsiyon potansiyeli ile.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. LEVITATT kurulumunun tanımı
- Işık penetrasyonuna izin veren 20 mL sintillasyon cam şişeleri(Şekil 1, insert 1) kullanın. Alternatif olarak, hafif penetrable plastik şişeler kullanılabilir. Bir fotometre kullanarak ışık yoğunluğunu ölçün.
- Biyokütlenin ölçülmesine ve kuluçka sırasında ve sonrasında nanomalzemelerin karakterizasyonu/nicelemesi için testin başında en az 4 mL test süspansiyonu kullanın(Şekil 1, insert 2).
- Atmosferle CO2 değişimi için küçük bir delik (yaklaşık 1 mm çapında) delinmiş bir kapak(Şekil 1, insert 3) ile 20 mL sintilasyon şişelerini yerleştirin. Bu değişim, test sırasında sabit pH ve CO2 düzeylerini sağlamak için çok önemlidir.
- Uçucu maddeler için, co 2 zenginleştirilmiş sodyum bikarbonat (NaHCO3) tampon sistemi10tarafından çözelti içindemuhafaza edilir hiçbir gaz fazı ile bir şırınga9 veya tamamen kapalı şişeler kullanarak headspace CO2 zenginleştirmek için bir hava geçirmez Teflon kaplı kapak kullanın.
- Dış kasaya takılan kelepçelerle şişeleri sabitle(Şekil 1, insert 4).
- Test şişelerinin altında yer alan bir LED ışık kaynağı kullanın(Şekil 1, insert 5) "cool-white" veya "gün ışığı" tipinde tek tip floresan aydınlatma ve 400 nm ile 700 nm arasında fotosentetik olarak etkili dalga boyu aralığında ölçülen 60-120 μEμm-2-s -1 aralığında bir ışık yoğunluğu sağlar. Kurulum, 5-160 μEμ-2 °s-1 aralığında, kaynağa bir ışık dimmer takarak ayarlanabilir ışık yoğunluğunu kullanır. Bu, daha yüksek ve daha düşük ışık yoğunluklarında test edilmesine olanak sağlar.
- Test süresince numuneleri karıştırmak için kurulumu yörüngesel bir çalkalayıcıya monte edin. Bu da hücreleri serbest süspansiyonda tutar ve havadan suya CO2 kütle transferini kolaylaştırır(Şekil 1, insert 6).
- Kurulum, test boyunca sabit sıcaklıkları korumak için sıcaklık kontrollü bir odaya veya termostatik bir kabine yerleştirin(Şekil 1,insert 7).
Şekil 1: Alg Toksisitesi Testleri (LEVITATT) için LED Dikey Aydınlatma Tablosu resmi. 1) Kuluçka için 20 mL cam ışıltı şişeleri, 2) analiz için 4 mL numune, 3) CO2 değişimi için delinmiş delikli kapak, tanımlanmış ışık koşulları için 4) kasa, 5) kasanın merkezinde bulunan LED ışık kaynağı, 6) deney sırasında ajitasyon için orbital shaker ve 7) termostatik dolap. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
2. Alg büyüme ortamının hazırlanması
- ISO 8692 alg büyüme ortamı dört farklı stok çözümünden oluşmaktadır. Uygun miktarda tuzları tartın ve Tablo 1'egöre ultra saf suda seyreltin.
| Stok çözümleri | Besin | Stok çözeltisinde konsantrasyon | Test çözeltisinde konsantrasyon |
| 1: Makrobesinler | NH4Cl | 1.5 g/L | 15 mg/L (N: 3.9 mg/L) |
| MgCl2,6H2O | 1.2 g/L | 12 mg/L (Mg: 2.9 mg/L) | |
| CaCl2,2H2O | 1.8 g/L | 18 mg/L (Ca: 4.9 mg/L) | |
| MgSO4,7H2O | 1.5 g/L | 15 mg/L (S: 1.95 mg/L) | |
| KH2PO4 | 0,16 g/L | 1.6 mg/L (P: 0,36 mg/L) | |
| 2: Fe-EDTA | FeCl3,6H2O | 64 mg/L | 64 μg/L (Fe: 13 μg/L) |
| Na2EDTA2H2O | 100 mg/L | 100 μg/L | |
| 3: Eser elementler | H3BO3a | 185 mg/L | 185 μg/L (B: 32 μg/L) |
| MnCl2,4H2O | 415 mg/L | 415 μg/L (Mn: 115 μg/L) | |
| ZnCl2 | 3 mg/L | 3 μg/L (Zn: 1,4 μg/L) | |
| CoCl2,6H2O | 1.5 mg/L | 1.5 μg/L (Co: 0.37 μg/L) | |
| CuCl2,2H2O | 0.01 mg/L | 0.01 μg/L (Cu: 3.7 ng/L) | |
| Na2MoO4,2H2O | 7 mg/L | 7 μg/L (Mo: 2.8 g/L) | |
| 4: NaHCO3 | NaHCO3 | 50 g/L | 50 mg/L (C: 7.14 mg/L) |
Tablo 1: Alg büyüme ortamı için stok çözeltilerinde besin konsantrasyonları
NOT: H3BO3 0,1 M NaOH eklenerek çözülebilir. Metal iyonları ile karmaşıklaşmayı önlemek için, metaller test ederken EDTA çıkarılmalıdır. Membran filtrasyon (ortalama gözenek çapı 0,2 μm) veya otoklavlama (120 °C, 15 dk) ile stok çözeltilerini sterilize edin. 2 ve 4 otoklav stok çözeltisi yapmayın, ancak membran filtrasyon ile sterilize edin. Çözeltileri karanlıkta 4 °C'de saklayın.
- Alg büyüme ortamının 1 L'sini üretmek için, 500 mL sterilize edilmiş ultrasaf suyu 1 L sterilize edilmiş hacimsel şişeye aktarın ve 10 mL stok çözeltisi 1: Makrobesinler, 1 mL stok çözeltisi 2: Fe-EDTA, 1 mL stok çözeltisi 3: Eser elemanlar ve 1 mL stok çözeltisi 4: NaHCO3.
- Sterilize edilmiş ultra saf su ile 1 L'ye kadar doldurun, şişeyi durdurun ve alg büyüme ortamını homojenize etmek için iyice çalkalayın.
- Solüsyonu kullanmadan önce havayla temas halinde bir gecede bırakarak veya steril, filtrelenmiş havayla köpürerek 30 dakika boyunca dengeleyin. Dengeden sonra pH'ı gerekirse 1 M HCl veya 1 M NaOH ile pH 8.1 ± 0.2 olarak ayarlayın.
3. Alg testinin ayarlanması
NOT: Alg test prosedürünün akış diyagramı Şekil 2'degösterilmiştir.
Şekil 2: Alg test kurulumunun akış diyagramı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
- Adım 2'ye göre hazırlanan alg büyüme ortamında test bileşiğinin stok çözeltisini istenilen en yüksek test konsantrasyonunda hazırlayın. Stok çözümlerinin/süspansiyonların hazırlanması için OECD 201 (çözünür bileşikler için) veya OECD 318 'i (nanomalzemeler için) takip edin.
- Stok çözeltisindeki pH'ı ölçün. Alg büyüme ortamından birden fazla birim sapıyorsa, pH'ı 1 M HCl veya 1 M NaOH ile 8'e ayarlayın.
- 25 mL'lik bir test çözeltisinde 1 x 104 hücre/mL'lik son hücre konsantrasyonuna ulaşmak için gereken inokül hacmini hesaplayın.
NOT: Inoculum, LEVITATT kurulumu kullanılarak yetiştirilen kontamine olmayan bir şekilde büyüyen Raphidocelis subcapitata kültüründen gelmelidir. - İstenilen test konsantrasyonlarını elde etmek için her 25 mL hacimsel şişeye eklenecek stok çözeltisi miktarını hesaplayın. Her konsantrasyon arasındaki faktör 3.2'yi geçmemelidir.
- Seçilen her konsantrasyon için bir adet 25 mL hacimsel şişe ve 25 mL hacimsel şişe işaretli kontrol işaretli.
- 25 mL hacimsel şişeye istenilen konsantrasyonlara ulaşmak için gerekli test bileşiğin stok çözeltisi miktarını ekleyin. Denetime stok çözümü not eklemeyin.
- Yaklaşık 20 mL'lik bir hacme ulaşmak için her 25 mL hacimsel şişeye ortayı ekleyin.
- Her 25 mL hacimli şişeye adım 3.3'te hesaplanan inokül hacmini ekleyin. Her 25 mL hacimsel şişeye ortayı 25 mL'lik son toplam hacmine ekleyin.
- Mataraları durdurun ve şişeleri dikey olarak iki kez çevirerek iyice karıştırın.
- Her şişeden 0,4 mL'lik tek tek vida kapağı şişelerine aktarın ve 1,6 mL aseton ekleyin (MgCO3ile doymuş): her test konsantrasyonu ve kontrol için bir numune. Kapakları sıkıca kapatın ve floresan ölçümlerine (bölüm 4) kadar oda sıcaklığında karanlıkta saklayın.
- Her test çözeltisinin 4 mL'si 20 mL sintillasyon şişelerine (konsantrasyon başına 3 kopya ve kontrol için 5 kopya). Scintillation şişeleri vida kapakları. Kapakların CO2 değişimi için delinmiş bir delik (yaklaşık 1 mm çapında) olması gerektiğini unutmayın.
- 24 saat, 48 saat ve 72 h sonra, vida kapağı şişeleri içine her şişe den 0.4 mL pipet ve aseton 1.6 mL ekleyin (MgCO ile doymuş3). Kapakları sıkıca kapatın ve floresan ölçümlerine (bölüm 4) kadar oda sıcaklığında karanlıkta saklayın.
- Son numune 72 saat alındıktan sonra, bir şişede belirli bir konsantrasyon için üç kopyayı yavaşça bir araya ve pH'ı ölçün. Tüm konsantrasyonlar ve kontrol için tekrarlayın. ölçülen örneklerin herhangi biri için pH ilk pH'dan 1,5 birimden fazla sapmamalıdır.
- Kalan sıvıları kurumsal kural ve yönetmeliklere uygun olarak bir atık kabına boşaltın.
4. Alg test örneklerinin analizi
- Alg biyokütlesini ölçmek için floresan spektrofotometre kullanın (burada klorofil A olarak ifade edilir). Klorofil A için pik emisyon uyarma dalga boyu için 420 nm ve emisyon dalga boyu için 671 nm'dir.
- Her bir numunenin floresansını üç kez ölçün ve her numunenin ortalama değerini hesaplayın.
- Büyüme hızını hesaplamak için denklem 1'i kullanın. Ölçülen floresan (bağıl birimler) denklem 1'de biyokütle parametresi olarak doğrudan kullanılabilir.
Denklem 1: μ = (ln Nt – ln N0) / t
μ büyüme hızı (d-1),N0 ilk biyokütle, Nt zaman t biyokütle ve t test süresi (d) uzunluğudur. Not, N0 ve Nt aynı birimde ifade edilmelidir. - %10, %20 ve %50 inhibisyon da etkili konsantrasyon değerleri elde etmek için doğrusal olmayan bir regresyon eğrisini (örn. log-logistic veya Weibull fonksiyonu) büyüme hızı verilerine sığdırmak için istatistiksel bir yazılım kullanın. Ek bilgilerde DRC paketi11 kullanarak istatistiksel yazılım R montaj için kod bir örnek verilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Alg suşunun hassasiyetini belirlemek için referans madde ile ilk test yapılır. Referans maddeler düzenli R. subcapitata için kullanılan potasyum dikromat ve 3,5-Dichlorphenol7,8. Şekil 3 ve Tablo 2, R'deki DRC paketi büyüme oranlarına uygulandığında eğri montajı ve istatistiksel çıktıları içeren bir alg testinin temsili bir sonucunu göstermektedir.
Şekil 3: Bir kimyasal bileşiğin yosuna(R. subcapitata)72 h maruz kalmaları için temsili konsantrasyon-tepki eğrisi. Düz çizgi log-logistic uyumu temsil eder ve gölgeli alan uyum için% 95 güven aralığıdır. Açık daireler, her çoğaltma için hesaplanan büyüme oranını temsil ediyor. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| EC10 | EC20 | EC50 | |
| [mg/L] | [mg/L] | [mg/L] | |
| Kimyasal bileşik | 4.6 [1.8-7.5] | 7.4 [4.1-11] | 16.9 [11-22] |
Tablo 2: Yosun (R. subcapitata) kullanan bir kimyasal bileşik için %10, %20 ve %50 büyüme hızı nın temsili etkili konsantrasyonları. Parantez içinde değer bir log-logistic uydurma% 95 güven aralığını temsil eder.
Başarılı bir test, OECD kılavuzuna uymak için 0,9 d-1'in üzerinde büyüme oranlarına ve ISO 8692 kılavuzuna uymak için 1,5d-1'e sahip olacak ve %0 ile %100 arasında en az bir konsantrasyon içermelidir. Düşük büyüme oranları, testin başında üstel büyüme aşamasında olmaması gibi bakteriyel kontaminasyon veya inokül gibi çeşitli sorunların bir sonucu olarak ortaya çıkabilir. Kopyaların mikroskobik incelemesi nde sadece yaklaşık 2 μm genişlik ve 8 μm uzunluğunda tek tip orak şeklinde yeşil alg(R. subcapitata)gösterilmelidir. Tek bir çoğaltma kirlenmişse, bu atlanabilir ve bu veriler olmadan çözümleme yapılabilir. Ancak, birden fazla çoğaltma kirlenmişse, deneyi kontamine edilmemiş katlanarak büyüyen inoculum ile tekrarlayın. İnokül'ün testin başında üstel büyüme aşamasında olup olmadığını değerlendirmek için, kontrol büyüme hızını 24 saat aralıklarla hesaplayın ve sadece kontrolün alg büyümesinin istatistiksel analiz için üstel olduğu zaman aralığını kullanın.
Kurulumun sağlamlığını test etmek için, iki referans madde (K2Cr2O7 ve 3,5-Diklorofenol) ve üç nanomalzeme kullanılarak yapılan toksisite testi üç kez (3,5-Dichlorophenol, BaSO4 nano tanecikleri (NM-220) ve ZnO nano partikülleri (NM-111)) ve dört kez (K2Cr2O7 ve CeO2 nano tanecikleri (NM-22)) tekrarlandı. Sonuçlar, ZnO nano tanecikleri (NM-111) için gözlenen en düşük varyasyon katsayısı (NM-111) ve CeO2 nano tanecikleri için en yüksek varyasyon katsayısı (NM-212) ile %11 ile %39 arasında BIR AT50-değerlerininbir değişim katsayısı gösterdi(Tablo 3).
| Bileşik | # deneyler | Büyüme hızı için örneklemeler arası değişim katsayısı % |
EC50 (ortalama) mg/L |
EC50 değerleri için değişim katsayısı % |
| K2Cr2O7 | 4 | 4.5 | 0.73 | 13 |
| 3,5-Diklorofenol | 3 | 3.4 | 1.9 | 21 |
| BaSO4 NP (NM-220) | 3 | 5.6 | 22 | 20 |
| CeO2 NP (NM-212) | 4 | 4.3 | 13 | 39 |
| ZnO NP (NM-111) | 3 | 3.4 | 0.13 | 11 |
Tablo 3: JRC deposundan 72 saat iki referans madde ve üç nanomalzemeye maruz kalan R. subcapitata ile bir iç laboratuvar toksisite testinin sonuçları
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fitoplankton, güneş enerjisini ve karbondioksiti organik maddeye dönüştürür ve böylece sucul ekosistemde önemli bir rol oynar. Bu nedenle, alg büyüme hızı inhibisyonu testleri kimyasalların düzenleyici risk değerlendirmesi için gerekli üç zorunlu sutoksisitesi testinden biri olarak dahildir. Güvenilir ve tekrarlanabilir alg toksisitesi testi yapabilme yeteneği bu açıdan çok önemlidir. Erlenmeyer şişeleri kullanılarak yapılan test kurulumları, girişte açıklandığı gibi çeşitli farklılıklar ve rahatsızlıklar sunar. Bu sorunu aşmak için, mikrotiter plakalarönerilmiştir 3. Mikrotiter plakalar test için gerekli olan hacmi ve alanı en aza indirirken, bu tür kurulumların test yönergelerinin test geçerlilik kriterlerine uygunluğu ile ilgili endişeler literatürde gündeme gelmiştir6. Örneğin, hücresel büyüme medyasında (DMEM GluteMAX, Opti-MEM ve Hams F12 GlutaMAX) 37 °C'de mikrotiter plakalarda yarı uçucu kimyasalların yanı sıra diğer kuyulara çapraz geçiş son zamanlarda Birch ve ark.12tarafından gösterilmiştir. Uçucu maddelerin test başarıyla 1) CO2 zenginleştirilmiş headspace9ile kapalı şişeler kullanılarak LEVITATT kurulumu ile yapılabilir , 2) doğrudan headspace13 veya dolu bir test şişesi10ile uçucu bileşik dosing . Alan gereksinimleri açısından, LEVITAT, mikrotiter plakalar ile Erlenmeyer şişe kurulumları arasındaki boşluğu dolduran bir test kurulumu sağlarken, her iki kurulumdan da fayda sağlar, örneğin, kısa ve kompakt bir test ortamı ve yıkıcı örnekleme için yeterli test hacmi (örn. test sırasında nanomalzemelerin karakterizasyonu için).
LEVITATT test sistemi için numuneler arası değişkenlik %3,4 (3,5-Diklorofenol ve ZnO NP) ile %5,6 (BaSO4 NP) arasında değişmekteydi. Bu, OECD 201 kılavuzu7'de belirtilen %15'lik çoğaltma kontrol kültürlerindeki ortalama büyüme katsayısının katsayısının gerekliliği dahilindedir (LEVITAT örnekleme ler arası değişkenlik için tüm pozlamalar da dahil edilmiştir).
Referans maddeler için test kurulumunun EC50değerlerine ilişkin tekrarlanabilirlik, K2Cr2O7 (n = 4) için %13, 3,5-Diklorofenol için %21 (n = 3) için bir varyans katsayısı gösterdi. Bu, %16,814 ve %25,415'lik VARYASYON katsayısını gösteren K2Cr2O7 referans maddesi için konvansiyonel250mL Erlenmeyer şişe biyoassays ile yapılan testler ile karşılaştırılabilir. Mikrotiter plakalar bazı referans maddeler için daha düşük varyasyon katsayısı göstermiştir (örneğin, K2Cr2O7 (%9%14,,15),fenol için varyasyon katsayıları daha yüksek gözlenmiştir ise (34.9%16) ve Diklorofenol (38%17). Nanomalzemelerle yapılan çalışmaların tekrarlanabilirliği konusunda sınırlı bilgi mevcuttur. Ancak, LEVITATT sistemini kullanarak ZnO NP'ler için numuneler arası değişim katsayısının karşılaştırılması (%3,4) mikrotiter plakaları (%6718)veya Erlenmeyer şişeleri (%1319 ve %3520)ile daha az varyasyona sahiptir. LEVITATT sisteminin sağlamlığını daha fazla test etmek için iki test materyali (bir referans madde ve bir test maddesi zor) üzerinde bir round-robin çalışma başlatılmıştır.
Steril koşullarda ele alınmadığı takdirde kirlenmemiş bir alg kültürünü korumak zor olabilir. Üstel alg büyümesi kılavuz alg testi yapmak için önemli bir ön koşuldur. Birden fazla zaman noktalarındaki büyümenin ölçülmesi (örneğin, 24 saat, 48 h, 72 saat) test dönemi boyunca üstel büyümenin meydana gelip gelmediğini belirleyebilir. Sıcaklık ve pH dalgalanmaları alg büyümesini etkileyebilir; bu nedenle, bu parametreler test dönemi boyunca kararlı olmalıdır. Test numunesi küçük hacimlerde, sıcaklık ve pH dalgalanmaları daha büyük hacimlere göre daha hızlı meydana gelir ve bu parametreleri ölçme pratik sorunları test hacmiazalan ile giderek daha zordur. 4 mL test hacmi kullanan pH ve sıcaklık gibi parametreler, LEVITAT'ta hem 20 °C ± 2 °C'de sıcaklık kontrollü bir odada, hem de benzer koşullarda bir kuluçka makinesinde 72 saatlik bir test dönemi boyunca sabitkli ydi.
Alg büyümesini ölçmek için analitik yöntemler çoktur: hemocytometer hücre sayma, coulter sayacı, veya pigment ekstrelerinin floresan. Zor maddeler için biyokütle nicelemesi için en uygun yöntem etüt edilmelidir. Metal oksit nano tanecikleri için, pigment ekstrelerinin floresan hemocytometer veya coulter sayaç21ile yosun sayma aglomeraların girişim nedeniyle en iyi performans bulunmuştur. Buna karşılık Farkas ve Booth22, biyokütlenin floresan ile ölçülmesinin, pigmentlerin nanomalzemelere otofloresanve emilmesi nedeniyle karbon bazlı nanomalzemelerin ekotoksisite testi için uygun bir yöntem olmadığını buldular. Renkli maddeler için, aynı zamanda floresan emisyon sinyali ile renk girişim olabilir, böylece ek kontroller veya seyreltme bu girişim ihmal edilebilir bir seviyeye gerektiren.
Zor maddelerin sutoksisitesi testi için kılavuz belgede2, renkli malzemelerin test edilmesi için önerilerden biri ışık yoğunluğunu artırmaktır. Benzer şekilde, nanomalzemeler23,,24test ederken gölgeleme sorunları atlatmak için artan ışık yoğunluğu söz edilmiştir. Ancak, bu tür değişiklikler genellikle artan sıcaklıklar ile ilişkilidir, bu nedenle, ek soğutma veya numunelerin havalandırma gerektiren. LEVITATT kurulumunda, bu geleneksel ampuller veya floresan tüpler ile karşılaştırıldığında çok az ısı üreten LED ışık kullanılarak çözülür. Ayrıca, yeterince yüksek ışık yoğunluğu çıkışı ve bir dimmer kurulumu ile bir LED seçimi testler arasında genel kurulum değiştirmeden renkli maddeler veya nanomalzemeler ve düzenli kimyasallar test etmek için ışık yoğunluğunu artırmak için izin verir. Ayrıca, ışık kaynağının numunelerin altına ve ayrı kasalara yerleştirilmesi tutarlı ve homojen bir ışık alanı sağlar.
Sonuç olarak, LEVITATT uluslararası standart kurallara uygun düzenli kimyasalların alg toksisite testi için kompakt bir platform sağlar. Ayrıca, kurulum alg, örneğin nanomalzemeler doğru ışık geçişi engel zor maddelerin test etmek için sağlam bir platform sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu araştırma PATROLS tarafından finanse edilmiştir - Gelişmiş Araçlar NanoSafety Test için, Grant anlaşması 760813 Horizon 2020 araştırma ve yenilik programı altında.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Sigma-Aldrich | V179124 | |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | 254134 | |
| BlueCap bottles (1L) | Buch & Holm A/S | 9072335 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B0394 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | 208290 | |
| Clear acrylic sheet (40x40 cm) | |||
| Cobalt(II) chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 255599 | |
| Copper(II) chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | 307483 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Fluorescence Spectrophotometer F-7000 | Hitachi | ||
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| Iron(III) chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 236489 | |
| LED light source | Helmholt Elektronik A/S | H35161 | Neutral White, 6500K |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Manganese(II) chloride tetrahydrate | Sigma-Aldrich | 221279 | |
| Orbital shaker | IKA | 2980200 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Raphidocelis subcapitata | NORCCA | NIVA-CHL1 strain | |
| Scintillation vials (20 mL) | Fisherscientific | 11526325 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 415413 | |
| Sodium molybdate dihydrate | Sigma-Aldrich | 331058 | |
| Spring clamp | Frederiksen Scientific A/S | 472002 | |
| Thermostatic cabinet | VWR | WTWA208450 | Alternative: temperature controlled room |
| Ventilation pipe (Ø125 mm) | Silvan | 22605630165 | |
| Volumetric flasks (25 mL) | DWK Life Sciences | 246781455 | |
| Zinc chloride | Sigma-Aldrich | 208086 |
References
- European Chemicals Agency. Guidance on Registration. European Chemicals Agency. , Helsinki, Finland. (2016).
- Organisation for Economic Cooperation and Development. Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. Organisation for Economic Cooperation and Development. , (2019).
- Blaise, C., Legault, R., Bermingham, N., Van Coillie, R., Vasseur, P. A simple microplate algal assay technique for aquatic toxicity assessment. Toxicity Assessment. 1 (3), 261-281 (1986).
- Hjorth, R., Sorensen, S. N., Olsson, M. E., Baun, A., Hartmann, N. B. A certain shade of green: can algal pigments reveal shading effects of nanoparticles. Integrated Environmental Assessment and Management. 12 (1), 200-202 (2016).
- Chen, F., et al. Algae response to engineered nanoparticles: current understanding{,} mechanisms and implications. Environmental Science: Nano. 6 (4), 1026-1042 (2019).
- Arensberg, P., Hemmingsen, V. H., Nyholm, N. A miniscale algal toxicity test. Chemosphere. 30 (11), 2103-2115 (1995).
- Organisation for Economic Cooperation and Development. Test No. 201: Freshwater Alga and Cyanobacteria, Growth Inhibition Test. Organisation for Economic Cooperation and Development. , (2011).
- International Organization for Standardization (ISO). Water Quality - Fresh Water Algal Growth Inhibition Test with Unicellular Green Algae. International Organization for Standardization (ISO). , (2012).
- Halling-Sørensen, B., Nyhohn, N., Baun, A. Algal toxicity tests with volatile and hazardous compounds in air-tight test flasks with CO2 enriched headspace. Chemosphere. 32 (8), 1513-1526 (1996).
- Mayer, P., Nyholm, N., Verbruggen, E. M. J., Hermens, J. L. M., Tolls, J. Algal growth inhibition test in filled, closed bottles for volatile and sorptive materials. Environmental Toxicology and Chemistry. 19 (10), 2551-2556 (2000).
- Ritz, C., Baty, F., Streibig, J. C., Gerhard, D. Dose-response analysis using R. PloS One. 10 (12), 0146021 (2015).
- Birch, H., Kramer, N. I., Mayer, P. Time-resolved freely dissolved concentrations of semivolatile and hydrophobic test chemicals in in vitro assays-measuring high losses and crossover by headspace solid-phase microextraction. Chemical Research in Toxicology. 32 (9), 1780-1790 (2019).
- Trac, L. N., Schmidt, S. N., Mayer, P. Headspace passive dosing of volatile hydrophobic chemicals - toxicity testing exactly at the saturation level. Chemosphere. 211, 694-700 (2018).
- Eisentraeger, A., Dott, W., Klein, J., Hahn, S. Comparative studies on algal toxicity testing using fluorometric microplate and Erlenmeyer flask growth-inhibition assays. Ecotoxicology and Environmental Safety. 54 (3), 346-354 (2003).
- Paixao, S. M., Silva, L., Fernandes, A., O'Rourke, K., Mendonca, E., Picado, A. Performance of a miniaturized algal bioassay in phytotoxicity screening. Ecotoxicology. 17 (3), 165-171 (2008).
- Thellen, C., Blaise, C., Roy, Y., Hickey, C. Round-robin testing with the selenastrum--capricornutum microplate toxicity assay. Hydrobiologia. 188, 259-268 (1989).
- Nagai, T., Taya, K., Annoh, H., Ishihara, S. Application of a fluorometric microplate algal toxicity assay for riverine periphytic algal species. Ecotoxicology and Environmental Safety. 94, 37-44 (2013).
- Lee, W. M., An, Y. J. Effects of zinc oxide and titanium dioxide nanoparticles on green algae under visible, UVA, and UVB irradiations: no evidence of enhanced algal toxicity under UV pre-irradiation. Chemosphere. 91 (4), 536-544 (2013).
- Samei, M., Sarrafzadeh, M. H., Faramarzi, M. A. The impact of morphology and size of zinc oxide nanoparticles on its toxicity to the freshwater microalga, Raphidocelis subcapitata. Environmental Science and Pollution Research. 26 (3), 2409-2420 (2019).
- Neale, P. A., Jaemting, A. K., O'Malley, E., Herrmann, J., Escher, B. I. Behaviour of titanium dioxide and zinc oxide nanoparticles in the presence of wastewater-derived organic matter and implications for algal toxicity. Environmental Science: Nano. 2 (1), 86-93 (2015).
- Hartmann, N. B., et al. The challenges of testing metal and metal oxide nanoparticles in algal bioassays: titanium dioxide and gold nanoparticles as case studies. Nanotoxicology. 7 (6), 1082-1094 (2013).
- Farkas, J., Booth, A. M. Are fluorescence-based chlorophyll quantification methods suitable for algae toxicity assessment of carbon nanomaterials. Nanotoxicology. 11 (4), 569-577 (2017).
- Handy, R. D., et al. Practical considerations for conducting ecotoxicity test methods with manufactured nanomaterials: what have we learnt so far. Ecotoxicology. 21 (4), 933-972 (2012).
- Handy, R. D., et al. Ecotoxicity test methods for engineered nanomaterials: practical experiences and recommendations from the bench. Environmental Toxicology and Chemistry. 31 (1), 15-31 (2012).
