Summary
Vi demonstrerer algetoksisitetstesting for vanskelige stoffer (f.eks. fargede stoffer eller nanomaterialer) ved hjelp av et oppsett opplyst vertikalt med en LED.
Abstract
Økotoksisitetsdata er et krav for registrering av kjemikalier før og etter markedet etter europeiske og internasjonale forskrifter (f.eks. REACH). Algetoksisitetstesten brukes ofte i regulatorisk risikovurdering av kjemikalier. For å oppnå høy pålitelighet og reproduserbarhet er utviklingen av standardiserte retningslinjer avgjørende. For algetoksisitetstesting krever retningslinjene stabile og ensartede forhold for parametere som pH, temperatur, karbondioksidnivåer og lysintensitet. Nanomaterialer og andre såkalte vanskelige stoffer kan forstyrre lys som forårsaker en stor variasjon i oppnådde resultater som hindrer deres regulatoriske aksept. For å løse disse utfordringene har vi utviklet LEVITATT (LED Vertical Illumination Table for Algal Toxicity Tests). Oppsettet benytter LED-belysning nedenfra, noe som gir en homogen lysfordeling og temperaturkontroll samtidig som den minimerer skyggelegging av intraprøve. Oppsettet optimaliserer prøvevolumet for biomassekvantifisering og sikrer samtidig en tilstrekkelig tilstrømning av CO2 for å støtte eksponentiell vekst av alger. I tillegg kan materialet i testbeholderne skreddersys for å minimere adsorpsjon og volatilisering. Ved testing av fargede stoffer eller partikkelsuspensjoner gjør bruk av LED-lys også det mulig å øke lysintensiteten uten ytterligere varmegenerering. De kompakte design- og minimale utstyrskravene øker mulighetene for implementering av LEVITATT i et bredt spekter av laboratorier. Selv om levitatt var i samsvar med standardiserte ISO- og OECD-retningslinjer for algetoksisitetstesting, viste LEVITATT også en lavere inter-sample variabilitet for to referansestoffer (3,5-Dicholorophenol og K2Cr2O7) og tre nanomaterialer (ZnO, CeO2og BaSO 4 )sammenlignetmed Erlenmeyer flasks og mikrotiterplater.
Introduction
Algetoksisitetstesten er en av bare tre obligatoriske tester som brukes til å generere økotoksisitetsdataene som kreves for registrering av kjemikalier før og etter markedet etter europeiske og internasjonale forskrifter (f.eks. REACH1 og TSCA (USA)). For dette formålet er standardiserte retningslinjer for algetest utviklet av internasjonale organisasjoner (f.eks. ISO og OECD). Disse teststandardene og retningslinjene foreskriver ideelle testforhold når det gjelder pH, temperatur, karbondioksidnivåer og lysintensitet. Det er imidlertid vanskelig å opprettholde stabile testforhold under algetesting, og resultatene lider av problemer med reproduserbarhet og pålitelighet for en rekke kjemiske stoffer og nanomaterialer (ofte referert til som "vanskelige stoffer")2. De fleste av de eksisterende algetoksisitetstestoppsettene opererer med relativt store volumer (100–250 ml) som ligger på en orbital shaker inne i en inkubator. Et slikt oppsett begrenser antall testkonsentrasjoner og replikerer oppnåelige og høye mengder algekultur og testmateriale. I tillegg har disse oppsettene sjelden et jevnt lysfelt, og pålitelige lysforhold er også vanskelige å oppnå i store flasker, delvis ettersom lysintensiteten reduseres eksponentielt jo lenger lyset beveger seg og delvis på grunn av kolbegeometrien. Alternative oppsett består av plastmikrotiter3-plater som inneholder små prøvevolumer som ikke tillater tilstrekkelige prøvetakingsvolumer for å måle pH, ytterligere biomassemålinger, pigmentekstraksjon eller andre analyser som krever destruktiv prøvetaking. En spesiell utfordring ved hjelp av eksisterende oppsett for algetoksisitetstesting av nanomaterialer og stoffer som danner fargede suspensjoner, er forstyrrelsen eller blokkeringen av lyset som er tilgjengelig for algecellene, ofte referert til som "skyggelegging"4,5. Skyggelegging kan forekomme i hetteglass av testmaterialet og/eller interaksjoner mellom testmaterialet og algecellene, eller skyggelegging kan forekomme mellom hetteglass, på grunn av deres posisjonering i forhold til hverandre og lyskilden.
Metoden er basert på det småskala algetoksisitetstestoppsettet introdusert av Arensberg et al.6 som gjør det mulig å teste i samsvar med standarder som OECD 2017og ISO 86928. Metoden er ytterligere optimalisert for å håndtere begrensningene nevnt ovenfor ved å: 1) ved hjelp av LED-lysteknologien for å sikre ensartede lysforhold med minimal varmegenerering, 2) som gir tilstrekkelig prøvevolum for kjemisk / biologisk analyse samtidig som konstant pH, CO2-nivåer og 3) muliggjør bruk av allsidig testbeholdermateriale for testing av flyktige stoffer eller stoffer med høyt sorpsjonspotensial.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beskrivelse av LEVITATT-oppsettet
- Bruk 20 ml hetteglass med scintillasjonsglass (figur 1, sett inn 1) slik at lystrengning. Alternativt kan lette brukbare plastkuler brukes. Kvantifisere lysintensiteten ved hjelp av et fotometer.
- Bruk minst en 4 ml testsuspensjon i begynnelsen av testen for å tillate kvantifisering av biomasse og for karakterisering/kvantifisering av nanomaterialer under og etter inkubasjon (figur 1, sett inn 2).
- Monter 20 ml scintillasjons hetteglass med en hette (figur 1, sett inn 3) der et lite hull bores (ca. 1 mm i diameter) for å tillate CO2-utveksling med atmosfæren. Denne utvekslingen er avgjørende for å sikre stabile pH- og CO2-nivåer under testing.
- For flyktige stoffer, bruk en lufttett Teflon-belagt hette for å tillate CO2-berikelse av hoderommet ved hjelp av en sprøyte 9 eller heltlukkede flasker uten gassfase der CO2 opprettholdes i oppløsning av et beriket natriumbikarbonat (NaHCO3) buffersystem10.
- Fest hetteglassene med klemmer montert på det utvendige huset ( figur1, sett inn 4).
- Bruk en LED-lyskilde plassert under testhettespillene (figur 1, innsats 5) som gir en jevn fluorescerende belysning av "kjølig-hvit" eller "dagslys" type og en lysintensitet i området 60-120 μE ∙ m-2∙ s-1 målt i fotosyntetically effektiv bølgelengdeområde på 400 nm til 700 nm. Oppsettet bruker justerbar lysintensitet i området 5–160 μE∙m-2∙s-1 ved å montere en lysdimmer til kilden. Dette gjør det mulig å teste ved høyere og lavere lysintensiteter.
- Monter oppsettet på en orbital shaker for å røre prøver gjennom hele testens varighet. Dette holder cellene i fri suspensjon og forenkler CO2 masseoverføring fra luft til vann (Figur 1, sett inn 6).
- Plasser oppsettet i et temperaturkontrollert rom eller et termostatskap for å opprettholde stabile temperaturer under testing (figur 1, sett inn 7).
Figur 1: Bilde av LED vertikal belysningstabell for algetoksisitetstester (LEVITATT). 1) 20 ml glass scintillation hetteglass for inkubasjon, 2) 4 ml prøve for analyse, 3) lokk med boret hull for CO2 utveksling, 4) casing for definerte lysforhold, 5) LED lyskilde plassert i midten av foringsrøret, 6) orbital shaker for agitasjon under forsøket, og 7) en termostatskap. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
2. Utarbeidelse av algevekst medium
- ISO 8692 algevekstmedium består av fire ulike aksjeløsninger. Vei ut riktig mengde salter og fortynn i ultrarent vann i henhold til tabell 1.
| Lagerløsninger | Næringsstoffer | Konsentrasjon i lagerløsning | Konsentrasjon i testløsning |
| 1: Makronæringsstoffer | Nh4 Cl Leilighet | 1.5 g/L | 15 mg/l (N: 3,9 mg/l) |
| MgCl2∙6H2O | 1.2 g/l | 12 mg/l (Mg: 2,9 mg/l) | |
| CaCl2∙2H2O | 1.8 g/l | 18 mg/l (Ca: 4,9 mg/l) | |
| MgSO4∙7H2O | 1.5 g/L | 15 mg/l (S: 1,95 mg/l) | |
| KH2PO4 | 0.16 g/L | 1,6 mg/l (P: 0,36 mg/l) | |
| 2: Fe-EDTA | FeCl3∙6H2O | 64 mg/l | 64 μg/l (f. 13 μg/l) |
| Na2EDTA∙2H2O | 100 mg/l | 100 μg/L | |
| 3: Spor elementer | H3BO3a | 185 mg/l | 185 μg/l (B: 32 μg/L) |
| MnCl2∙4H2O | 415 mg/l | 415 μg/l (Mn: 115 μg/L) | |
| ZnCl2 Leilighet | 3 mg/l | 3 μg/l (Zn: 1,4 μg/L) | |
| CoCl2∙6H2O | 1,5 mg/l | 1,5 μg/l (Co: 0,37 μg/L) | |
| CuCl2∙2H2O | 0,01 mg/l | 0,01 μg/l (Cu: 3,7 ng/L) | |
| Na2MoO4∙2H2O | 7 mg/l | 7 μg/l (Mo: 2,8 μg/L) | |
| 4: NaHCO3 | NaHCO3 | 50 g/l | 50 mg/l (C: 7,14 mg/l) |
Tabell 1: Konsentrasjoner av næringsstoffer i lagerløsninger for algevekstmedium
MERK: H3BO3 kan oppløses ved å legge til 0,1 M NaOH. EDTA bør fjernes ved testing av metaller, for å unngå hudfarge med metallioner. Steriliser lagerløsningene ved membranfiltrering (gjennomsnittlig por diameter 0,2 μm) eller ved autoklavering (120 °C, 15 min). Ikke gjør noen autoklav lager løsninger 2 og 4, men sterilisere dem ved membran filtrering. Oppbevar oppløsningene i mørket ved 4 °C.
- For å produsere 1 L algevekstmedium, overfør 500 ml sterilisert ultrapure vann til en 1 L sterilisert volumetrisk kolbe og tilsett 10 ml lagerløsning 1: Makronæringsstoffer, 1 ml lagerløsning 2: Fe-EDTA, 1 ml lagerløsning 3: Sporstoffer og 1 ml lagerløsning 4: NaHCO3.
- Fyll opp til 1 L med sterilisert ultrarent vann, stopp kolben og rist grundig for å homogenisere algevekstmediet.
- Likevekt oppløsningen før bruk ved å la den over natten være i kontakt med luft eller ved å boble med steril, filtrert luft i 30 min. Etter likevekt, juster om nødvendig pH til pH 8,1 ± 0,2, med enten 1 M HCl eller 1 M NaOH.
3. Sette opp algetesten
MERK: Et strømningsdiagram over algetestprosedyren vises i figur 2.
Figur 2: Strømningsdiagram for algetestoppsettet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
- Forbered en lagerløsning av testforbindelsen ved ønsket høyeste testkonsentrasjon i algevekstmediet tilberedt i henhold til trinn 2. For utarbeidelse av lagerløsninger/suspensjoner, følg OECD 201 (for løselige forbindelser) eller OECD 318 (for nanomaterialer).
- Mål pH-en i lagerløsningen. Hvis den avviker mer enn én enhet fra algevekstmediet, justerer du pH til 8 med enten 1 M HCl eller 1 M NaOH.
- Beregn inokulumvolumet som trengs for å nå en endelig cellekonsentrasjon på 1 x10 4 celler / ml i en 25 ml testløsning.
MERK: Inoculum bør komme fra en kultur av uforurenset eksponentielt voksende Raphidocelis subcapitata vokst ved hjelp av LEVITATT oppsettet. - Beregn mengden lagerløsning for å legge til hver 25 ml volumetriske kolbe for å oppnå de ønskede testkonsentrasjonene. Faktoren mellom hver konsentrasjon bør ikke overstige 3,2.
- Merk en 25 ml volumetrisk kolbe for hver valgte konsentrasjon og en ekstra 25 ml volumetrisk kolbe merket kontroll.
- Tilsett mengden lagerløsning av testforbindelsen som trengs for å nå de ønskede konsentrasjonene til den 25 ml volumetriske kolben. Ikke legg til lagerløsning i kontrollen.
- Tilsett mediet til hver 25 ml volumetriske kolbe for å nå et volum på ca. 20 ml.
- Tilsett volumet av inoculum beregnet i trinn 3.3 til hver 25 ml volumetrisk kolbe. Tilsett mediet til hver 25 ml volumetriske kolbe til et endelig totalt volum på 25 ml.
- Stopper kolben og bland godt ved å dreie kolben to ganger vertikalt.
- Overfør 0,4 ml fra hver kolbe til individuelle skrukorpette ampuller og tilsett 1,6 ml aceton (mettet med MgCO3):en prøve for hver testkonsentrasjon og kontrollen. Lukk lokkene tett og oppbevar i mørket ved romtemperatur til fluorescensmålinger (avsnitt 4).
- Pipet 4 ml av hver testløsning i 20 ml scintillasjons hetteglass (3 replikerer per konsentrasjon og 5 repliker for kontrollen). Skrulokk på scintillation hetteglassene. Husk at lokkene må ha et boret hull (ca. 1 mm i diameter) for å tillate CO2-utveksling.
- Etter 24 timer, 48 timer og 72 timer, pipet 0,4 ml fra hvert hetteglass til hetteglass med skrukork og tilsett 1,6 ml aceton (mettet med MgCO3). Lukk lokkene tett og oppbevar i mørket ved romtemperatur til fluorescensmålinger (avsnitt 4).
- Etter at den siste prøven er tatt ved 72 timer, forsiktig pool de tre replikerer for en gitt konsentrasjon i ett hetteglass og måle pH. Gjenta for alle konsentrasjoner og kontrollen. PH bør ikke avvike mer enn 1,5 enheter fra den første pH for noen av prøvene som måles.
- Tøm de resterende væskene i en avfallsbeholder etter institusjonelle regler og forskrifter.
4. Analysere algetestprøver
- Bruk et fluorescensspektrofotometer for å måle algebiomassen (her uttrykt som klorofyll A). Topputslippet for klorofyll A er 420 nm for eksitasjonsbølgelengden og 671 nm for utslippsbølgelengden.
- Mål fluorescensen til hvert enkelt utvalg tre ganger og beregn gjennomsnittsverdien for hvert utvalg.
- Bruk ligningen 1 til å beregne vekstraten. Den målte fluorescensen (relative enheter) kan brukes direkte som biomasseparameter i ligning 1.
Ligning 1: μ = (i Nt – ln N0) / t
der μ er vekstraten (d-1), N0 er den første biomassen, Nt er biomassen til rett tid t, og t er lengden på testperioden (d). Merk, N0 og N t skal uttrykkes i samme enhet. - Bruk en statistisk programvare til å tilpasse en ikke-lineær regresjonskurve (f.eks. en loglogistikk- eller Weibull-funksjon) til veksthastighetsdataene for å oppnå effektive konsentrasjonsverdier med 10 %, 20 % og 50 % hemming. I tilleggsinformasjonen er et eksempel på kode for montering i den statistiske programvaren R ved hjelp av DRC-pakken11 gitt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En innledende test med referansestoff utføres for å bestemme følsomheten til algestammen. Referansestoffer som regelmessig brukes til R. subcapitata er kaliumdiktromat og 3,5-Dichlorphenol7,8. Figur 3 og tabell 2 viser et representativt resultat av en algetest, inkludert kurvemontering og statistiske utganger når DRC-pakken i R brukes på vekstratene.
Figur 3: Representativ konsentrasjonsresponskurve for 72 h eksponering av en kjemisk forbindelse for alger (R. subcapitata). Den solide linjen representerer log-logistic fit og det skyggelagte området er 95% konfidensintervall for passformen. De åpne sirklene representerer den beregnede vekstfrekvensen for hver replikering. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| 10. | 1999 – 2000 | 1999 – 1990 | |
| [mg/L] | [mg/L] | [mg/L] | |
| Kjemisk forbindelse | 4.6 [1.8-7.5] | 7.4 [4.1-11] | 16.9 [11-22] |
Tabell 2: Representative effektive konsentrasjoner for 10%, 20% og 50% hemming av vekstrate for en kjemisk forbindelse ved hjelp av alger (R. subcapitata). Verdien i parentes representerer konfidensintervallet på 95 % for en loglogistikktilpasning.
En vellykket test vil ha vekstrater over 0,9 d-1 for å overholde OECDs retningslinje og 1,5 d-1 for å overholde ISO 8692-retningslinjen og bør inneholde minst én konsentrasjon mellom 0 % og 100 % hemming. Lave vekstrater kan oppstå som følge av ulike problemer som bakteriell forurensning eller inokulum ikke å være i eksponentiell vekstfase i begynnelsen av testen. Mikroskopisk undersøkelse av replikeringene skal bare vise ensartet sigdformet grønn alge (R. subcapitata) med dimensjoner på ca. 2 μm bredde og 8 μm lengde. Hvis en enkelt replikering er forurenset, kan den utelates og analysen kan utføres uten disse dataene. Men hvis flere repliker er forurenset, gjenta eksperimentet med uforurenset eksponentielt voksende inokulum. For å vurdere om inokulumet var i eksponentiell vekstfase i begynnelsen av testen, beregner du veksthastigheten til kontrollen replikeres med 24 timer intervaller og bruker bare tidsintervallet som algeveksten av kontrollen er eksponentiell for statistisk analyse.
For å teste oppsettets robusthet ble en toksisitetstest ved hjelp av to referansestoffer (K2Cr2O7 og 3,5-Dichlorophenol) og tre nanomaterialer gjentatt tre ganger (3,5-Dichlorophenol, BaSO4 nanopartikler (NM-220) og ZnO nanopartikler (NM-111)) og fire ganger (K2Cr2O7 og CeO2 nanopartikler (NM-212)). Resultatene viste en variasjonskoeffisient av EC50-verdienemellom 11 % og 39 %, medlavest variasjonskoeffisient observert for ZnO nanopartikler (NM-111) og den høyeste variasjonskoeffisienten for CeO 2 nanopartikler (NM-212) (tabell 3).
| Sammensatte | Av eksperimenter | Inter-sample coefficient of variation for growth rate % |
1999 – 1990 (gjennomsnitt) mg/L |
Variasjonskoeffisient for EC50-verdier % |
| K2Cr2O7 | 4 | 4.5 | 0.73 | 13 |
| 3,5-Dichlorophenol | 3 | 3.4 | 1.9 | 21 |
| BaSO4 NP (NM-220) | 3 | 5.6 | 22 | 20 |
| Ceo2 NP (NM-212) | 4 | 4.3 | 13 | 39 |
| ZnO NP (NM-111) | 3 | 3.4 | 0.13 | 11 |
Tabell 3: Resultater av en intern laboratorietoksisitetstest med R. subcapitata eksponert for 72 timer til to referansestoffer og tre nanomaterialer fra JRC-depotet
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Planteplankton omdannes solenergi og karbondioksid til organisk materiale og har dermed en sentral rolle i det akvatiske økosystemet. Av denne grunn er algeveksthemmingstester inkludert som en av tre obligatoriske akvatiske toksisitetstester som kreves for regulatorisk risikovurdering av kjemikalier. Evnen til å utføre en pålitelig og reproduserbar algetoksisitetstest er nøkkelen i denne forbindelse. Testoppsett ved hjelp av Erlenmeyer kolbe introduserer en rekke variasjoner og ulemper som beskrevet i innledningen. For å omgå dette problemet har mikrotiterplater blitt foreslått3. Mens mikrotiterplatene minimerer volumet og plassen som kreves for testing, har det blitt reist bekymringer i litteraturen med hensyn til overholdelse av slike oppsett med testgyldighetskriteriene for testretningslinjer6. For eksempel ble betydelig tap av semivolatile kjemikalier samt kryssover til andre brønner i mikrotiterplater ved 37 °C i cellulære vekstmedier (DMEM GluteMAX, Opti-MEM og Hams F12 GlutaMAX) nylig demonstrert av Birch et al.12. Testing av flyktige stoffer kan utføres med LEVITATT-oppsettet ved hjelp av 1) lukkede hetteglass med CO2 beriket hodeplass9, 2) direkte å kaste den flyktige forbindelsen gjennom headspace13 eller i et fylt testhetteal10. Når det gjelder plasskrav, gir LEVITATT et testoppsett som fyller gapet mellom mikrotiterplater og Erlenmeyer kolbeoppsett, samtidig som det gir fordeler fra begge oppsettene, for eksempel opprettholde et konsis og kompakt testmiljø og tilstrekkelig testvolum for destruktiv prøvetaking (f.eks. for karakterisering av nanomaterialer under testen).
Variabiliteten mellom prøvene for LEVITATT-testsystemet varierte fra 3,4 % (3,5-diklorofenol og ZnO NP) til 5,6 % (BaSO4 NP). Dette er innenfor kravet om variasjonskoeffisient av gjennomsnittlig vekst i replikeringskontrollkulturer på 15 % angitt i OECD 201-retningslinjen7 (for LEVITATT-variabiliteten ble alle eksponeringer også inkludert).
Reproduserbarheten med hensyn til EC50-verdierav testoppsettet for referansestoffene viste en koeffisient av varians på 13% for K2Cr2O7 (n = 4) og 21% for 3,5-Dichlorophenol (n = 3). Dette kan sammenlignes med tester utført med konvensjonelle 250 ml Erlenmeyer kolbe bioanalyse for referansestoffet K2Cr2O7 som viser 16,8%14 og 25,4%15 variasjonskoeffisient for EC50-verdier. Mikrotiterplater har vist lavere variasjonskoeffisient for enkelte referansestoffer (f.eks. K2Cr2O7 (9 %14,15), mens høyere variasjonskoeffisienter er observert for fenol (34,9 %16) og Diklorofenol (38 %17). Begrenset informasjon er tilgjengelig med hensyn til reproduserbarhet av studier med nanomaterialer. Sammenligning av inter-sample-koeffisienten for variasjon for ZnO NPer ved hjelp av LEVITATT-systemet (3,4 %) med mikrotiterplater (67 %18) eller Erlenmeyer kolber (13 %19 og 35 %20), har den mindre variasjon. For ytterligere å teste robustheten til LEVITATT-systemet, er det igangsatt en round-robin-studie av to testmaterialer (ett referansestoff og ett vanskelig å teste stoff).
Opprettholde en uforurenset algekultur kan være vanskelig hvis den ikke håndteres i sterile forhold. Eksponentiell algevekst er en viktig forutsetning for å utføre retningslinjealgetesting. Måling av veksten på flere tidspunkter (f.eks. 24 h, 48 h, 72 h) kan identifisere om eksponentiell vekst skjer gjennom hele testperioden. Svingninger i temperatur og pH kan påvirke algeveksten; Disse parametrene må derfor være stabile gjennom hele testperioden. I små mengder testprøve skjer temperatursvingninger og pH raskere sammenlignet med større volumer, og de praktiske problemene med å måle disse parametrene blir stadig vanskeligere med avtagende testvolum. Parametere som pH og temperatur ved hjelp av 4 ml testvolum var stabile gjennom en 72-timers testperiode i LEVITATT både i et temperaturkontrollert rom ved 20 °C ± 2 °C og i en inkubator ved lignende forhold.
Analytiske metoder for kvantifisering av algevekst er mange: celletelling i et hemocytometer, coulter teller eller fluorescens av pigmentekstrakter. For vanskelige stoffer bør det tas hensyn til den mest hensiktsmessige metoden for biomassekvantifisering. For metalloksid nanopartikler, fluorescens av pigment ekstrakter har blitt funnet å utføre best på grunn av interferens av agglomerater når telle alger av hemocytometer eller coulter counter21. I motsetning fant Farkas og Booth22 at kvantifisering av biomasse ved fluorescens ikke var en egnet metode for økotoksisitetstesting av karbonbaserte nanomaterialer på grunn av autofluorescens og absorbans av pigmenter til nanomaterialene. For fargede stoffer kan det også være forstyrrelser av fargen med fluorescensutslippssignalet, og dermed kreve ytterligere kontroller eller fortynning til et nivå der denne forstyrrelsen er ubetydelig.
I veiledningsdokumentet for akvatisk toksisitetstestingav vanskelige stoffer 2, er en av anbefalingene for testing av fargede materialer å øke lysintensiteten. På samme måte har økt lysintensitet blitt nevnt for å omgå skyggeleggingsproblemer ved testing avnanomaterialer 23,,24. Imidlertid er slike modifikasjoner ofte forbundet med økte temperaturer, og dermed krever ytterligere kjøling eller ventilasjon av prøvene. I LEVITATT-oppsettet løses dette ved hjelp av LED-lys som produserer lite varme sammenlignet med konvensjonelle lyspærer eller fluorescerende rør. I tillegg, velge en LED med tilstrekkelig høy lysintensitet utgang og installasjon av en dimmer tillate å øke lysintensiteten for å teste fargede stoffer eller nanomaterialer og vanlige kjemikalier uten å endre det generelle oppsettet mellom tester. Videre gir plasseringen av lyskilden under prøvene og i separate foringsrør et konsekvent og homogent lysfelt.
Til slutt gir LEVITATT en kompakt plattform for algetoksisitetstesting av vanlige kjemikalier som er i samsvar med internasjonale standardiserte retningslinjer. Videre gir oppsettet en robust plattform for testing av vanskelige stoffer som forstyrrer lysets passasje mot alge, for eksempel nanomaterialer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Denne forskningen ble finansiert av PATROLS – Advanced Tools for NanoSafety Testing, Grant-avtale 760813 under Horizon 2020 forsknings- og innovasjonsprogram.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Sigma-Aldrich | V179124 | |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | 254134 | |
| BlueCap bottles (1L) | Buch & Holm A/S | 9072335 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B0394 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | 208290 | |
| Clear acrylic sheet (40x40 cm) | |||
| Cobalt(II) chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 255599 | |
| Copper(II) chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | 307483 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Fluorescence Spectrophotometer F-7000 | Hitachi | ||
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| Iron(III) chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 236489 | |
| LED light source | Helmholt Elektronik A/S | H35161 | Neutral White, 6500K |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Manganese(II) chloride tetrahydrate | Sigma-Aldrich | 221279 | |
| Orbital shaker | IKA | 2980200 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Raphidocelis subcapitata | NORCCA | NIVA-CHL1 strain | |
| Scintillation vials (20 mL) | Fisherscientific | 11526325 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 415413 | |
| Sodium molybdate dihydrate | Sigma-Aldrich | 331058 | |
| Spring clamp | Frederiksen Scientific A/S | 472002 | |
| Thermostatic cabinet | VWR | WTWA208450 | Alternative: temperature controlled room |
| Ventilation pipe (Ø125 mm) | Silvan | 22605630165 | |
| Volumetric flasks (25 mL) | DWK Life Sciences | 246781455 | |
| Zinc chloride | Sigma-Aldrich | 208086 |
References
- European Chemicals Agency. Guidance on Registration. European Chemicals Agency. , Helsinki, Finland. (2016).
- Organisation for Economic Cooperation and Development. Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. Organisation for Economic Cooperation and Development. , (2019).
- Blaise, C., Legault, R., Bermingham, N., Van Coillie, R., Vasseur, P. A simple microplate algal assay technique for aquatic toxicity assessment. Toxicity Assessment. 1 (3), 261-281 (1986).
- Hjorth, R., Sorensen, S. N., Olsson, M. E., Baun, A., Hartmann, N. B. A certain shade of green: can algal pigments reveal shading effects of nanoparticles. Integrated Environmental Assessment and Management. 12 (1), 200-202 (2016).
- Chen, F., et al. Algae response to engineered nanoparticles: current understanding{,} mechanisms and implications. Environmental Science: Nano. 6 (4), 1026-1042 (2019).
- Arensberg, P., Hemmingsen, V. H., Nyholm, N. A miniscale algal toxicity test. Chemosphere. 30 (11), 2103-2115 (1995).
- Organisation for Economic Cooperation and Development. Test No. 201: Freshwater Alga and Cyanobacteria, Growth Inhibition Test. Organisation for Economic Cooperation and Development. , (2011).
- International Organization for Standardization (ISO). Water Quality - Fresh Water Algal Growth Inhibition Test with Unicellular Green Algae. International Organization for Standardization (ISO). , (2012).
- Halling-Sørensen, B., Nyhohn, N., Baun, A. Algal toxicity tests with volatile and hazardous compounds in air-tight test flasks with CO2 enriched headspace. Chemosphere. 32 (8), 1513-1526 (1996).
- Mayer, P., Nyholm, N., Verbruggen, E. M. J., Hermens, J. L. M., Tolls, J. Algal growth inhibition test in filled, closed bottles for volatile and sorptive materials. Environmental Toxicology and Chemistry. 19 (10), 2551-2556 (2000).
- Ritz, C., Baty, F., Streibig, J. C., Gerhard, D. Dose-response analysis using R. PloS One. 10 (12), 0146021 (2015).
- Birch, H., Kramer, N. I., Mayer, P. Time-resolved freely dissolved concentrations of semivolatile and hydrophobic test chemicals in in vitro assays-measuring high losses and crossover by headspace solid-phase microextraction. Chemical Research in Toxicology. 32 (9), 1780-1790 (2019).
- Trac, L. N., Schmidt, S. N., Mayer, P. Headspace passive dosing of volatile hydrophobic chemicals - toxicity testing exactly at the saturation level. Chemosphere. 211, 694-700 (2018).
- Eisentraeger, A., Dott, W., Klein, J., Hahn, S. Comparative studies on algal toxicity testing using fluorometric microplate and Erlenmeyer flask growth-inhibition assays. Ecotoxicology and Environmental Safety. 54 (3), 346-354 (2003).
- Paixao, S. M., Silva, L., Fernandes, A., O'Rourke, K., Mendonca, E., Picado, A. Performance of a miniaturized algal bioassay in phytotoxicity screening. Ecotoxicology. 17 (3), 165-171 (2008).
- Thellen, C., Blaise, C., Roy, Y., Hickey, C. Round-robin testing with the selenastrum--capricornutum microplate toxicity assay. Hydrobiologia. 188, 259-268 (1989).
- Nagai, T., Taya, K., Annoh, H., Ishihara, S. Application of a fluorometric microplate algal toxicity assay for riverine periphytic algal species. Ecotoxicology and Environmental Safety. 94, 37-44 (2013).
- Lee, W. M., An, Y. J. Effects of zinc oxide and titanium dioxide nanoparticles on green algae under visible, UVA, and UVB irradiations: no evidence of enhanced algal toxicity under UV pre-irradiation. Chemosphere. 91 (4), 536-544 (2013).
- Samei, M., Sarrafzadeh, M. H., Faramarzi, M. A. The impact of morphology and size of zinc oxide nanoparticles on its toxicity to the freshwater microalga, Raphidocelis subcapitata. Environmental Science and Pollution Research. 26 (3), 2409-2420 (2019).
- Neale, P. A., Jaemting, A. K., O'Malley, E., Herrmann, J., Escher, B. I. Behaviour of titanium dioxide and zinc oxide nanoparticles in the presence of wastewater-derived organic matter and implications for algal toxicity. Environmental Science: Nano. 2 (1), 86-93 (2015).
- Hartmann, N. B., et al. The challenges of testing metal and metal oxide nanoparticles in algal bioassays: titanium dioxide and gold nanoparticles as case studies. Nanotoxicology. 7 (6), 1082-1094 (2013).
- Farkas, J., Booth, A. M. Are fluorescence-based chlorophyll quantification methods suitable for algae toxicity assessment of carbon nanomaterials. Nanotoxicology. 11 (4), 569-577 (2017).
- Handy, R. D., et al. Practical considerations for conducting ecotoxicity test methods with manufactured nanomaterials: what have we learnt so far. Ecotoxicology. 21 (4), 933-972 (2012).
- Handy, R. D., et al. Ecotoxicity test methods for engineered nanomaterials: practical experiences and recommendations from the bench. Environmental Toxicology and Chemistry. 31 (1), 15-31 (2012).
