Summary
En metode er beskrevet for samtidig isolering af myocytter og ikke-myocytter fra både atrierne og hjertekamrene i en enkelt voksen mus hjerte. Denne protokol resulterer i ensartede udbytter af meget levedygtige hjerte myocytter og ikke-myocytter og detaljer optimal celle-specifikke kultur betingelser for fænotyping og in vitro analyse.
Abstract
Isolation og dyrkning af hjerte myocytter fra mus har været afgørende for at fremme forståelsen af hjertefysiologi og patofysiologi. Mens isolere myocytter fra neonatal mus hjerter er relativt ligetil, myocytter fra den voksne murine hjerte foretrækkes. Dette skyldes, at sammenlignet med neonatale celler, voksne myocytter mere præcist opsummere cellefunktion, som det forekommer i det voksne hjerte in vivo. Det er dog teknisk vanskeligt at isolere hjertemyocytter til voksne mus i de nødvendige mængder og levedygtighed, hvilket bidrager til et eksperimentelt dødvande. Desuden er offentliggjorte procedurer specifikke for isolering af enten atrie- eller ventrikulære myocytter på bekostning af atrie- og ventrikulære ikke-myocytceller. Beskrevet her er en detaljeret metode til at isolere både atrie og ventrikulær hjerte myocytter, sammen med atrie og ventrikulær ikke-myocytter, samtidig fra en enkelt mus hjerte. Der er også oplysninger om optimale cellespecifikke dyrkningsmetoder, som forbedrer cellegabiliteten og -funktionen. Denne protokol har ikke kun til formål at fremskynde processen med voksen murine hjertecelleisolering, men også at øge udbyttet og levedygtigheden af celler til undersøgelser af atrie- og ventrikulære hjerteceller.
Introduction
Primær cellekultur er en integreret ressource, der tilbyder et kontrolleret miljø til detaljerede mekanistiske undersøgelser af hjerte myocytfunktion. På grund af deres mere holdbare natur og lethed af isolation, neonatal rotte atrie og ventrikulær myocytter har været den almindelige kilde til sådanne cellekulturer1. Men voksne mus atrie og ventrikulær myocytter (AMAMs og AMVMs) er meget ønskeligt for in vitro undersøgelser, fordi deres molekylære og funktionelle egenskaber bedre efterligne dem af voksne hjerteceller. Således er de blevet relevante for undersøgelser relateret til hjertepatologier, hvoraf de fleste udvikler sig hos voksne2.
Desuden, tilgængeligheden og brugen af transgene og sygdom mus modeller udvider nytten af isolerede voksne hjerte myocytter. Protokoller for isolation og kultur af mus AMVMs for kort- og langsigtede undersøgelser er blevet beskrevet i talrige tidligere publikationer2,3 ,4,5,6,7,8,9,10,11. Til sammenligning er der kun beskrevet få protokoller for isolering af AMAM'er. Desuden er de beskrevne primært optimeret til akutte undersøgelser af frisk isolerede celler uden nogen langsigtet dyrkningsprotokol beskrevet til dato11,12,13. Som sådan var AMAM-isolationsprotokoller ikke designet til at give nytten og alsidigheden af offentliggjorte protokoller til isolering og kultur af AMVM'er. Selv om de banebrydende undersøgelser for isolering af AMAM'er og AMVM'er har vist sig at være ressourcestærke, er der ingen protokoller for optimal samtidig isolation og kultur af både AMAMs og AMVMs, hvilket resulterer i effektiv udnyttelse af hele hjertet til hvert præparat.
Indtil nu har offentliggjorte AMAM- og AMVM-isolationsprotokoller ikke været designet til samtidig isolering af begge celletyper, fordi de fleste undersøgelser af atrie- og ventrikulær funktion har et kammerspecifikt fokus. For eksempel bruges AMAMs overvejende til at studere atrie myocyt elektrofysiologi, dels på grund af interessen for atrieflimren (AF), den mest almindelige hjertearytmi i USA. Af er dog ikke en sygdom, der påvirker atrierne isoleret, og det har været impliceret som havende en årsagsrolle i mild til svær venstre ventrikel dysfunktion14. Desuden har elektrokardiogrammer fra patienter med hjertesvigt med bevaret udslyngningsfraktion (HFpEF) illustreret, at venstre atriestørrelse er en af de stærkeste prædiktorer for modtagelighed for hjertesvigt15.
Ud over sin rolle i elektrofysiologi og kontraktilitet er atriet også et endokrine organ, der udskiller kardiokiner (dvs. atrie natriuretisk peptid [ANP]), der homeostatisk regulerer blodtryk og volumen16,17. Desuden ANP (formentlig fra atrie myocytter) har en fremtrædende beskyttende og anti-hypertrofisk rolle i ventrikulær myocytter16,17. Mens der er en stærk implikation af neurohormonal kommunikation mellem atria og hjertekamre i forskellige sygdomstilstande, er de mekanismer, der ligger til grund for denne kommunikation, ikke blevet undersøgt fuldt ud. Dette punkt er yderligere eksemplificeret ved den kraftige stigning i forskning med fokus på 1) den rolle, som ikke-myocytter (specifikt hjerte fibroblaster og immunceller) i syge hjerte og 2) hvordan hjerte remodeling som en funktion af sygdommen direkte påvirker hjerte myocyt levedygtighed og globale hjertefunktion18,19,20,21,22. Således er det at studere hjerteceller fra både atria og ventrikler en nødvendig tilgang for at få et mere komplet billede af deres roller i hjertepatofysiologi.
Følgende protokol beskriver den samtidige isolering af atrie og ventrikulære myocytter og ikke-myocytter fra et enkelt musehjerte under fysiologiske og patofysiologiske forhold. Derudover er denne metode den første til at beskrive optimale betingelser, der er nødvendige for at opretholde kulturer af atrie hjerte myocytter, da betingelserne for at opretholde kulturer af ventrikulære myocytter allerede er blevet offentliggjort.
Protocol
Al forskning udført på mus, der er rapporteret i dette papir, er blevet gennemgået og godkendt af SDSU Institutional Animal Care and Use Committee, og den er i overensstemmelse med vejledningen for pleje og brug af laboratoriedyr offentliggjort af National Research Council.
1. Forberedelse af isolations- og kulturmedier og plating
- Forbered 1 L hjerte perfusion medier før brug ved at tilføje Joklik modificeret minimum væsentlige medier (MMEM) til 1 L sterilt vand. PH-vinduet justeres til 7,36 med 10 N NaOH, filtreres derefter gennem et 0,2 μm filter og opbevares ved 4 °C i op til 2 uger.
BEMÆRK: Joklik MMEM består af 112 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 1 mM MgCl2,9 mM NaH2PO4og 11,1 mM D-glukose. Dette suppleres med 10 mM HEPES (2,38 g/L), 30 mM taurin (3,75 g/l), 2 mM D-l-carnitin (0,4 g/l), 2 mM kreatin og 10 mM butanedione monoxime (1,01 g/L). - Forbered fordøjelsesbuffer lige før perfusion, som følger: supplere 50 mL hjerteperfusionsmedier med 6,25 μL på 100 mM CaCl2 (se trin 1.3) og kollagen type 2 (enzymatisk aktivitet ~310-320 U/mg dw).
BEMÆRK: Afveje dyret før ofring. Mængden af kollagen type 2 suppleret i fordøjelsesbufferen er dikteret af dyrets vægt (2,25 mg kollagen type 2 pr. 1 g kropsvægt). - For at forberede 100 mM CaCl2, tilsæt 1,47 g CaCl2 til 100 mL molekylærbiologisk kvalitet vand. Rør indtil opløst, derefter passere gennem en 0,2 μm filter og opbevares ved stuetemperatur i op til 2 måneder.
- Forbered myocyt stopbuffer 1 ved at supplere 90 mL hjerte-perfusionsbuffer med 10 mL føtalt kvægserum (FBS) og 125 μL på 100 mM CaCl2. Gennem et filter på 0,2 μm og opbevares ved 4 °C i op til 2 uger.
- Forbered myocyt stop buffer 2 ved at supplere 114 mL hjerte perfusion buffer med 6 mL FBS og 150 μL af 10 mM CaCl2. Gennem et filter på 0,2 μm og opbevares ved 4 °C i op til 2 uger.
- Forbered atrie myocytbelægning medium lige før perfusion ved at supplere 95 mL dulbecco modificerede Eagle medium (DMEM) med 4 mL FBS, 1 mL af 100x pen / strep-glutamin, 1 mL af 100x insulin-transferrin-selen, og 1 mL af 10 μM dexamethasone. Der passerer et filter på 0,2 μm og opbevares ved 37 °C, indtil det plating.
- Forbered ventrikulært myocytbelægningsmedium ved at supplere 95 ml essentielt medium (MEM) med 4 ml FBS, 1 ml 100x pen/strep-glutamin, 10 ml 1 M HEPES-opløsning, 1 ml 100x insulin-transferrin-selen og 0,1 g butanedion monoxime. Gennem et filter på 0,2 μm og opbevares ved 4 °C i op til 2 uger.
- Forbered ventrikulær myocyt opretholde medium ved at supplere 99 ml MEM med 1 ml 100x insulin-transferrin-selen, 0,1 mg / mL kvæg serum albumin (BSA), 10 ml 1 M HEPES opløsning og 1 ml 100x pen / strep-glutamin. Gennem et filter på 0,2 μm og opbevares ved 4 °C i op til 2 uger.
- For at forberede lamininbelagte forsøgsplader og -lysbilleder skal mus laminin-stamopløsningen (1,19 mg/mL optøes). Der tilsættes 10 μL laminin stamopløsning til hver 1 ml DMEM og blandes. Coat eksperimentelle plader og lysbilleder jævnt og opbevares i en 37 °C, 5% CO2 inkubator i mindst 1 time før perfusion for at give mulighed for ækvilibrering.
BEMÆRK: Belagte forsøgsplader og rutsjebaner kan opbevares ved 4 °C i op til 2 dage.
2. Isolationsapparatur
- Før hver isolering rengøres slangen og andre komponenter i systemet med tre komplette vaske på 70% EtOH ved at fylde boblefælden til toppen (luk den nederste stophane og hold den øverste stophane åben).
- Skyl hele systemet 3x med steril H2O ved at fylde boblefælden til toppen (luk den nederste stophane og hold den øverste stophane åben).
- Skyl det komplette system med hjertetransfusionsbuffer, og fyld boblefælden halvvejs med medier.
- Sæt det cirkulerende vandbad til 37 °C.
- Indstil et vandbad til medier til 37 °C.
- Fjern eventuelle luftbobler i den peristaltiske pumperør.
- Den peristaltiske pumpes strømningshastighed justeres til 3 mL/min.
3. Kirurgisk procedure (ikke-overlevelse)
- Soak kirurgiske instrumenter i 70% EtOH i mindst 5 min.
- Placer hjerteperfusionsmediet, myocytstopbufferne og fordøjelsesbufferen i vandbadet på 37 °C.
- Placer det atrie myocytbelægningsmedium, ventrikulært myocytbelægningsmedium og ventrikulær myocyt opretholder medium i et 37 °C, 5% CO2 inkubator 1 time før brug og løsne hætterne for at muliggøre ekvilibrering.
- 10 uger gamle C57b6/j-mus med 10 uger og derunder (i.p.) med 0,35 mL heparin, fortyndet i fosfatbufferet saltvand (PBS) til 100 IE/mL. Lad lægemidlet træde i kraft i ca. 10 minutter.
BEMÆRK: Hvis to hjerter skal underkastes denne isolationsprocedure, kan den anden mus bedøves og administreres heparin på dette tidspunkt i den første procedure. For at minimere stress på dyret kan let anæstesi administreres ved hjælp af 2% isofluran /oxygen blanding i et hermetisk forseglet induktionskammer. - Bedøve dyret med en 2% isoflurane / ilt blanding og injicere i.p. med pentobarbital (0,3 mL fra 10 mg / mL lager), derefter forberede brystet ved swabbing med 70% EtOH.
- Forbered en bundet 5-0 silke sutur for at være klar til at ligate hjertet til perfusionsbeholderen. Mount kanyle lige ved siden af kirurgisk mikroskop.
- Åbn hurtigt brystet ved først at lave et midtline hudindsnit, fra midten af maven til kæben, og gå derefter ind i bughinden med den store saks og rydde mellemgulvet væk ved stump dissektion. Skær derefter brystkassen væk ved hjælp af saksen med nedskæringer op ad brystvæggen på det laterale aspekt af begge sider.
- Klip væk fiberforbindelser mellem hjerte og brystvæg (herunder thymus). Skær derefter brystkassen væk alle sammen. Brug de små pincet og saks, forsigtigt løfte hjertet ved toppen og udsætte den bageste aspekt af hjertet.
- Explant hjertet ved at dissekere umiddelbart ringere end den innominate arterie på den opstigende aorta og straks placere hjertet i iskold PBS eller koldt hjerte perfusion medier. Efterfølgende, hurtigt dissekere væk resterende væv fra det udplantede hjerte i iskold hjerte perfusion medier, udsætter den opstigende aorta.
BEMÆRK: Det er nyttigt at udgrave hjertet med thymus intakt til brug som et anatomisk vartegn. - Rengør området omkring aorta af overskydende væv ved hjælp af mikro-dissekere pincet og saks. Placer aorta på kanylen ved hjælp af finspidsede pincet og fastgør med en 5-0 silke sutur.
BEMÆRK: Den bedste placering sker normalt med aorta, der strækker sig ca. 2 mm op på kanylen. - Perfuse det cannulated hjerte med hjerteperfusionsmedier med en strømningshastighed på 3 mL/min i 4 min. Skift derefter mediet fra hjertetransfusionsmedie til fordøjelsesbuffer i 15,0−17,5 minutters perfusion (Figur 1A).
BEMÆRK: Koronarstrømningshastigheden vil sandsynligvis stige, hvilket indikerer effektiv vævsfordøjelse (dvs. blegt, hævet hjerte). - Der opsamles 8 mL fordøjelsesbufferflow igennem i løbet af de sidste minutter af perfusionen til senere brug i trin 5.4.
- Fjern hjertet fra kanylen og læg det på en 60 mm plastkulturskål. Fjern overskydende væv (dvs. aorta, vener) og nedsænke hjertet i 2,5 mL fordøjelsesbuffer som forberedelse til mekanisk adskillelse.
BEMÆRK: På dette tidspunkt dissekeres atrierne væk, og en forsøgsmand skal lede atriecellens isolationsprotokol, mens en anden eksperimentator skal lede ventrikelcelleisolationen.
4. Atriecelleisolation og kultur
- Disseker atrierne væk fra hjertet og læg det i en 30 mm plastkulturskål. Nedsænk den i 0,75 mL fordøjelsesbuffer til mekanisk adskillelse. Ventrikelerne opbevares i skålen på 60 mm (trin 3.12) og de separate isolationsmetoder udføres samtidigt (punkt 5, figur 1B).
BEMÆRK: På dette tidspunkt kan atrierne og hjertekamrene gennemgå yderligere adskillelse, hvis der skulle være behov for at isolere venstre- og højresidecellerne. - Begynd at hakke og drille atrierne fra hinanden, i første omgang med finspids kirurgisk saks og efterfulgt af fine pincet til yderligere hakning. Undgå at ophidse vævet, og træk ikke hurtigt muskelfibre fra hinanden.
- Ved hjælp af en steril overførsel pipette spids, fortsætte med at forsigtigt blande og dissociate vævet i 15 min. Hver 5 min, observere atrie myocyte disassociation fra væv under en 10x mål brightfield mikroskop. Efterhånden som vævet fordøjes yderligere, fortsættes forsigtigt med at blande og dissociere væv ved hjælp af en steril overførselspipettespids med en mindre porestørrelse.
- Celleaffjedringen overføres til et sterilt mikrocentrifugerør på 2 mL. 30 mm pladen skylles med 0,75 mL 37 °C myocytstopbuffer 1 og kombineres med celleophænget (slutvolumen = 1,5 mL).
- Lad atrie myocytterne sedimentere ved tyngdekraften i 10 minutter ved stuetemperatur. Omrør forsigtigt celleaffjedringen for at give myocytter mulighed for at sedimentere til bunden af det koniske rør og danne en synlig pellet.
- Centrifuge celleaffjedringen i 5 min ved 20 x g. Fjern forsigtigt supernatanten, som indeholder de ikke-myocytter, og overfør til et 15 mL polypropylen konisk rør ved hjælp af en steril pipettespids uden at forstyrre pellet af atriemyocytter.
- Centrifuge den ikke-myocyt brøk i 5 min ved 20.000 x g. Aspirere supernatant og genbruge ikke-myocyt pellet i 10 mL DMEM suppleret med 10% føtal kalv serum (FCS).
- Tæl ikke-myocytter ved hjælp af et hæmocytometer eller en anden metode, og skriv derefter efter forsøgsbehov, eller isoler yderligere i individuelle specifikke cellepopulationer via fluorescensaktiveret cellesortering (Figur 1C).
- Resuspend pellet af isolerede atrie myocytter fra trin 4,6 i 1 mL af atrie myocyte plating medium og anvende 10 μL af denne suspension på en hæmocytometer. Udfør et celleantal af stangformede myocytter pr. felt.
- Aspirat laminin fra prælakerede eksperimentelle plader/lysbilleder og genbrugte de isolerede atriemyocytter i det relevante volumen af atriemyocyteplader suppleret med 25 μM blebbistatin. Plade ved den ønskede massefylde pr. forsøgsbehov(figur 1C).
BEMÆRK: Typisk platingtæthed for den langsigtede dyrkning, der er beskrevet her, er 5 x 105 celler/kammer på firekammers (1,7 cm2)glasrutsjebaner.
5. Isolering og kultur af ventrikulære celler
- Begynd at hakke og drille hjerte fra hinanden ventrikulært væv, først med fine-tip kirurgisk saks og efterfulgt af fine pincet til yderligere hakning (Figur 1B). Undgå agitering af vævet ved hurtigt at trække fra hinanden muskelfibre.
- Celleaffjedringen overføres til et 15 mL polypropylenkonisk rør. Pladen skylles med 2,5 mL 37 °C myocytstopbuffer 1 og kombineres med celleophænget (slutvolumen = 5 mL).
- Ved hjælp af en steril overførsel pipette spids, fortsætte med at forsigtigt blande og dissociate vævet i 4 min. Påfør 10 μL af denne celleophæng på diaset og visualiser tilstedeværelsen af stangformede myocytter for at sikre isolationens kvalitet.
- Celleaffjedringen overføres gennem et sterilt nylonfilter på 100 μm til et 50 mL polypropylenkonisk rør. Brug 2 mL fordøjelsesbuffer opsamlet i trin 3.12 for at vaske eventuelle resterende celler af det sterile nylonfilter.
- Lad ventrikulær myocytterne sedimentere ved tyngdekraften i 6 minutter ved stuetemperatur. Omrør forsigtigt den filtrerede celleaffjedring for at give myocytter mulighed for at sedimentere i bunden af det koniske og danne en synlig pellet.
- Uden at forstyrre pellet af ventrikulær myocytter, forsigtigt fjerne supernatant (ikke-myocytter) og overføre til en 50 mL polypropylen konisk rør ved hjælp af en steril pipette spids. Centrifuge den ikke-myocyt brøk i 5 min ved 20.000 x g. Aspirat supernatant og genbruge ikke-myocyt pellet i 10 mL DMEM suppleret med 10% FCS.
- Tæl ikke-myocytter ved hjælp af et hæmocytometer og genbruges i en passende mængde DMEM suppleret med 10% FCS. Derefter plade i henhold til eksperimentelle behov, eller yderligere isolere i individuelle specifikke cellepopulationer via fluorescens-aktiveret cellesortering (Figur 1C).
- Resuspend de isolerede ventrikulære myocytter i 2 mL myocyt stop buffer 2 og anvende 10 μL celle suspension på hæmocytometer. Udfør et celleantal af stangformede myocytter pr. felt.
- Genindførelse af Ca2+ ved hjælp af et trinvist paradigme
BEMÆRK: Calcium reintroduktion trin er specifikke for ventrikulær myocytter og bør ikke udføres for atrie myocytter, da dette vil resultere i celledød.- Der tilsættes 50 μL på 10 mM CaCl2 til ventricular myocytcelleophænget. Bland godt og inkuber i 4 minutter ved stuetemperatur.
- Der tilsættes yderligere 50 μL på 10 mM CaCl2 til ventrikulær myocytcelleaffjedring. Bland godt og inkuber i 4 minutter ved stuetemperatur.
- Der tilsættes yderligere 100 μL på 10 mM CaCl2 til ventricular myocytcelleaffjedringen. Bland godt og inkuber i 4 minutter ved stuetemperatur.
- Der tilsættes 80 μL på 100 mM CaCl2 til ventricular myocytcelleophænget. Bland godt og inkuber i 4 minutter ved stuetemperatur.
- Lamininbelægningen fjernes fra plader eller lysbilleder, og det isolerede ventrikulære myocytter genbruges i et passende volumen af ventrikkulært myocytbelægningsmedium i overensstemmelse med forsøgsbehovene (figur 1C).
BEMÆRK: Typisk platingtæthed for den langsigtede dyrkning, der er beskrevet her, er 5 x 105 celler/kammer på firekammers (1,7 cm2)glasrutsjebaner. Undgå plating ved en tæthed på mere end 75% sammenløb, da cellulær over-fortætning fremmer celleklumpning og derved hæmmer fastgørelse til pladen. Desuden vil et stort antal celler gå tabt under den første mellemstore ændring. Pladeceller hurtigt efter isolation, som ekstracellulære Ca2 + fremmer hyperkonference og tab af levedygtige myocytter. - Lad ventrikulær myocytterne afregne og klæbe i mindst 1 time. Efterfølgende ændre medierne til ventrikulær myocyt opretholde medium suppleret med 25 μM blebbistatin.
BEMÆRK: Ventrikulære myocytter kan dyrkes op til 96 timer efter plating i μM blebbistatin. Eksperimenter bør udføres i ventrikulær myocyt opretholde medium i mangel af blebbistatin.
Representative Results
En wildtype 10 uger gammel C57b6/j musehjerte resulterer typisk i mellem 75.000−150.000 atrie myocytter og 1,0−1,5 x 106 ventrikulære myocytter, svarende til et omtrentligt udbytte på 30%−50% for atrie og ventrikulær myocytter18,19. Under og umiddelbart efter isolationer skal levedygtige hjerte myocytter fremstå stangformede og ikke-kontraherende. Et flertal af isolerede hjerte myocytter bør tilpasse denne morfologi, som er en indikation af effektiv perfusion. Stangformet morfologi kan også være en forudsigelse af levedygtighed. Protokollen har til formål at øge udbyttet og levedygtigheden af myocytter og ikke-myocytter isoleret fra et sygt musehjerte. Desuden er det blevet testet i en model af trykoverbelastning-induceret hjertesvigt (data ikke vist).
For at bekræfte tilstrækkelig og replikerbar isolering af myocytter og ikke-myocytter fra atrie- og ventrikulært væv blev celler observeret og fotograferet på forskellige dage i kulturen(Figur 2). Derudover blev der udført kvantitativ polymerasekædereaktion (qRT-PCR) for at måle niveauet af udskrifter, der var celletypespecifikke. Hjertemuskel troponin T(Tnnt2)er en markør for hjerte myocytter og blev robust udtrykt i både atrie og ventrikulær hjerte myocyte kulturer(Figur 3A). I modsætning hertil, at atrie natriuretic peptid (Nppa, som typisk udtrykkes udelukkende i voksne atrie hjerte myocytter under fysiologiske forhold) og myosin lys kæde 2 (Myl2, som er en ventrikulær myocyt specifikke gen) var robust og specifikt udtrykt i atrie og ventrikulær hjerte myocyt kulturer, henholdsvis (Figur 3B, C).
Fibroblastmarkører, transskriberingsfaktor 21 (Tcf21), blodpladebaseret vækstfaktorreceptor A (Pdgfra) og monocytbaseret cellemarkeringsklynge af differentiering 68 (Cd68) blev udelukkende udtrykt i ikke-myocytkulturer isoleret fra både atrie- og ventrikulære kamre (Figur 3D−F). Det anslås, at ikke-myocytter kompromis ~ 65% af alle hjerteceller, og at et flertal af disse stammer fra en fibroblast eller monocyt-afledt afstamning18,19,23,24. Således blev markører for disse to afstamninger valgt til at være repræsentative i betragtning af interessen for disse cellulære populationer i undersøgelser af forskellige modeller og ætiologier af hjertepatologi.
Immunostaining af AMAMs og AMVMs for t-tubule markør dihydropyridin (DHPR, som er en spænding-afhængig (L)-type calcium kanal) samt ryanodin receptor (RYR2) demonstreret intakt t-tubules hele isolation og langsigtet kultur(Figur 4A, B). Den overflod af DHPR og lokalisering, der var karakteristisk og unik for atrie og ventrikulær myocytter, indikerede tilstedeværelsen af t-tubules. Desuden var kolocalisering af DHPR med RYR2 immunostaining en indikator for intakte diadstrukturer. Immunostaining for sarkomerisk protein alpha-actinin i atrie og ventrikulær hjerte myocytter resulterede i den forventede sarkomeriske striation mønster. Det sarkomeriske rillemønster blev anvendt til at vurdere renheden og levedygtigheden af isolerede hjertemakker i forbindelse med stangformet morfologisk form og nuklear farvning med TOPRO-3(Figur 4C, D; lilla og rød). Som forventet var ventrikulære hjerte myocytter store og udviste en gennemsnitlig længde på ~ 150 mm, mens atrie hjerte myocytter i gennemsnit ~ 75 mm. Desuden, efter immunostaining analyse, atrie hjerte myocytter (men ikke ventrikulær hjerte myocytter) udstillet robust udtryk for atrie natriuretic peptid (ANP) i en farvning mønster, der var karakteristisk for lokalisering til endoplasmiske reticulum og sekretoriske granulat(Figur 4C, D; grøn).
En egenskab unik for atrie hjerte myocytter er dens klassificering som en endokrine celle ud over kontraktil celle. Mens atrie myocytter udskiller ANP under basale forhold, sekretion stiger som reaktion på secretagogues (dvs. alfa-adrenergic agonist, phenylephrine [PE]). Desuden atrie hjerte myocytter udskille ANP og co-sekretionally behandle en del af hormonet fra sin prækursor tilstand (Pro-ANP, 15 kD) til produktet peptid (ANP 3kD)16,17. Denne sekretoriske evne kan kvantificeres via immunoblot påvisning af ANP i medierne af isolerede atrie hjerte myocytter som reaktion på akut PE behandling (Figur 4E). Denne sekretorisk og behandling evne atrie hjerte myocyte blev anset for at være følsomme over for dyrkning betingelser. Det er således bydende nødvendigt, at det atrie myocytbelægningsmedium suppleres med dexamethasone, insulin, transferrin og selen.
Figur 1: Skematisk oversigt over retrograd hjertetransfusion, fordøjelse og celleisolation. Vist er de vigtigste trin, der er involveret i celleisolering fra både atrie- og ventrikulære kamre samtidigt fra et enkelt musehjerte. (A) En enkelt mus hjerte er hurtigt cannulated via opstigende aorta og perfunderes i en retrograd måde. (B) Hjertet er opdelt i atrie- og ventrikulært væv for yderligere fordøjelse og fysisk adskillelse. (C) Efter tilstrækkelig fordøjelse adskilles cellerne via tyngdekraftsfiltrering til i alt fire cellulære fraktioner, der dyrkes til efterfølgende forsøg. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Morfologisk analyse af isolerede atrie- og ventrikulære hjerte myocytter og ikke-myocytter i kulturen. (A) Isolerede voksne mus atrie myocytter (AMAMs),(B)voksen mus atrie ikke-myocytter (AMANMs), (C) voksen mus ventrikulær myocytter (AMVMs), eller (D) voksne mus ventrikulære ikke-myocytter (AMVNMs) blev belagt på 5 x 105 celler / kammer på fire-kammer (1,7 cm2)glas dias i respektive forgyldte medier. Fasebilleder blev opnået på angivne dage i kulturen ved hjælp af et 10x mål under et epifluorescensmikroskop. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Repræsentativ qRT-PCR-analyse af isolerede cellekulturer. RNA blev udvundet af frisk isolerede hjerte myocytter og ikke-myocytter, og mRNA-niveauer for cellespecifikke genmarkører blev bestemt af qRT-PCR4. (A) Tnnt2, hjertemuskeltroponin T (hjerte myocytmarkør); (B) Nppa, atrie natriuretic peptid (atrie myocyte markør); (C) Myl2, myosin lyskæde 2 (ventrikulær myocyt markør); (D) Tcf21, transskriberingsfaktor 21 (fibroblastmarkør) (E) Pdgfra, blodplade-afledt vækstfaktor receptor A (fibroblast markør); (F) Cd68, klynge af differentiering 68 (monocyt-afledt cellemarkør). Data repræsenterer middelværdi ± SEM (*p ≤ 0,05 forskellig fra alle andre værdier, som bestemt af ANOVA efterfulgt af Newman Keuls post-hoc-analyse). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Repræsentativ morfologisk og funktionel analyse af isolerede atrie- og ventrikulære hjerte-myoycter. (A) AMAMs eller (B) AMVMs blev belagt med 5 x 105 celler / kammer på fire-kammer (1,7 cm2)glas dias i henholdsvis plating medier i 1 time for at give mulighed for vedhæftning. Dette blev efterfulgt af enten refeeding atrial myocyte plating medier eller skifte til ventrikulær myocyte opretholde medier suppleret med blebbistatin for yderligere 16 timer. Kulturer blev efterfølgende fastsat derefter immunostained for RYR2 (lilla), DHPR (grøn), og nukleare plet TOPRO-3 (rød). (C) AMAMs eller (D) AMVMs blev isoleret og belagt, derefter immunostained for a-actinin (lilla), ANP (grøn) og TOPRO-3 (rød). Vist er to repræsentative billeder for hver celletype. (E)AMAMs blev belagt på 5 x 105 celler / godt på en 12 godt kultur parabol for 16 timer i atrie myocyte plating medier. AMAMs blev efterfølgende behandlet i 0,5 timer med køretøj eller ANP secretagogue (phenylephrine, 50 mM), før medierne blev indsamlet og udsat for immunoblot analyse for ANP. Forud for immunoblot analyse, blev medieprøver centrifuged på 500 x g i 5 min for at fjerne cellulære vragrester og sikre, at den observerede ANP var resultatet af aktiv sekretion fra AMAMs. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Kvaliteten af cellerne isoleret ved hjælp af den procedure, der er beskrevet her, som bestemt af celleudbyttet og den generelle sundhed af cellerne i kulturen, afhænger af mange kontrollerbare faktorer. Begyndende med musen selv er det dokumenteret, at stress, der pålægges dyret, kan påvirke celleudbyttet og levedygtigheden i kulturen negativt, formentlig på grund af overskydende systemisk kortisol, katekolaminer og hjertevævets hyperkontraktiske tilstand2,5,7. Af disse grunde bør der træffes foranstaltninger for at undgå at alarmere dyret inden ofringen. Sådanne foranstaltninger omfatter dækning af dyrets bur og begrænsning af tid uden for vivarium før ofring. Heparin og mange barbiturater, der almindeligvis anvendes til aktiv dødshjælp, kan påvirke signalvejene; Derfor bør den optimale metode til aktiv dødshjælp tilpasses i overensstemmelse hermed. Dyrets alder har en betydelig indvirkning på kvaliteten og levedygtigheden af isolerede celler, sandsynligvis på grund af progressiv akkumulering af interstitiel fibrose, der forekommer samtidig med aldringsprocessen, hvilket kan påvirke vævsfordøjelsen25. I data, der ikke præsenteres her, mens den ovenfor beskrevne metode virker hos mus på op til 78 uger gamle, var cellernes kvalitet lavere hos disse ældre dyr.
Det mest kritiske skridt i den beskrevne isolationsproces samt andre protokoller med et Langendorff-apparat til retrograd perfusion er cannulationen og den første perfusion af hjertet. For at opnå optimale resultater bør tiden fra hjerteudrulning til cannulation af den opstigende aorta og påbegyndelse af perfusion ikke tage mere end 90 s. Ud over tid er to yderligere vigtige faktorer dybden af kanylen og muligheden for at indføre luft emboli fra perfusionsapparatet. Derfor bør kanylen rykkes ind i den opstigende aorta for ikke at komme ind i aortaroden og blokere aortaklappen, hvilket ville forringe perfusionen af kransekarrene.
Under fordøjelsesprocessen er det vigtigt regelmæssigt at teste hjertets stivhed for at undgå langvarig eksponering for fordøjelsesenzymet collagenase, hvilket reducerer hjerte myocyt calciumtolerance. Protokollen er beskrevet ovenfor for calcium genindførelse i den isolerede ventrikulær myocyt kulturer var designet til at begrænse hjerte myocyt død via uhensigtsmæssig calcium tilstrømning via butik drives calcium kanaler. Det skal bemærkes, at den trinvise calcium genindførelse ikke bør udføres for isolerede atrie myocytkulturer, da dette vil fremme celledød under kort- og langsigtet kultur12. For yderligere forsigtighed, perfusion og fordøjelse buffere, der anvendes her omfatter hjertemusklen sammentrækning hæmmer butanedione monoxime (BDM) for at undgå hyperkonference af isolerede myocytter, samt calcium paradoks, som begge påvirker myocyt levedygtighed26. Men skiftet fra BDM til blebbistatin skal bemærkes, da det er den foretrukne anti-kontraktile agent i at opretholde medier for isolerede hjerte myocytter. I data, der ikke er vist, giver blebbistatin større levedygtighed for langsigtet kultur af isolerede hjerte myocytter.
Umiddelbart efter isolation er det vigtigt at overveje konsekvenserne af langvarig kultur af hjerteceller, især myocytter. Den hjerte ikke-myocyt isolation og dyrkning protokol, der er beskrevet her, er baseret på fælles metoder, der drager fordel af de forskellige tætheder og klæbende egenskaber af forskellige hjerteceller. Fordelen ved ikke-myocytter er deres høje ekspansionspotentiale i kulturen; således, i modsætning til hjerte myocytter, de er modtagelige for passaging for fastholdelse. Det er dog kendt, at dyrkningsbetingelser, herunder medium tilskud med FBS, kan påvirke hjerte myocytfunktionalitet27. De kulturmedier, der er beskrevet her, var designet til at optimere levedygtigheden og begrænse funktionelle sindsforvirring, især for de isolerede atrie myocytter. Mens ingen åbenlys nedsat kontraktil evne blev observeret i isolerede hjerte myocytter efter kultur i mangel af blebbistatin tilskud, undersøgelser, der fokuserer på elektrofysiologi, kontraktilitet, og andre enkelt-celle in vivo-baserede molekylære signalering bør udføres kort efter isolation, når den sarkomeriske struktur og molekylære signatur stadig efterligner den intakte hjerte.
Et kendetegn ved atrie myocyt er dens evne til at måneskin som en endokrine celle med enorm sekretorisk kapacitet, ud over deres kontraktile funktion. Under fysiologiske forhold producerer atrie myocytter store mængder ANP, som opbevares i det endoplasmiske reticulum og i store tætte kerne sekretoriske granulater klar til reguleret exocytose ved modtagelse af en stimulus16,17. Mens mange isolerede atrie myocyt undersøgelser fokuserer på deres unikke elektrofysiologiske egenskaber, dette er den første undersøgelse til at designe en kultur medier. Dette giver mulighed for langsigtet levedygtighed samt fremme af de vedligeholdte funktioner endokrine og kontraktile egenskaber atrie myocytter. Denne nye metode til dyrkning, samt samtidig isolering af alle celletyper fra atrie- og ventrikulære kamre fra et enkelt musehjerte, vil være nyttig og effektiv til undersøgelser af de fysiologiske og patofysiologiske egenskaber hos både atrie- og ventrikulære myocytter.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
E.A.B. blev støttet af National Institutes of Health (1F31HL140850), ARCS Foundation, Inc., San Diego kapitel, og er en Rees-Stealy Research Foundation Phillips Gausewitz, MD Scholar af SDSU Heart Institute. E.A.B. og A.S.B. blev støttet af Inamori Foundation. CCG af (NIH) tilskud R01 HL135893, R01 HL141463 og HL149931.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (-)-Blebbistatin | Sigma-Aldrich | B0560 | |
| 1 Liter Water Jacketed Reservoir | Radnoti | 120142-1 | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| 5-0 Silk Suture Thread | Fine Science Tools | 18020-50 | |
| Adenosine | Sigma-Aldrich | A9251 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A6003 | |
| Bubble Trap Compliance Chamber | Radnoti | 130149 | |
| Calcium Chloride Anhydrous | Fisher Scientific | C614-500 | |
| Carnitine hydrochloride | Sigma-Aldrich | C9500 | |
| Collagenase type 2 | Worthington Biochemical Corporation | LS004176 | |
| Creatine | Sigma-Aldrich | C0780 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D2915 | |
| DMEM/F12 (1:1; 1X) | Gibco | 11330-032 | |
| Dumont #7 - Fine Forceps | Fine Science Tools | 11274-20 | |
| Epifluorescent micropscpe | Olympus X70 | IX70 | |
| Fetal Bovine Serum (Heat Inactivated) | Omega Scientific | FB-12 | Lot# 206018 |
| Fine Scissors - Sharp | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Headband Magnifiers | Fine Science Tools | 28030-04 | |
| Hemacytometer (Bright-Line) | Hausser Scientific | 1475 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Inosine | Sigma-Aldrich | I4125 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-X | Gibco | 51500-056 | |
| Isotemp 105 Water Bath | Fisher Scientific | NC0858659 | |
| Isotemp 3006 | Fisher Scientific | 13-874-182 | |
| Joklik Modified Minimum Essential Media | Sigma-Aldrich | M-0518 | |
| Laminin (Natural, Mouse) | Gibco | 1795024 | Lot# 1735572 |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G8540 | |
| Masterflex C/L Single-Channel Variable-Speed Compact Pump | Cole-Palmer | EW-77122-24 | |
| Minimum Essential Medium (MEM 1X) | Gibco | 12350-039 | |
| Molecular Biology Grade Water | Corning | 46-000-CM | |
| Pen Strep Glutamine (100X) | Gibco | 10378-016 | |
| Spring Scissors - 6mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15020-15 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T-8691 |
References
- Peter, A. K., Bjerke, M. A., Leinwand, L. A. Biology of the cardiac myocyte in heart disease. Molecular Biology of the Cell. 27 (14), 2149-2160 (2016).
- Kruppenbacher, J. P., May, T., Eggers, H. J., Piper, H. M. Cardiomyocytes of adult mice in long-term culture. Naturwissenschaften. 80 (3), 132-134 (1993).
- Ackers-Johnson, M., et al. A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart. Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).
- Jin, J. K., et al. ATF6 decreases myocardial ischemia/reperfusion damage and links ER stress and oxidative stress signaling pathways in the heart. Circulation Research. 120 (5), 862-875 (2017).
- Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. (114), e54012 (2016).
- Li, D., Wu, J., Bai, Y., Zhao, X., Liu, L. Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy. Journal of Visualized Experiments. (87), e51357 (2014).
- O'Connell, T. D., Ni, Y. G., Lin, K. M., Han, H. P., Yan, Z. Isolation and culture of adult cardiac myocytes for signaling studies. AfCS Research Reports. 1 (5), 1-9 (2003).
- Pinz, I., Zhu, M., Mende, U., Ingwall, J. S. An improvised isolation procedure for adult mouse cardiomyocytes. Cell Biochemistry and Biophysics. 61 (1), 93-101 (2011).
- Piper, H. Culturing of calcium stable adult cardiac myocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 14 (7), 397-412 (1982).
- Shioya, T. A simple technique for isolating healthy heart cells from mouse models. Journal of Physiological Sciences. 57 (6), 327-335 (2007).
- Omatsu-Kanbe, M., Yoshioka, K., Fukunaga, R., Sagawa, H., Matsuura, H. A simple antegrade perfusion method for isolating viable single cardiomyocytes from neonatal and aged mice. Physiological Reports. 6 (9), 13688 (2018).
- Jansen, H. J., Rose, R. A. Isolation of Atrial Myocytes from Adult Mice. Journal of Visualized Experiments. (149), e59588 (2019).
- Yao, C., et al. Enhanced Cardiomyocyte NLRP3 Inflammasome Signaling Promotes Atrial Fibrillation. Circulation. 138 (20), 2227-2242 (2018).
- Cha, Y., Redfield, M. M., Shen, W., Gersh, B. J. Atrial Fibrillation and Ventricular Dysfunction: A Vicious Electromechanical Cycle. Circulation. 109 (23), 2839-2843 (2004).
- Issa, O., et al. Left atrial size and heart failure hospitalization in patients with diastolic dysfunction and preserved ejection fraction. Journal of Cardiovascular Echography. 27 (1), 1-6 (2017).
- de Bold, A. J. Atrial natriuretic factor: a hormone produced by the heart. Science. 230 (4727), 767-770 (1985).
- McGrath, M. F., de Bold, M. L., de Bold, A. J. The endocrine function of the heart. Trends in Endocrinology and Metabolism. 16 (10), 459-477 (2005).
- Doevendans, P. A., Daemen, M. J., de Muinck, E. D., Smits, J. F. Cardiovascular phenotyping in mice. Cardiovascular Research. 39 (1), 34-49 (1998).
- Banerjee, I., Fuseler, J. W., Price, R. L., Borg, T. K., Baudino, T. A. Determination of cell types and numbers during cardiac development in the neonatal and adult rat and mouse. American Journal of Physiology. 293, 1883-1891 (2007).
- Jugdutt, B. I. Ventricular remodeling after infarction and the extracellular collagen matrix: when is enough enough. Circulation. 108, 1395-1403 (2003).
- Omatsu-Kanbe, M., et al. Identification of cardiac progenitors that survive in the ischemic human heart after ventricular myocyte death. Scientific Reports. , 7 (2017).
- Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485, 599-604 (2012).
- Limana, F., et al. bcl-2 overexpression promotes myocyte proliferation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 6257-6262 (2002).
- Pinto, A. R., et al. Revisiting cardiac cellular composition. Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2015).
- Chen, W., Frangogiannis, N. G. The role of inflammatory and fibrogenic pathways in heart failure associated with aging. Heart Failure Reviews. 15, 415-422 (2010).
- Daly, M. J., Elz, J. S., Nayler, W. G. Contracture and the calcium paradox in the rat heart. Circulation Research. 61 (4), 560-569 (1987).
- Li, Z., Sharma, R. V., Duan, D., Davisson, R. L. Adenovirus-mediated gene transfer to adult mouse cardiomyocytes is selectively influenced by culture medium. Journal of Gene Medicine. 5 (9), 765-772 (2003).
