Summary
We demonstreren algentoxiciteitstests voor moeilijke stoffen (bijvoorbeeld gekleurde stoffen of nanomaterialen) met behulp van een opstelling die verticaal met een LED wordt verlicht.
Abstract
Ecotoxiciteitsgegevens zijn een vereiste voor pre- en post-market registratie van chemische stoffen door Europese en internationale regelgeving (bijvoorbeeld REACH). De algentoxiciteitstest wordt vaak gebruikt bij de beoordeling van de regelgeving van chemische stoffen. Om een hoge betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid te bereiken is de ontwikkeling van gestandaardiseerde richtlijnen van vitaal belang. Voor algentoxiciteitstests vereisen de richtlijnen stabiele en uniforme omstandigheden van parameters zoals pH, temperatuur, kooldioxideniveaus en lichtintensiteit. Nanomaterialen en andere zogenaamde moeilijke stoffen kunnen het licht verstoren, waardoor een grote variatie in verkregen resultaten de acceptatie van de regelgeving belemmert. Om deze uitdagingen het hoofd te bieden, hebben we LEVITATT (LED Vertical Illumination Table for Algal Toxicity Tests) ontwikkeld. De setup maakt gebruik van LED-verlichting van onderen waardoor een homogene lichtverdeling en temperatuurregeling, terwijl ook het minimaliseren van intra-monster arcering. De opstelling optimaliseert het monstervolume voor biomassakwantificering en zorgt tegelijkertijd voor een voldoende instroom van CO2 om de exponentiële groei van de algen te ondersteunen. Bovendien kan het materiaal van de testcontainers worden aangepast om adsorptie en vervluchtiging te minimaliseren. Bij het testen van gekleurde stoffen of deeltjessuspensies, het gebruik van LED-verlichting maakt het ook mogelijk voor het verhogen van de lichtintensiteit zonder extra warmteopwekking. Het compacte ontwerp en de minimale apparatuurvereisten vergroten de mogelijkheden voor de implementatie van de LEVITATT in een breed scala aan laboratoria. Hoewel levitatt voldoet aan de gestandaardiseerde ISO- en OESO-richtlijnen voor algentoxiciteitstests, vertoonde het ook een lagere variabiliteit tussen de monsters voor twee referentiestoffen (3,5-Dicholorophenol en K2Cr2O7) en drie nanomaterialen (ZnO, CeO2en BaSO4) in vergelijking met Erlenmeyer-kolfjes en microtiterplaten.
Introduction
De algentoxiciteitstest is een van de slechts drie verplichte tests die worden gebruikt om de ecotoxiciteitsgegevens te genereren die nodig zijn voor de pre- en post-market registratie van chemische stoffen door Europese en internationale regelgeving (bijvoorbeeld REACH1 en TSCA (VS)). Hiervoor zijn gestandaardiseerde algentestrichtlijnen ontwikkeld door internationale organisaties (bijvoorbeeld ISO en OESO). Deze testnormen en richtlijnen schrijven ideale testomstandigheden voor in termen van pH, temperatuur, kooldioxideniveaus en lichtintensiteit. Het handhaven van stabiele testomstandigheden tijdens algentesten is in de praktijk echter moeilijk en de resultaten lijden aan problemen met reproduceerbaarheid en betrouwbaarheid voor een reeks chemische stoffen en nanomaterialen (vaak aangeduid als "moeilijke stoffen")2. De meeste van de bestaande algentoxiciteit testen setups werken met relatief grote volumes (100-250 mL) gelegen op een orbitale shaker in een incubator. Een dergelijke opstelling beperkt het aantal testconcentraties en repliceert haalbare en grote hoeveelheden algencultuur en testmateriaal. Bovendien hebben deze opstellingen zelden een uniform lichtveld en zijn de betrouwbare lichtomstandigheden bovendien moeilijk te verkrijgen in grote kolven, deels omdat de lichtintensiteit exponentieel afneemt naarmate het licht verder reist en deels door de kolfgeometrie. Alternatieve opstellingen omvatten kunststof microtiter3-platen met kleine monstervolumes die niet in staat zijn om voldoende bemonsteringsvolumes mogelijk te maken om pH, aanvullende biomassametingen, pigmentextractie of andere analyses die destructieve bemonstering vereisen, te meten. Een bijzondere uitdaging met behulp van bestaande opstellingen voor algentoxiciteit testen van nanomaterialen en stoffen die gekleurde suspensies vormen is de interferentie of het blokkeren van het licht beschikbaar voor de algencellen, vaak aangeduid als "arcering"4,5. Arcering kan optreden in flacons door het testmateriaal en/of interacties tussen het testmateriaal en de algencellen, of arcering kan optreden tussen flacons, vanwege hun positionering ten opzichte van elkaar en de lichtbron.
De methode is gebaseerd op de kleinschalige algentoxiciteitstest die Arensberg et al.6 heeft geïntroduceerd en die het mogelijk maakt om te testen in overeenstemming met normen zoals OESO 2017en ISO 86928. De methode is verder geoptimaliseerd om de hierboven genoemde beperkingen aan te pakken door: 1) gebruik te maken van de LED-lichttechnologie om uniforme lichtomstandigheden te garanderen met minimale warmteopwekking, 2) het verstrekken van voldoende monstervolume voor chemische / biologische analyse met behoud van constante pH, CO2 niveaus, en 3) waardoor het gebruik van veelzijdige testcontainer materiaal voor het testen van vluchtige stoffen of stoffen met een hoog sorptiepotentieel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beschrijving van de LEVITATT-instelling
- Gebruik 20 mL scintillatie glazen flacons(figuur 1, insert 1) waardoor licht penetratie. Als alternatief kunnen lichte penetrable plastic flacons worden gebruikt. Kwantificeer de lichtintensiteit met behulp van een fotometer.
- Gebruik aan het begin van de test ten minste een testsuspensie van 4 mL om de kwantificering van biomassa mogelijk te maken en voor de karakterisering/kwantificering van nanomaterialen tijdens en na incubatie(figuur 1, wisselplaat 2).
- Plaats de 20 mL scintillatiefluiden met een dop(figuur 1, insert 3) waar een klein gaatje wordt geboord (ongeveer 1 mm in diameter) om CO2-uitwisseling met de atmosfeer mogelijk te maken. Deze uitwisseling is cruciaal om een stabiele pH- en CO2-niveaus tijdens het testen te garanderen.
- Gebruik voor vluchtige stoffen een luchtdichte Teflon gecoate dop om CO2-verrijking van de hoofdruimte mogelijk te maken met behulp van een spuit9 of volledig gesloten kolven zonder gasfase waarin CO2 in oplossing wordt gehouden door een verrijkt natriumbicarbonaat (NaHCO3) buffersysteem10.
- Bevestig de flacons met klemmen gemonteerd op de buitenbehuizing(figuur 1, insert 4).
- Gebruik een LED-lichtbron onder de testflinzen(figuur 1, insert 5) met een uniforme fluorescerende verlichting van het type "koel-wit" of "daglicht" en een lichtintensiteit in het bereik van 60-120 μE∙m-2∙s-1 gemeten in het fotosynthetisch effectieve golflengtebereik van 400 nm tot 700 nm. De setup maakt gebruik van instelbare lichtintensiteit in het bereik van 5-160 μE∙m-2∙s-1 door een lichtdimdimer aan de bron te monteren. Dit maakt het mogelijk om te testen bij hogere en lagere lichtintensiteiten.
- Monteer de setup op een orbitale shaker om monsters te ageren gedurende de duur van de test. Dit houdt de cellen in vrije suspensie en vergemakkelijkt co2 massa overdracht van lucht naar water (Figuur 1, insert 6).
- Plaats de opstelling in een temperatuurgestuurde ruimte of een thermostatische kast om stabiele temperaturen te behouden tijdens het testen(figuur 1, insert 7).
Figuur 1: Afbeelding van LED Vertical Illumination Table for Algal Toxicity Tests (LEVITATT). 1) 20 mL glas scintillatie flacons voor incubatie, 2) 4 mL monster voor analyse, 3) deksel met geboord gat voor CO2 uitwisseling, 4) behuizing voor bepaalde lichtomstandigheden, 5) LED-lichtbron gelegen in het midden van de behuizing, 6) orbitale shaker voor agitatie tijdens het experiment, en 7) een thermostatische kast. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
2. Voorbereiding van algengroeimedium
- Het ISO 8692 algengroeimedium bestaat uit vier verschillende voorraadoplossingen. Weeg de juiste hoeveelheid zouten af en verdun in ultrazuiver water volgens tabel 1.
| Voorraadoplossingen | Nutriënten | Concentratie in voorraadoplossing | Concentratie in testoplossing |
| 1: Macronutriënten | NH4Cl | 1,5 g/L | 15 mg/L (N: 3,9 mg/L) |
| MgCl2∙6H2O | 1,2 g/L | 12 mg/L (Mg: 2,9 mg/L) | |
| CaCl2∙2H2O | 1,8 g/L | 18 mg/L (Ca: 4,9 mg/L) | |
| MgSO4∙7H2O | 1,5 g/L | 15 mg/L (S: 1,95 mg/L) | |
| KH2PO4 | 0,16 g/L | 1,6 mg/L (P: 0,36 mg/L) | |
| 2: Fe-EDTA | FeCl3∙6H2O | 64 mg/L | 64 μg/L (Fe: 13 μg/L) |
| Na2EDTA∙2H2O | 100 mg/L | 100 μg/L | |
| 3: Trace elementen | H3BO3a | 185 mg/L | 185 μg/L (B: 32 μg/L) |
| MnCl2∙4H2O | 415 mg/L | 415 μg/L (Mn: 115 μg/L) | |
| ZnCl2 | 3 mg/L | 3 μg/L (Zn: 1,4 μg/L) | |
| CoCl2∙6H2O | 1,5 mg/L | 1,5 μg/L (Co: 0,37 μg/L) | |
| CuCl2∙2H2O | 0,01 mg/L | 0,01 μg/L (Cu: 3,7 ng/L) | |
| Na2MoO4∙2H2O | 7 mg/L | 7 μg/L (Mo: 2,8 μg/L) | |
| 4: NaHCO3 | NaHCO3 | 50 g/L | 50 mg/L (C: 7,14 mg/L) |
Tabel 1: Concentraties van voedingsstoffen in voorraadoplossingen voor algengroeimedium
LET OP: H3BO3 kan worden opgelost door 0,1 M NaOH toe te voegen. EDTA moet worden verwijderd bij het testen van metalen, om te voorkomen dat complexatie met metalen ionen. Steriliseer de voorraadoplossingen door membraanfiltratie (gemiddelde poriediameter 0,2 μm) of door autoclaving (120 °C, 15 min). Doe geen autoclave voorraad oplossingen 2 en 4, maar steriliseren ze door membraanfiltratie. Bewaar de oplossingen in het donker op 4 °C.
- Voor de productie van 1 L algengroeimedium, breng 500 mL gesteriliseerd ultrazuiver water in een 1 L gesteriliseerde volumetric kolf en voeg 10 mL voorraadoplossing 1: Macronutriënten, 1 mL voorraadoplossing 2: Fe-EDTA, 1 mL voorraadoplossing 3: Trace elementen en 1 mL voorraadoplossing 4: NaHCO3.
- Vul tot 1 L met gesteriliseerd ultrazuiver water, stop de kolf en schud grondig om het algengroeimedium te homogeniseren.
- Equilibrate de oplossing voor gebruik door het 's nachts in contact te laten met lucht of door te borrelen met steriele, gefilterde lucht gedurende 30 minuten. Pas na evenwicht de pH indien nodig aan op pH 8,1 ± 0,2, met 1 M HCl of 1 M NaOH.
3. Instelling van de algentest
OPMERKING: In figuur 2wordt een stroomdiagram van de algentestprocedure weergegeven.
Figuur 2: Stroomdiagram van de algentestopstelling. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
- Bereid een voorraadoplossing van de teststof voor bij de gewenste hoogste testconcentratie in het algengroeimedium dat volgens stap 2 is bereid. Voor de voorbereiding van voorraadoplossingen/-schorsingen volgt u OESO 201 (voor oplosbare verbindingen) of OESO 318 (voor nanomaterialen).
- Meet de pH in de voorraadoplossing. Als het meer dan één eenheid afwijkt van het algengroeimedium, past u de pH aan op 8 met 1 M HCl of 1 M NaOH.
- Bereken het entmateriaalvolume dat nodig is om een uiteindelijke celconcentratie van 1 x 104 cellen/mL te bereiken in een testoplossing van 25 mL.
OPMERKING: Het entmateriaal moet afkomstig zijn van een cultuur van niet-verontreinigde exponentieel groeiende Raphidocelis subcapitata geteeld met behulp van de LEVITATT setup. - Bereken de hoeveelheid voorraadoplossing om aan elke 25 mL volumetrische kolf toe te voegen om de gewenste testconcentraties te verkrijgen. De factor tussen elke concentratie mag niet meer bedragen dan 3,2.
- Markeer één volumekolf van 25 mL voor elke gekozen concentratie en een extra 25 mL volumetricmkolf gemarkeerde regeling.
- Voeg de hoeveelheid voorraadoplossing van de testverbinding toe die nodig is om de gewenste concentraties te bereiken aan de 25 mL volumetrische kolf. Voeg geen voorraadoplossing toe aan het besturingselement.
- Voeg het medium toe aan elke 25 mL volumetrische kolf om een volume van ongeveer 20 mL te bereiken.
- Voeg het volume van het entmateriaal berekend in stap 3.3 toe aan elke 25 mL volumetrice kolf. Voeg het medium toe aan elke volumekolf van 25 mL tot een uiteindelijk totaal volume van 25 mL.
- Stop de kolven en meng grondig door de kolven twee keer verticaal te draaien.
- Breng 0,4 mL van elke kolf over in afzonderlijke schroefdopflesjes en voeg 1,6 mL aceton toe (verzadigd met MgCO3):één monster voor elke testconcentratie en de controle. Sluit de deksels goed en bewaar in het donker bij kamertemperatuur tot fluorescentiemetingen (sectie 4).
- Pipet 4 mL van elke testoplossing in 20 mL scintillatie flacons (3 repliceert per concentratie en 5 replica's voor de controle). Schroefdeksels op de scintillatie flesjes. Vergeet niet dat de deksels een geboord gat (ongeveer 1 mm in diameter) moeten hebben om CO2-uitwisseling mogelijk te maken.
- Na 24 uur, 48 uur en 72 uur, pipet 0,4 mL van elke flacon in schroefdop flacons en voeg 1,6 mL aceton (verzadigd met MgCO3). Sluit de deksels goed en bewaar in het donker bij kamertemperatuur tot fluorescentiemetingen (sectie 4).
- Nadat het laatste monster is genomen om 72 uur, veromzelt u voorzichtig de drie replica's voor een bepaalde concentratie in één flacon en meet de pH. Herhaal dit voor alle concentraties en de controle. De pH mag voor geen van de gemeten monsters meer dan 1,5 eenheden afwijken van de initiële pH.
- Lozing de resterende vloeistoffen in een afvalcontainer volgens uw institutionele regels en voorschriften.
4. Analyse van algentestmonsters
- Gebruik een fluorescentiespectrometer om de algenbiomassa te meten (hier uitgedrukt als chlorofyl A). De piekemissie voor chlorofyl A is 420 nm voor de excitatiegolflengte en 671 nm voor de emissiegolflengte.
- Meet de fluorescentie van elk afzonderlijk monster drie keer en bereken de gemiddelde waarde voor elk monster.
- Gebruik vergelijking 1 om het groeipercentage te berekenen. De gemeten fluorescentie (relatieve eenheden) kan direct worden gebruikt als de biomassaparameter in vergelijking 1.
Vergelijking 1: μ = (in Nt – ln N0) / t
waar μ het groeipercentage is (d-1), is N0 de eerste biomassa, Nt is de biomassa op het moment t, en t is de lengte van de testperiode (d). Let op, N0 en Nt moeten in dezelfde eenheid worden uitgedrukt. - Gebruik een statistische software om een niet-lineaire regressiecurve (bijvoorbeeld een log-logistic of Weibull-functie) aan te passen aan de groeisnelheidsgegevens om effectieve concentratiewaarden te verkrijgen bij 10%, 20% en 50% remming. In de aanvullende informatie wordt een voorbeeld gegeven van code voor het passen in de statistische software R met behulp van het DRC-pakket11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Er wordt een eerste test met een referentiestof uitgevoerd om de gevoeligheid van de algenstam te bepalen. Referentiestoffen die regelmatig voor R. subcapitata worden gebruikt, zijn kaliumdichromaat en 3,5-Dichloodfenol7,8. Figuur 3 en tabel 2 laten een representatief resultaat zien van een algentest, met inbegrip van curvefitting en statistische output wanneer het DRC-pakket in R wordt toegepast op de groeipercentages.
Figuur 3: Representatieve concentratieresponscurve voor 72 uur blootstelling van een chemische verbinding aan algen (R. subcapitata). De vaste lijn vertegenwoordigt de log-logistieke pasvorm en het schaduwrijke gebied is het 95% betrouwbaarheidsinterval voor de pasvorm. De open cirkels vertegenwoordigen het berekende groeipercentage voor elke replica. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| EC10 | EC20 | EC50 | |
| [mg/L] | [mg/L] | [mg/L] | |
| Chemische verbinding | 4.6 [1.8-7.5] | 7.4 [4.1-11] | 16.9 [11-22] |
Tabel 2: Representatieve effectieve concentraties voor 10%, 20% en 50% remming van de groei voor een chemische verbinding met behulp van algen (R. subcapitata). De waarde tussen haakjes vertegenwoordigt het betrouwbaarheidsinterval van 95% van een log-logistieke fitting.
Een succesvolle test zal groeipercentages van meer dan 0,9 d-1 hebben om te voldoen aan de OESO-richtlijn en 1,5 d-1 om te voldoen aan de ISO 8692-richtlijn en moet ten minste één concentratie tussen 0% en 100% remming bevatten. Lage groeipercentages kunnen optreden als gevolg van verschillende problemen zoals bacteriële besmetting of entmateriaal niet in de exponentiële groeifase aan het begin van de test. Microscopisch onderzoek van de repliceert mag alleen een uniforme sikkelvormige groene algen(R. subcapitata)vertonen met afmetingen van ongeveer 2 μm breedte en 8 μm lengte. Als een enkele replica is verontreinigd, kan deze worden weggelaten en kan de analyse worden uitgevoerd zonder deze gegevens. Echter, als meerdere replicaties zijn besmet, herhaal het experiment met niet-verontreinigde exponentieel groeiende entmateriaal. Om te evalueren of het entmateriaal zich in de exponentiële groeifase aan het begin van de test bevond, berekent u de groeisnelheid van de controle met intervallen van 24 uur en gebruikt u alleen het tijdsinterval waarbij de algengroei van de controle exponentieel is voor statistische analyse.
Om de robuustheid van de opstelling te testen, werd drie maal een toxiciteitstest met twee referentiestoffen (K2Cr2O7 en 3,5-Dichloorofenol) en drie nanomaterialen herhaald (3,5-Dichloorofenol, BaSO4 nanodeeltjes (NM-220) en ZnO nanodeeltjes (NM-111)) en vier keer (K2Cr2O7 en CeO2 nanodeeltjes (NM-212)). De resultaten toonden een variatiecoëfficiënt van deEG-waarden van 50%, tussen 11% en 39%, waarbij de laagste variatiecoëfficiënt voor ZnO-nanodeeltjes (NM-111) en de hoogste variatiecoëfficiënt voor CeO2 nanodeeltjes (NM-212)(tabel 3).
| Samengestelde | # van experimenten | Inter-steekproef coëfficiënt van variatie voor groeipercentage % |
EC50 (gemiddeld) mg/L |
Variatiecoëfficiënt voor EC50-waarden % |
| K2Cr2O7 | 4 | 4.5 | 0.73 | 13 |
| 3,5-Dichlorofenol | 3 | 3.4 | 1.9 | 21 |
| BaSO4 NP (NM-220) | 3 | 5.6 | 22 | 20 |
| Ceo2 NP (NM-212) | 4 | 4.3 | 13 | 39 |
| ZnO NP (NM-111) | 3 | 3.4 | 0.13 | 11 |
Tabel 3: Resultaten van een interne laboratoriumtoxiciteitstest met R. subcapitata die gedurende 72 uur is blootgesteld aan twee referentiestoffen en drie nanomaterialen uit de GCO-opslagplaats
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fytoplankton zet zonne-energie en kooldioxide om in organisch materiaal en speelt daarmee een centrale rol in het aquatische ecosysteem. Om deze reden worden algengroeiremmingstests opgenomen als een van de drie verplichte aquatische toxiciteitstests die nodig zijn voor de wettelijke risicobeoordeling van chemische stoffen. De mogelijkheid om een betrouwbare en reproduceerbare algentoxiciteitstest uit te voeren is in dit verband essentieel. Testopstellingen met Erlenmeyer-kolven introduceert een reeks variabiliteiten en ongemakken zoals beschreven in de inleiding. Om dit probleem te omzeilen, microtiter platen zijn voorgesteld3. Hoewel de microtiterplaten het volume en de ruimte minimaliseren die nodig zijn voor het testen, zijn er in de literatuur bezorgdheid gerezen over de naleving van dergelijke opstellingen met de testgeldigheidscriteria van de testrichtlijnen6. Zo werd onlangs significant verlies van semi-chemische chemicaliën en cross-over naar andere putten in microtiterplaten bij 37 °C in cellulaire groeimedia (DMEM GluteMAX, Opti-MEM en Hams F12 GlutaMAX) onlangs aangetoond door Birch et al.12. Het testen van vluchtige stoffen kan met succes worden uitgevoerd met de LEVITATT-opstelling met behulp van 1) gesloten flacons met CO2 verrijkte hoofdruimte9, 2) die de vluchtige stof rechtstreeks door de hoofdruimte13 of in een gevulde test flacon10doseert . Wat de ruimtevereisten betreft, biedt LEVITATT een testopstelling die de kloof tussen microtiterplaten en Erlenmeyer-kolfopstellingen opvult en toch voordelen biedt van beide opstellingen, bijvoorbeeld het behoud van een beknopte en compacte testomgeving en voldoende testvolume voor destructieve bemonstering (bijvoorbeeld voor karakterisering van nanomaterialen tijdens de test).
De inter-sample variabiliteit voor het LEVITATT-testsysteem varieerde van 3,4% (3,5-Dichlorophenol en ZnO NP) tot 5,6% (BaSO4 NP). Dit valt binnen de eis van variatiecoëfficiënt van de gemiddelde groei in replicerende controleculturen van 15% aangegeven in OESO 201-richtlijn7 (voor de LEVITATT-inter-sample variabiliteit werden ook alle blootstellingen opgenomen).
De reproduceerbaarheid met betrekking tot de EG50-waardenvan de testopstelling voor de referentiestoffen vertoonde een variantiecoëfficiënt van 13% voor K2Cr2O7 (n = 4) en 21% voor 3,5-Dichloorofenol (n = 3). Dit is vergelijkbaar met tests die zijn uitgevoerd met conventionele 250 mL Erlenmeyer-kolassays voor de referentiestof K2Cr2O7 met 16,8%14 en 25,4%15 variatiecoëfficiënt voorEG-waarden. Microtiterplaten hebben een lagere variatiecoëfficiënt vertoond voor sommige referentiestoffen (bijvoorbeeld K2Cr2O7 (9%14,15), terwijl hogere variatiecoëfficiënten zijn waargenomen voor fenol (34,9%16) en Dichlooroofenol (38%17). Er is beperkte informatie beschikbaar met betrekking tot de reproduceerbaarheid van studies met nanomaterialen. Vergelijking van de variatiecoëfficiënt tussen de steekproefsgeving voor ZnO-nps met behulp van het LEVITATT-systeem (3,4%) met microtiterplaten (67%18)of Erlenmeyer-kolven (13%19 en 35%20)heeft het minder variatie. Om de robuustheid van het LEVITATT-systeem verder te testen, is een round-robin-studie gestart van twee testmaterialen (één referentiestof en één moeilijk te testen stof).
Het handhaven van een niet-verontreinigde algencultuur kan moeilijk zijn als het niet in steriele omstandigheden wordt behandeld. Exponentiële algengroei is een belangrijke voorwaarde voor het uitvoeren van richtlijn algen testen. Het meten van de groei op meerdere tijdstippen (bijvoorbeeld 24 uur, 48 uur, 72 uur) kan bepalen of er gedurende de testperiode exponentiële groei plaatsvindt. Schommelingen in temperatuur en pH kunnen de algengroei beïnvloeden; Deze parameters moeten dus gedurende de gehele testperiode stabiel zijn. In kleine hoeveelheden van het testmonster treden schommelingen in temperatuur en pH sneller op in vergelijking met grotere volumes en de praktische problemen van het meten van deze parameters worden steeds moeilijker bij een afnemend testvolume. Parameters zoals pH en temperatuur met een testvolume van 4 mL waren gedurende een testperiode van 72 uur in de LEVITATT stabiel, zowel in een temperatuurgecontroleerde ruimte bij 20 °C ± 2 °C als in een couveuse onder vergelijkbare omstandigheden.
Analytische methoden voor kwantificering van algengroei zijn legbaar: celtelling in een hemocytometer, coulterteller of fluorescentie van pigmentextracten. Voor moeilijke stoffen moeten overwegingen worden gemaakt met betrekking tot de meest geschikte methode voor biomassakwantificering. Voor metaaloxide nanodeeltjes, fluorescentie van pigment extracten is gebleken dat het beste presteren als gevolg van interferentie van agglomeraten bij het tellen van algen door hemocytometer of coulter teller21. Farkas en Booth22 vonden daarentegen dat kwantificering van biomassa door fluorescentie geen geschikte methode was voor ecotoxiciteitstests van op koolstof gebaseerde nanomaterialen als gevolg van autofluorescentie en absorptie van pigmenten op de nanomaterialen. Voor gekleurde stoffen kan er ook interferentie van de kleur met de fluorescentie emissiesignaal, dus, die extra controles of verdunning tot een niveau waar deze interferentie te verwaarlozen is.
In het richtsnoer voor het testen van zware stoffen2in het aquatisch toxiciteitsonderzoek , is een van de aanbevelingen voor het testen van gekleurde materialen het verhogen van de lichtintensiteit. Ook is melding gemaakt van een verhoogde lichtintensiteit om arceringsproblemen te omzeilen bij het testen van nanomaterialen23,24. Dergelijke wijzigingen worden echter vaak geassocieerd met verhoogde temperaturen, waardoor extra koeling of ventilatie van de monsters nodig is. In de LEVITATT setup wordt dit opgelost met LED-licht dat weinig warmte produceert in vergelijking met conventionele gloeilampen of tl-buizen. Bovendien, het kiezen van een LED met een voldoende hoge lichtintensiteit output en de installatie van een dimmer zorgen voor het verhogen van de lichtintensiteit om gekleurde stoffen of nanomaterialen en reguliere chemicaliën te testen zonder wijziging van de algehele setup tussen de tests. Bovendien zorgt de plaatsing van de lichtbron onder de monsters en in afzonderlijke darmen voor een consistent en homogeen lichtveld.
Tot slot biedt de LEVITATT een compact platform voor algentoxiciteitstesten van reguliere chemicaliën die voldoen aan internationale gestandaardiseerde richtlijnen. Bovendien biedt de opstelling een robuust platform voor het testen van moeilijke stoffen die de doorgang van licht naar de algen verstoren, bijvoorbeeld nanomaterialen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd gefinancierd door PATROLS – Advanced Tools for NanoSafety Testing, Grant agreement 760813 in het kader van horizon 2020 onderzoeks- en innovatieprogramma.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Sigma-Aldrich | V179124 | |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | 254134 | |
| BlueCap bottles (1L) | Buch & Holm A/S | 9072335 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B0394 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | 208290 | |
| Clear acrylic sheet (40x40 cm) | |||
| Cobalt(II) chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 255599 | |
| Copper(II) chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | 307483 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Fluorescence Spectrophotometer F-7000 | Hitachi | ||
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| Iron(III) chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 236489 | |
| LED light source | Helmholt Elektronik A/S | H35161 | Neutral White, 6500K |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Manganese(II) chloride tetrahydrate | Sigma-Aldrich | 221279 | |
| Orbital shaker | IKA | 2980200 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Raphidocelis subcapitata | NORCCA | NIVA-CHL1 strain | |
| Scintillation vials (20 mL) | Fisherscientific | 11526325 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 415413 | |
| Sodium molybdate dihydrate | Sigma-Aldrich | 331058 | |
| Spring clamp | Frederiksen Scientific A/S | 472002 | |
| Thermostatic cabinet | VWR | WTWA208450 | Alternative: temperature controlled room |
| Ventilation pipe (Ø125 mm) | Silvan | 22605630165 | |
| Volumetric flasks (25 mL) | DWK Life Sciences | 246781455 | |
| Zinc chloride | Sigma-Aldrich | 208086 |
References
- European Chemicals Agency. Guidance on Registration. European Chemicals Agency. , Helsinki, Finland. (2016).
- Organisation for Economic Cooperation and Development. Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. Organisation for Economic Cooperation and Development. , (2019).
- Blaise, C., Legault, R., Bermingham, N., Van Coillie, R., Vasseur, P. A simple microplate algal assay technique for aquatic toxicity assessment. Toxicity Assessment. 1 (3), 261-281 (1986).
- Hjorth, R., Sorensen, S. N., Olsson, M. E., Baun, A., Hartmann, N. B. A certain shade of green: can algal pigments reveal shading effects of nanoparticles. Integrated Environmental Assessment and Management. 12 (1), 200-202 (2016).
- Chen, F., et al. Algae response to engineered nanoparticles: current understanding{,} mechanisms and implications. Environmental Science: Nano. 6 (4), 1026-1042 (2019).
- Arensberg, P., Hemmingsen, V. H., Nyholm, N. A miniscale algal toxicity test. Chemosphere. 30 (11), 2103-2115 (1995).
- Organisation for Economic Cooperation and Development. Test No. 201: Freshwater Alga and Cyanobacteria, Growth Inhibition Test. Organisation for Economic Cooperation and Development. , (2011).
- International Organization for Standardization (ISO). Water Quality - Fresh Water Algal Growth Inhibition Test with Unicellular Green Algae. International Organization for Standardization (ISO). , (2012).
- Halling-Sørensen, B., Nyhohn, N., Baun, A. Algal toxicity tests with volatile and hazardous compounds in air-tight test flasks with CO2 enriched headspace. Chemosphere. 32 (8), 1513-1526 (1996).
- Mayer, P., Nyholm, N., Verbruggen, E. M. J., Hermens, J. L. M., Tolls, J. Algal growth inhibition test in filled, closed bottles for volatile and sorptive materials. Environmental Toxicology and Chemistry. 19 (10), 2551-2556 (2000).
- Ritz, C., Baty, F., Streibig, J. C., Gerhard, D. Dose-response analysis using R. PloS One. 10 (12), 0146021 (2015).
- Birch, H., Kramer, N. I., Mayer, P. Time-resolved freely dissolved concentrations of semivolatile and hydrophobic test chemicals in in vitro assays-measuring high losses and crossover by headspace solid-phase microextraction. Chemical Research in Toxicology. 32 (9), 1780-1790 (2019).
- Trac, L. N., Schmidt, S. N., Mayer, P. Headspace passive dosing of volatile hydrophobic chemicals - toxicity testing exactly at the saturation level. Chemosphere. 211, 694-700 (2018).
- Eisentraeger, A., Dott, W., Klein, J., Hahn, S. Comparative studies on algal toxicity testing using fluorometric microplate and Erlenmeyer flask growth-inhibition assays. Ecotoxicology and Environmental Safety. 54 (3), 346-354 (2003).
- Paixao, S. M., Silva, L., Fernandes, A., O'Rourke, K., Mendonca, E., Picado, A. Performance of a miniaturized algal bioassay in phytotoxicity screening. Ecotoxicology. 17 (3), 165-171 (2008).
- Thellen, C., Blaise, C., Roy, Y., Hickey, C. Round-robin testing with the selenastrum--capricornutum microplate toxicity assay. Hydrobiologia. 188, 259-268 (1989).
- Nagai, T., Taya, K., Annoh, H., Ishihara, S. Application of a fluorometric microplate algal toxicity assay for riverine periphytic algal species. Ecotoxicology and Environmental Safety. 94, 37-44 (2013).
- Lee, W. M., An, Y. J. Effects of zinc oxide and titanium dioxide nanoparticles on green algae under visible, UVA, and UVB irradiations: no evidence of enhanced algal toxicity under UV pre-irradiation. Chemosphere. 91 (4), 536-544 (2013).
- Samei, M., Sarrafzadeh, M. H., Faramarzi, M. A. The impact of morphology and size of zinc oxide nanoparticles on its toxicity to the freshwater microalga, Raphidocelis subcapitata. Environmental Science and Pollution Research. 26 (3), 2409-2420 (2019).
- Neale, P. A., Jaemting, A. K., O'Malley, E., Herrmann, J., Escher, B. I. Behaviour of titanium dioxide and zinc oxide nanoparticles in the presence of wastewater-derived organic matter and implications for algal toxicity. Environmental Science: Nano. 2 (1), 86-93 (2015).
- Hartmann, N. B., et al. The challenges of testing metal and metal oxide nanoparticles in algal bioassays: titanium dioxide and gold nanoparticles as case studies. Nanotoxicology. 7 (6), 1082-1094 (2013).
- Farkas, J., Booth, A. M. Are fluorescence-based chlorophyll quantification methods suitable for algae toxicity assessment of carbon nanomaterials. Nanotoxicology. 11 (4), 569-577 (2017).
- Handy, R. D., et al. Practical considerations for conducting ecotoxicity test methods with manufactured nanomaterials: what have we learnt so far. Ecotoxicology. 21 (4), 933-972 (2012).
- Handy, R. D., et al. Ecotoxicity test methods for engineered nanomaterials: practical experiences and recommendations from the bench. Environmental Toxicology and Chemistry. 31 (1), 15-31 (2012).
