Summary
En metode er beskrevet for samtidig isolering av myocytter og ikke-myocytter fra både atria og ventrikler av et enkelt voksent mushjerte. Denne protokollen resulterer i konsistente utbytter av svært levedyktige hjerte myocytter og ikke-myocytter og detaljer optimale cellespesifikke kulturforhold for fenotyping og in vitro analyse.
Abstract
Isolasjon og dyrking av hjerte myocytter fra mus har vært avgjørende for å fremme forståelsen av hjertefysiologi og patofysiologi. Mens isolere myocytter fra neonatal mus hjerter er relativt grei, myocytter fra den voksne murine hjertet foretrekkes. Dette skyldes at sammenlignet med neonatale celler, voksne myocytter mer nøyaktig rekafulere cellefunksjon som det skjer i det voksne hjertet in vivo. Det er imidlertid teknisk vanskelig å isolere voksne mus hjerte myocytter i de nødvendige mengder og levedyktighet, noe som bidrar til en eksperimentell uførhet. Videre er publiserte prosedyrer spesifikke for isolering av enten atrie- eller ventrikulære myocytter på bekostning av atrie- og ventrikulære ikke-myocyttceller. Beskrevet her er en detaljert metode for å isolere både atrie- og ventrikulære hjerte myocytter, sammen med atrie- og ventrikulære ikke-myocytter, samtidig fra et enkelt musehjerte. Også gitt er detaljene for optimale cellespesifikke kulteringsmetoder, noe som forbedrer celle levedyktighet og funksjon. Denne protokollen tar sikte på ikke bare å fremskynde prosessen med voksen murine hjertecelleisolasjon, men også å øke utbyttet og levedyktigheten til celler for undersøkelser av atrie- og ventrikulære hjerteceller.
Introduction
Primær cellekultur er en integrert ressurs som tilbyr et kontrollert miljø for detaljerte mekanistiske studier av hjerte myocyttfunksjon. På grunn av deres mer holdbare natur og enkel isolasjon, neonatal rotte atrie- og ventrikulære myocytter har vært den vanlige kilden til slike cellekulturer1. Imidlertid er voksne mus atrie- og ventrikulære myocytter (AMAMer og AMVMer) svært ønskelig for in vitro-studier, fordi deres molekylære og funksjonelle egenskaper bedre etterligner de av voksne hjerteceller. Dermed har de blitt relevante for studier relatert til hjertesykdommer, hvorav de fleste utvikler seg hos voksne2.
Videre utvider tilgjengeligheten og bruken av transgene og sykdomsmusmodeller nytten av isolerte voksne hjerte myocytter. Protokoller for isolasjon og kultur av mus AMVMs for kortsiktige og langsiktige studier har blitt beskrevet i en rekke tidligerepublikasjoner 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11. Til sammenligning er det beskrevet få protokoller for isolering av AMAMer. Videre er de som er beskrevet primært optimalisert for akutte studier av nyisolerte celler, uten langsiktig kulteringsprotokoll beskrevettil dags dato 11,12,13. Som sådan ble AMAM isolasjonsprotokoller ikke utformet for å gi verktøyet og allsidigheten til publiserte protokoller for isolasjon og kultur av AMVMer. Videre, mens de banebrytende studiene for isolering av AMAMer og AMVMer har vist seg ressurssterke, er det ingen protokoller for optimal samtidig isolasjon og kultur av både AMAMer og AMVMer, noe som resulterer i effektiv bruk av hele hjertet for hver forberedelse.
Inntil nå, publisert AMAM og AMVM isolasjon protokoller ble ikke utformet for samtidig isolering av begge celletyper, fordi de fleste studier på atrie- og ventrikulær funksjon har et kammerspesifikt fokus. For eksempel brukes AMMAMer hovedsakelig til å studere atrie myocyttelektrofysiologi, delvis på grunn av interessen for atrieflimmer (AF), den vanligste hjertearytmien i USA. AF er imidlertid ikke en sykdom som påvirker atriene isolert, og det har vært innblandet som å ha en årsaksrolle i mild til alvorlig venstre ventrikkel dysfunksjon14. Videre har elektrokardiogrammer fra pasienter med hjertesvikt med bevart ejeksjonsfraksjon (HFpEF) illustrert at venstre atriestørrelse er en av de sterkeste prediktorene for mottakelighet forhjertesvikt 15.
I tillegg til sin rolle i elektrofysiologi og kontraktilitet, atriumet er også en endokrin organ, utskiller cardiokines (det vil si atrie natriuretic peptid [ANP]) som homeostatisk regulere blodtrykk og volum16,17. Videre har ANP (antagelig fra atrie myocytter) en fremtredende beskyttende og anti-hypertrofisk rolle i ventrikulære myocytter16,17. Mens det er en sterk implikasjon av neurohormonal kommunikasjon mellom atria og ventrikler i ulike sykdomsstater, mekanismene som ligger til grunn for denne kommunikasjonen har ikke blitt fullt ut utforsket. Dette punktet er ytterligere eksemplifisert av økningen i forskning med fokus på 1) rollen som ikke-myocytter (spesielt hjertefibroblaster og immunceller) i det syke hjertet og 2) hvordan hjerteombygging som en funksjon av sykdommen direkte påvirker hjerte myocyte levedyktighet og global hjertefunksjon18,19,20,21,22. Dermed er det å studere hjerteceller fra både atria og ventrikler en nødvendig tilnærming for å få et mer komplett bilde av deres roller i hjerteveiofysiologi.
Følgende protokoll beskriver samtidig isolering av atrie- og ventrikulære myocytter og ikke-myocytter fra et enkelt musehjerte under fysiologiske og patofysilogiske forhold. I tillegg er denne metoden den første til å beskrive optimale forhold som er nødvendige for å opprettholde kulturer av atriehjerte myocytter, da forholdene for å opprettholde kulturer av ventrikulære myocytter allerede er publisert.
Protocol
All forskning utført på mus rapportert i denne artikkelen har blitt gjennomgått og godkjent av SDSU Institutional Animal Care and Use Committee, og det er i samsvar med Guide for care and use of Laboratory Animals utgitt av National Research Council.
1. Utarbeidelse av isolasjon og kultur media og plating
- Forbered 1 l hjerteperfusjonsmedier før bruk ved å tilsette Joklik modifiserte minimum essensielle medier (MMEM) til 1 L sterilt vann. Juster pH til 7,36 med 10 N NaOH, filtrer deretter gjennom et 0,2 μm filter og oppbevar ved 4 °C i opptil 2 uker.
MERK: Joklik MMEM består av 112 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 1 mM MgCl2,9 mM NaH2PO4og 11,1 mM D-glukose. Dette suppleres med 10 mM HEPES (2,38 g/l), 30 mM taurin (3,75 g/l), 2 mM D-l-karnitin (0,4 g/l), 2 mM kreatin og 10 mM butanedione monoksim (1,01 g/l). - Forbered fordøyelsesbufferen like før perfusjon, som følger: supplere 50 ml hjerteperfusjonsmedier med 6,25 μL på 100 mM CaCl2 (se trinn 1.3) og kollagnase type 2 (enzymatisk aktivitet ~ 310-320 U / mg dw).
MERK: Vei dyret før offer. Mengden kollagnase type 2 supplert inn i fordøyelsesbufferen dikteres av dyrets vekt (2,25 mg kollagnase type 2 per 1 g kroppsvekt). - For å forberede 100 mM CaCl2, tilsett 1,47 g CaCl2 til 100 ml molekylærbiologi grade vann. Rør til oppløst, deretter passere gjennom en 0,2 μm filter og lagre ved romtemperatur i opptil 2 måneder.
- Forbered myocyttstoppbuffer 1 ved å supplere 90 ml hjerteperfusjonsbuffer med 10 ml føtal storfeserum (FBS) og 125 μL på 100 mM CaCl2. Pass gjennom et 0,2 μm filter og oppbevar ved 4 °C i opptil 2 uker.
- Forbered myocyttstoppbuffer 2 ved å supplere 114 ml hjerteperfusjonsbuffer med 6 ml FBS og 150 μL på 10 mM CaCl2. Pass gjennom et 0,2 μm filter og oppbevar ved 4 °C i opptil 2 uker.
- Forbered atriemyocyttplating medium like før perfusjon ved å supplere 95 ml Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM) med 4 ml FBS, 1 ml 100x penn / strep-glutamin, 1 ml 100x insulin-transferrin-selen og 1 ml 10 μM deksametason. Pass gjennom et 0,2 μm filter og oppbevar ved 37 °C til det er plating.
- Forbered ventrikulær myocyttplating medium ved å supplere 95 ml minimum essensiell medium (MEM) med 4 ml FBS, 1 ml 100x penn/ strep-glutamin, 10 ml 1 M HEPES-oppløsning, 1 ml 100x insulin-transferrin-selen og 0,1 g butanedione monomexime. Pass gjennom et 0,2 μm filter og oppbevar ved 4 °C i opptil 2 uker.
- Forbered ventrikulær myocytt opprettholde medium ved å supplere 99 ml MEM med 1 ml 100x insulin-transferrin-selen, 0,1 mg / ml storfe serum albumin (BSA), 10 ml 1 M HEPES løsning og 1 ml 100x penn / strep-glutamin. Pass gjennom et 0,2 μm filter og oppbevar ved 4 °C i opptil 2 uker.
- For å forberede lamininbelagte eksperimentelle plater og lysbilder, tin musen laminin lager oppløsning (1,19 mg / ml). Tilsett 10 μL laminin lagerløsning til hver 1 ml DMEM, og bland. Coat eksperimentelle plater og glir jevnt og oppbevares i en 37 °C, 5% CO2 inkubator i minst 1 time før perfusjon for å tillate likevekt.
MERK: Belagte eksperimentelle plater og lysbilder kan oppbevares ved 4 °C i opptil 2 dager.
2. Isolasjonsapparat
- Før hver isolasjon, rengjør slangen og andre komponenter i systemet med tre komplette vasker på 70% EtOH ved å fylle boblefellen til toppen (lukk av den nederste stoppekranen og hold den øverste stoppekranen åpen).
- Skyll hele systemet 3x med steril H2O ved å fylle boblefellen til toppen (lukk den nederste stoppekranen og hold den øverste stoppekranen åpen).
- Skyll ut hele systemet med hjerteperfusjonsbuffer og fyll boblefellen halvveis med media.
- Sett det sirkulerende vannbadet til 37 °C.
- Sett et vannbad for media til 37 °C.
- Fjern eventuelle luftbobler i den peristaltiske pumpeslangen.
- Juster strømningshastigheten til den peristaltiske pumpen til 3 ml/min.
3. Kirurgisk prosedyre (ikke-overlevelse)
- Suge kirurgiske instrumenter i 70% EtOH i minst 5 min.
- Plasser hjerteperfusjonsmediet, myocytestoppbufferne og fordøyelsesbufferen i vannbadet på 37 °C.
- Plasser atrie myocyttplating medium, ventrikulær myocytt plating medium, og ventrikulær myocyte opprettholde medium i en 37 °C, 5% CO2 inkubator 1 t før bruk og løsne caps for å tillate likevekt.
- Injiser 10 uker gamle hann- eller hunnmus C57b6/j mus intraperitonealt (i.p.) med 0,35 ml heparin, fortynnet i fosfatbufret saltvann (PBS) til 100 IE/ml. La stoffet tre i kraft i ca 10 min.
MERK: Hvis to hjerter skal utsettes for denne isolasjonsprosedyren, kan den andre musen bedøves og administreres heparin på dette punktet i den første prosedyren. For å minimere stress på dyret, kan lettbedøvelse administreres ved hjelp av 2% isofluran / oksygenblanding i et hermetisk forseglet induksjonskammer. - Bedøve dyret med en 2% isofluran/oksygenblanding og injiser i.p. med pentobarbital (0,3 ml fra 10 mg/ml lager), og klargjør deretter brystet ved å vattpinne med 70 % EtOH.
- Forbered en bundet 5-0 silkesutur for å være klar til å ligate hjertet til perfusjonsmetulatet. Mount kanyle rett ved siden av kirurgisk mikroskop.
- Åpne raskt brystet ved først å lage et midtlinjet hud snitt, fra midten av magen til kjeven, og deretter inn i bukhinnen med den store saksen, rydde membranen bort ved sløv disseksjon. Klipp deretter bort brystkassen ved hjelp av saksen med kutt opp brystveggen på side aspektet av begge sider.
- Klipp bort fibrøse forbindelser mellom hjertet og brystveggen (inkludert thymus). Klipp deretter bort brystkassen sammen. Bruk de små tang og saks, løft forsiktig hjertet av toppunktet og utsett det bakre aspektet av hjertet.
- Uttuk hjertet ved å dissekere umiddelbart dårligere enn den innotiske arterien på den stigende aortaen og legg umiddelbart hjertet i iskalde PBS eller kaldt hjerteperfusjonsmedier. Deretter dissekerer du raskt bort gjenværende vev fra det skråhjertet i iskalde hjerteperfusjonsmedier, og eksponerer den stigende aortaen.
MERK: Det er nyttig å utforske hjertet med thymus intakt å bruke som et anatomisk landemerke. - Rengjør området rundt aorta av overflødig vev ved hjelp av mikro-dissekere tang og saks. Plasser aorta på kanylen ved hjelp av fin-tipped tang og fest med en 5-0 silke sutur.
MERK: Den beste plasseringen skjer vanligvis med aorta som strekker seg ca 2 mm opp på kanylen. - Perfuse det hermetiske hjertet med hjerteperfusjonsmedier med en strømningshastighet på 3 ml/min i 4 min. Bytt deretter mediet fra hjerteperfusjonsmedier til fordøyelsesbuffer i 15,0-17,5 min perfusjon (figur 1A).
MERK: Koronar strømningshastighet vil trolig øke, noe som indikerer effektiv vevsfordøyelse (det vil si blek, hovent hjerte). - Samle 8 ml fordøyelsesbuffer strømmer gjennom i løpet av de siste minuttene av perfusjon for senere bruk i trinn 5.4.
- Fjern hjertet fra kanylen og legg det på en 60 mm plastkulturrett. Fjern overflødig vev (det vil at aorta, årer) og senk hjertet ned i 2,5 ml fordøyelsesbuffer som forberedelse til mekanisk separasjon.
MERK: På dette punktet blir atriaene dissekert bort, og en eksperimenterer bør gjennomføre atriecelleisolasjonsprotokollen, mens en annen eksperimenterer skal utføre ventrikulær celleisolasjon.
4. Atriecelleisolasjon og kultur
- Disseker atriaene vekk fra hjertet og legg den i en 30 mm plastkulturrett. Senk den ned i 0,75 ml fordøyelsesbuffer for mekanisk separasjon. Oppbevar ventriklene i 60 mm parabolen (trinn 3.12) og utfør de separate isolasjonsmetodene samtidig (avsnitt 5, figur 1B).
MERK: På dette punktet kan atria- og ventriklene gjennomgå ytterligere separasjon hvis det er behov for å isolere venstre- og høyresiden celler. - Begynn å hakke og erte atria fra hverandre, først med fin-tip kirurgisk saks og etterfulgt av fine tang for videre hakking. Unngå å røre vevet, og ikke trekk raskt fra hverandre muskelfibre.
- Bruk en steril overføring pipette tips, fortsett å forsiktig blande og dissosiere vevet i 15 min. Hver 5 min, observere atriemyocytt disassociation fra vev under en 10x objektiv brightfield mikroskop. Etter hvert som vevet blir ytterligere fordøyd, fortsett å blande og dissosiere vev forsiktig ved hjelp av en steril overføringspipettespiss med en mindre porestørrelse.
- Overfør cellefjæring til et 2 ml sterilt mikrosentrigerrør. Skyll 30 mm platen med 0,75 ml 37 °C myocyte stoppebuffer 1 og kombiner med cellefjæringen (sluttvolum = 1,5 ml).
- La atriemyocytter sediment av tyngdekraften i 10 min ved romtemperatur. Rør forsiktig cellesuspensjonen slik at myocytter sedimenterer til bunnen av det koniske røret, og danner en synlig pellet.
- Sentrifuger cellefjæringen i 5 min ved 20 x g. Fjern forsiktig det overnaturlige, som inneholder de ikke-myocytter, og overføre til en 15 ml polypropylen konisk rør ved hjelp av en steril pipette tips uten å forstyrre pellet av atrie myocytter.
- Sentrifuge ikke-myocyte fraksjonen i 5 min ved 20.000 x g. Aspirer den overnaturante og resuspend ikke-myocyte pellet i 10 ml DMEM supplert med 10% fosterkalv serum (FCS).
- Telle ikke-myocytter ved hjelp av et hemocytometer eller annen metode, deretter plate i henhold til eksperimentelle behov, eller ytterligere isolere i individuelle spesifikke cellepopulasjoner via fluorescens-aktivert celle sortering (Figur 1C).
- Resuspend pellet av isolerte atrie myocytter fra trinn 4,6 i 1 ml atrie myocytt plating medium og bruke 10 μL av denne suspensjonen på et hemocytometer. Utfør et celleantall av stangformede myocytter per felt.
- Aspirer laminin fra precoated eksperimentelle plater / lysbilder og resuspend de isolerte atriemyocytter i riktig volum av atriemyocytt plating medium supplert med 25 μM blebbistatin. Plate ved ønsket tetthet per eksperimentelle behov (figur 1C).
MERK: Typisk plating tetthet for den langsiktige dyrking beskrevet her er 5 x 10 5 celler /kammer på fire-kammer (1,7 cm2) glass lysbilder.
5. Ventrikulær celleisolasjon og kultur
- Begynn å hakke og erte hjerte fra hverandre ventrikulært vev, først med fin-tip kirurgisk saks og etterfulgt av fine tang for videre hakking (Figur 1B). Unngå å røre vevet ved raskt å trekke fra hverandre muskelfibre.
- Overfør cellefjæringen til et konisk rør i 15 ml polypropylen. Skyll platen med 2,5 ml 37 °C myocyte stoppebuffer 1 og kombiner med cellefjæringen (sluttvolum = 5 ml).
- Bruk en steril overføring pipette tips, fortsett å forsiktig blande og dissosiere vevet i 4 min. Påfør 10 μL av denne cellesuspensjonen på lysbildet og visualiser tilstedeværelsen av stangformede myocytter for å sikre kvaliteten på isolasjonen.
- Før cellefjæringen gjennom et 100 μm sterilt nylonfilter inn i et 50 ml konisk rør i polypropylen. Bruk 2 ml fordøyelsesbuffer samlet i trinn 3.12 for å vaske eventuelle gjenværende celler av det sterile nylonfilteret.
- La ventrikulære myocytter sediment av tyngdekraften i 6 min ved romtemperatur. Rør forsiktig den filtrerte cellefjæringen for å tillate myocytter å sedimentere på bunnen av konisk, og danner en synlig pellet.
- Uten å forstyrre pellet av ventrikulære myocytter, fjern forsiktig supernatant (ikke-myocytter) og overfør til et 50 ml polypropylen konisk rør ved hjelp av en steril pipettespiss. Sentrifuge ikke-myocyte fraksjonen i 5 min ved 20.000 x g. Aspirer den overnaturante og resuspend ikke-myocyte pellet i 10 ml DMEM supplert med 10% FCS.
- Telle ikke-myocytter ved hjelp av et hemocytometer og resuspend i et passende volum av DMEM supplert med 10% FCS. Deretter plate i henhold til eksperimentelle behov, eller ytterligere isolere i individuelle spesifikke cellepopulasjoner via fluorescens-aktivert celle sortering (Figur 1C).
- Gjenoppsus de isolerte ventrikulære myocytter i 2 ml myocytt stoppe buffer 2 og bruke 10 μL celle suspensjon på hemocytometer. Utfør et celleantall av stangformede myocytter per felt.
- Gjeninnføring av Ca2+ ved hjelp av et trinnvis paradigme
MERK: Kalsiumretroduksjonstrinn er spesifikke for ventrikulære myocytter og bør ikke utføres for atrie myocytter, da dette vil resultere i celledød.- Tilsett 50 μL på 10 mM CaCl2 i ventrikulær myocyttcelleoppheng. Bland godt og inkuber i 4 min ved romtemperatur.
- Tilsett ytterligere 50 μL på 10 mM CaCl2 i ventrikulær myocyttcelleoppheng. Bland godt og inkuber i 4 min ved romtemperatur.
- Tilsett ytterligere 100 μL på 10 mM CaCl2 i ventrikulær myocyttcellesuspensjon. Bland godt og inkuber i 4 min ved romtemperatur.
- Tilsett 80 μL på 100 mM CaCl2 i ventrikulær myocyttcelleoppheng. Bland godt og inkuber i 4 min ved romtemperatur.
- Fjern lamininbelegg fra plater eller lysbilder og gjenoppliv de isolerte ventrikulære myocytter i et passende volum ventrikulært myocyttplating medium i henhold til eksperimentelle behov (figur 1C).
MERK: Typisk plating tetthet for den langsiktige dyrking beskrevet her er 5 x 10 5 celler /kammer på fire-kammer (1,7 cm2) glass lysbilder. Unngå plating med en tetthet på større enn 75% samløpet, som cellulær over-tetting fremmer celleklumping, og dermed hemme vedlegg til platen. Videre vil et stort antall celler gå tapt under den første mediumendringen. Plateceller raskt etter isolasjon, som ekstracellulær Ca2 + fremmer hyperkontraksjon og tap av levedyktige myocytter. - La ventrikulære myocytter bosette seg og holde seg i minst 1 time. Deretter endrer du media til ventrikulær myocytt opprettholde medium supplert med 25 μM blebbistatin.
MERK: Ventrikulære myocytter kan dyrkes opp til 96 timer etter plating i μM blebbistatin. Eksperimenter bør utføres i ventrikulær myocytt opprettholde medium i fravær av blebbistatin.
Representative Results
En wildtype 10-ukers gammel C57b6/j mus hjerte resulterer vanligvis i mellom 75,000-150,000 atrie myocytes og 1,0-1,5 x 106 ventrikulære myocytter, tilsvarer et omtrentlig utbytte på 30 %−50 % for atrie- og ventrikulære myocytter18,19. Under og umiddelbart etter isolasjoner, bør levedyktige hjerte myocytter vises stangformet og ikke-kontrahering. Et flertall av isolerte hjerte myocytter bør tilpasse denne morfologien, noe som er en indikasjon på effektiv perfusjon. Den stangformede morfologien kan også være en prediktor for levedyktighet. Protokollen tar sikte på å forbedre utbyttet og levedyktigheten til myocytter og ikke-myocytter isolert fra et sykt musehjerte. Videre har det blitt testet i en modell av trykkoverbelastningsindusert hjertesvikt (data ikke vist).
For å bekrefte tilstrekkelig og replikerbar isolering av myocytter og ikke-myocytter fra atrie- og ventrikulært vev, ble celler observert og fotografert på ulike dager i kultur (figur 2). I tillegg ble kvantitativ reverstranskripsjon polymerasekjedereaksjon (qRT-PCR) utført for å måle nivåene av transkripsjoner som var celletypespesifikke. Hjertemuskeltroponin T (Tnnt2) er en markør for hjerte myocytter og ble robust uttrykt i både atrie- og ventrikulær hjerte myocytt kulturer (Figur 3A). I motsetning, atriende natriuretic peptid (Nppa, som vanligvis uttrykkes utelukkende i voksen atriehjerte myocytter under fysiologiske forhold) og myosin lys kjede 2 (Myl2, som er en ventrikulær myocyte bestemt gen) var robust og spesielt uttrykt i atrie- og ventrikulær hjerte myocytt kulturer, henholdsvis (Figur 3B, C).
Fibroblastmarkører, transkripsjonsfaktor 21 (Tcf21), blodplate-avledet vekstfaktorreseptor A (Pdgfra)og monocyttavledet cellemarkørklynge av differensiering 68 (Cd68) ble utelukkende uttrykt i ikke-myocyttkulturer isolert fra både atrie- og ventrikulære kamre (figur 3D−F). Det er anslått at ikke-myocytter kompromiss ~ 65% av alle hjerteceller, og at et flertall av disse stammer fra en fibroblast eller monocytt-avledet avstamning18,19,23,24. Dermed ble markører for disse to avstamningene valgt å være representative, gitt interessen for disse cellulære populasjonene i studier av ulike modeller og etiologier av hjertesykdom.
Immunstaining av AMAMer og AMVMer for t-tubule markør dihydropyridin (DHPR, som er en spenningsavhengig (L)-type kalsiumkanal) samt ryanodine reseptoren (RYR2) demonstrert intakt t-tubuli gjennom isolasjon og langsiktig kultur (Figur 4A, B). Overflod av DHPR og lokalisering som var karakteristisk og unik for atrie- og ventrikulære myocytter indikerte tilstedeværelsen av t-tubuli. Videre var colocalization av DHPR med RYR2 immunstaining en indikator på intakte diadstrukturer. Immunstaining for sarkomerisk protein alfa-actinin i atrie- og ventrikulære hjerte myocytter resulterte i forventet sarkomerisk striasjonsmønster. Den sarkomeriske striasjonsmønsteret ble brukt til å vurdere renheten og levedyktigheten til isolerte hjerte myocytter i forbindelse med stangformet morfologiske form og kjernefysisk farging med TOPRO-3 (figur 4C, D; lilla og rød). Som forventet var ventrikulære hjerte myocytter store, med en gjennomsnittlig lengde på ~ 150 mm, mens atriehjertemocytter i gjennomsnitt ~ 75 mm. Videre, ved immunstaining analyse, atriende hjerte myocytter (men ikke ventrikulære hjerte myocytter) viste robust uttrykk for atriende natriuretic peptid (ANP) i et fargingsmønster som var karakteristisk for lokalisering til endoplasmaisk reticulum og sekretorisk granulat (Figur 4C, D; grønn).
En karakteristisk unik for atriende hjertemyocytter er klassifiseringen som en endokrin celle i tillegg til kontraktile celle. Mens atriemyocytter utskiller ANP under basale forhold, øker sekresjonen som svar på secretagogues (det vil si alfa-adrenerge agonist, fenylefrin [PE]). Videre, atriende hjerte myocytter utskiller ANP og co-secretionally behandle en del av hormonet fra sin forløper tilstand (Pro-ANP, 15 kD) til produktet peptid (ANP 3kD)16,17. Denne sekretoriske evnen kan kvantifiseres via immunoblot påvisning av ANP i media av isolerte atriehjerte myocytter som svar på akutt PE-behandling (figur 4E). Denne sekretoriske og behandlingsevnen til atriehjertemocytten ble funnet å være følsom for kultiveringsforhold. Dermed er det viktig at atrie myocyttplatingmediet suppleres med deksametason, insulin, transferrin og selen.
Figur 1: Skjematisk oversikt over retrograd hjerteperfusjon, fordøyelse og celleisolasjon. Vist er de viktigste trinnene involvert i celleisolasjon fra både atrie- og ventrikulære kamre samtidig fra et enkelt musehjerte. (A) Et enkelt musehjerte er raskt hermetisert via stigende aorta og perfused på en retrograd måte. (B)Hjertet er separert i atrie- og ventrikulært vev for videre fordøyelse og fysisk separasjon. (C)Etter tilstrekkelig fordøyelse, cellene er skilt via tyngdekraften filtrering i totalt fire cellulære fraksjoner som er dyrket for påfølgende eksperimentering. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Morfologisk analyse av isolerte atrie- og ventrikulære hjerte myocytter og ikke-myocytter i kulturen. (A)Isolerte voksne mus atrie myocytter (AMAMs),(B) voksen mus atrie ikke-myocytter (AMANMs),(C) voksen mus ventrikulære myocytter (AMVMs), eller (D) voksne mus ventrikulære ikke-myocytter (AMVNMs) ble belagt ved 5 x 10 5 celler /kammer på fire-kammer (1,7 cm2) glass lysbilder i respektive belagte medier. Fasebilder ble oppnådd ved angitte dager i kultur ved hjelp av et 10x mål under et epifluorescence mikroskop. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Representativ qRT-PCR-analyse av isolerte cellekulturer. RNA ble hentet fra nyisolerte hjerte myocytter og ikke-myocytter, og mRNA nivåer for cellespesifikke genmarkører ble bestemt av qRT-PCR4. (A) Tnnt2, hjertemuskel troponin T (hjerte myocyte markør); (B) Nppa, atrie natriuretisk peptid (atrie myocyte markør); Myl2, myosin lyskjede 2 (ventrikulær myocyttmarkør); (D) Tcf21, transkripsjon faktor 21 (fibroblast markør); (E) Pdgfra, blodplate-avledet vekstfaktor reseptor A (fibroblast markør); (F) Cd68, klynge av differensiering 68 (monocytt-avledet cellemarkør). Data representerer ± SEM (*p ≤ 0,05 forskjellig fra alle andre verdier, som bestemmes av ANOVA etterfulgt av Newman Keuls post-hoc-analyse). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Representativ morfologiske og funksjonelle analyser av isolerte atrie- og ventrikulære hjertelegemer. (A) AMAMer eller (B) AMVMer ble belagt ved 5 x 10 5 celler /kammer på fire-kammer (1,7 cm2) glass lysbilder i respektive plating media for 1 time for å tillate vedheft. Dette ble etterfulgt av enten refeeding atrie myocyte plating media eller bytte til ventrikulær myocyte opprettholde media supplert med blebbistatin for ytterligere 16 timer. Kulturer ble senere fikset deretter immunostained for RYR2 (lilla), DHPR (grønn), og kjernefysisk flekk TOPRO-3 (rød). (C) AMAMer eller (D) AMVMer ble isolert og belagt, deretter immunostained for a-actinin (lilla), ANP (grønn) og TOPRO-3 (rød). Vist er to representative bilder for hver celletype. (E) AMAMs ble belagt på 5 x 105 celler / godt på en 12 brønn kultur parabolen for 16 timer i atrie myocyte plating media. AMMA-er ble senere behandlet i 0,5 timer med kjøretøy eller ANP-secretagogue (fenylefrin, 50 mM) før media ble samlet inn og utsatt for immunoblotanalyse for ANP. Før immunoblotanalyse ble medieprøver sentrifugert ved 500 x g i 5 min for å fjerne cellulært avfall og sikre at den observerte ANP var et resultat av aktiv sekresjon fra AMMamer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Kvaliteten på cellene isolert ved hjelp av prosedyren som er beskrevet her, som bestemt av celleutbyttet og den generelle helsen til cellene i kulturen, avhenger av mange kontrollerbare faktorer. Fra og med selve musen har det blitt dokumentert at stress pålagt dyret kan påvirke celleutbyttet og levedyktigheten i kulturen negativt, antagelig på grunn av overflødig systemisk kortisol, katekolaminer og hyperlevetil tilstand av hjertevev2,5,7. Av disse grunnene bør det treffes tiltak for å unngå å alarmere dyret før offer. Slike tiltak inkluderer å dekke dyrets bur og begrense tiden utenfor vivarium før offer. Heparin og mange barbiturater som vanligvis brukes til eutanasi kan påvirke signalveier; dermed bør den optimale metoden for eutanasi tilpasses tilsvarende. Dyrets alder har en betydelig innvirkning på kvaliteten og levedyktigheten til isolerte celler, mest sannsynlig på grunn av progressiv akkumulering av interstitiell fibrose som oppstår samtidig med aldringsprosessen, noe som kan påvirke vevsfordøyelsen25. I data som ikke presenteres her, mens metoden beskrevet ovenfor virker hos mus på opptil 78 uker gammel, var kvaliteten på cellene lavere hos disse eldre dyrene.
Det mest kritiske trinnet i isolasjonsprosessen som er beskrevet, samt andre protokoller med et Langendorff-apparat for retrogradperfusjon, er hermetuleringen og den første perfusjonen i hjertet. For optimale resultater bør tiden fra hjerteutviding til hermetikk av stigende aorta og initiering av perfusjon ikke ta mer enn 90 s. I tillegg til tid er to ekstra viktige faktorer dybden av kanyle og mulighet for å innføre luft emboli fra perfusjonsapparatet. Ldigvis bør kanylen fremmes inn i stigende aorta for ikke å komme inn i aortaroten og hindre aortaventilen, noe som ville svekke perfusjonen av koronarkarene.
Under fordøyelsesprosessen er det viktig å regelmessig teste stivheten i hjertet for å unngå langvarig eksponering for fordøyelsesenzymcollagenase, noe som reduserer hjerte myocytt kalsiumtoleranse. Protokollen beskrevet ovenfor for kalsiuminnføring i de isolerte ventrikulære myocyttkulturene ble utformet for å begrense hjerte myocyttdød via upassende kalsiumtilstrømning via butikkdrevne kalsiumkanaler. Det bør bemerkes at den trinnvise kalsiumretroduksjonen ikke bør utføres for isolerte atrie myocyttkulturer, da dette vil fremme celledød under kort- og langsiktig kultur12. For ytterligere forholdsregler inkluderer perfusjons- og fordøyelsesbufferne som brukes her, hjertemuskelkontraksjonshemmeren butanedione monoksim (BDM) for å unngå hyperkontraksjon av isolerte myocytter, samt kalsiumparadokset, som begge påvirker myocyttlevelighet26. Imidlertid bør overgangen fra BDM til blebbistatin bemerkes, da det er det foretrukne antikontraktile middelet for å opprettholde medier for isolerte hjerte myocytter. I data som ikke er vist, gir blebbistatin større levedyktighet for langsiktig kultur av isolerte hjerte myocytter.
Umiddelbart etter isolasjon er det viktig å vurdere konsekvensene av langsiktig kultur av hjerteceller, spesielt myocytter. Hjerte-ikke-myocyte isolasjon og culturing protokollen beskrevet her er basert på vanlige metoder som drar nytte av de forskjellige tettheter og selvklebende egenskaper av forskjellige hjerteceller. Fordelen med ikke-myocytter er deres høye ekspansjonspotensial i kultur; dermed, i motsetning til hjerte myocytter, de er mottagelig for passaging for videreføring. Det er imidlertid kjent at kulterende forhold, inkludert middels tilskudd med FBS, kan påvirke hjerte myocytt funksjonalitet27. Kulturmediene som er beskrevet her, ble utformet for å optimalisere levedyktigheten og begrense funksjonelle derangementer, spesielt for de isolerte atrie myocytene. Selv om ingen overt nedsatt kontraktil evne ble observert i isolerte hjerte myocytter etter kultur i fravær av blebbistatin tilskudd, studier som fokuserer på elektrofysiologi, kontraktilitet, og andre encellede in vivo-basert molekylær signalisering bør utføres kort tid etter isolasjon, når sarcomeric struktur og molekylær signatur fortsatt etterligner det intakte hjertet.
Et kjennetegn ved atriemyocytten er dens evne til å måneskinn som en endokrin celle med enorm sekretorisk kapasitet, i tillegg til deres kontraktile funksjon. Under fysiologiske forhold produserer atrie myocytter store mengder ANP, som lagres i endoplasmaisk retikuulum og i store tette sekretoriske granulater klar for regulert eksocytose ved å motta enstimulans 16,17. Mens mange isolerte atrie myocyttstudier fokuserer på sine unike elektrofysiologiske egenskaper, er dette den første studien for å designe et kulturmedie. Dette gir mulighet for langsiktig levedyktighet samt fremme av de vedlikeholdte funksjonene til endokrine og kontraktile egenskaper av atriemyocytter. Denne nye metoden for kultering, samt samtidig isolering av alle celletyper fra atrie- og ventrikulære kamre fra et enkelt musehjerte, vil være nyttig og effektiv for studier på de fysiologiske og patofysilogiske egenskapene til både atrie- og ventrikulære myocytter.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
E.A.B. ble støttet av National Institutes of Health (1F31HL140850), ARCS Foundation, Inc., San Diego Chapter, og er en Rees-Stealy Research Foundation Phillips Gausewitz, M.D. Scholar av SDSU Heart Institute. E.A.B. og A.S.B. ble støttet av Inamori Foundation. CCG av (NIH) gir R01 HL135893, R01 HL141463 og HL149931.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (-)-Blebbistatin | Sigma-Aldrich | B0560 | |
| 1 Liter Water Jacketed Reservoir | Radnoti | 120142-1 | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| 5-0 Silk Suture Thread | Fine Science Tools | 18020-50 | |
| Adenosine | Sigma-Aldrich | A9251 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A6003 | |
| Bubble Trap Compliance Chamber | Radnoti | 130149 | |
| Calcium Chloride Anhydrous | Fisher Scientific | C614-500 | |
| Carnitine hydrochloride | Sigma-Aldrich | C9500 | |
| Collagenase type 2 | Worthington Biochemical Corporation | LS004176 | |
| Creatine | Sigma-Aldrich | C0780 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D2915 | |
| DMEM/F12 (1:1; 1X) | Gibco | 11330-032 | |
| Dumont #7 - Fine Forceps | Fine Science Tools | 11274-20 | |
| Epifluorescent micropscpe | Olympus X70 | IX70 | |
| Fetal Bovine Serum (Heat Inactivated) | Omega Scientific | FB-12 | Lot# 206018 |
| Fine Scissors - Sharp | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Headband Magnifiers | Fine Science Tools | 28030-04 | |
| Hemacytometer (Bright-Line) | Hausser Scientific | 1475 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Inosine | Sigma-Aldrich | I4125 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-X | Gibco | 51500-056 | |
| Isotemp 105 Water Bath | Fisher Scientific | NC0858659 | |
| Isotemp 3006 | Fisher Scientific | 13-874-182 | |
| Joklik Modified Minimum Essential Media | Sigma-Aldrich | M-0518 | |
| Laminin (Natural, Mouse) | Gibco | 1795024 | Lot# 1735572 |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G8540 | |
| Masterflex C/L Single-Channel Variable-Speed Compact Pump | Cole-Palmer | EW-77122-24 | |
| Minimum Essential Medium (MEM 1X) | Gibco | 12350-039 | |
| Molecular Biology Grade Water | Corning | 46-000-CM | |
| Pen Strep Glutamine (100X) | Gibco | 10378-016 | |
| Spring Scissors - 6mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15020-15 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T-8691 |
References
- Peter, A. K., Bjerke, M. A., Leinwand, L. A. Biology of the cardiac myocyte in heart disease. Molecular Biology of the Cell. 27 (14), 2149-2160 (2016).
- Kruppenbacher, J. P., May, T., Eggers, H. J., Piper, H. M. Cardiomyocytes of adult mice in long-term culture. Naturwissenschaften. 80 (3), 132-134 (1993).
- Ackers-Johnson, M., et al. A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart. Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).
- Jin, J. K., et al. ATF6 decreases myocardial ischemia/reperfusion damage and links ER stress and oxidative stress signaling pathways in the heart. Circulation Research. 120 (5), 862-875 (2017).
- Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. (114), e54012 (2016).
- Li, D., Wu, J., Bai, Y., Zhao, X., Liu, L. Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy. Journal of Visualized Experiments. (87), e51357 (2014).
- O'Connell, T. D., Ni, Y. G., Lin, K. M., Han, H. P., Yan, Z. Isolation and culture of adult cardiac myocytes for signaling studies. AfCS Research Reports. 1 (5), 1-9 (2003).
- Pinz, I., Zhu, M., Mende, U., Ingwall, J. S. An improvised isolation procedure for adult mouse cardiomyocytes. Cell Biochemistry and Biophysics. 61 (1), 93-101 (2011).
- Piper, H. Culturing of calcium stable adult cardiac myocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 14 (7), 397-412 (1982).
- Shioya, T. A simple technique for isolating healthy heart cells from mouse models. Journal of Physiological Sciences. 57 (6), 327-335 (2007).
- Omatsu-Kanbe, M., Yoshioka, K., Fukunaga, R., Sagawa, H., Matsuura, H. A simple antegrade perfusion method for isolating viable single cardiomyocytes from neonatal and aged mice. Physiological Reports. 6 (9), 13688 (2018).
- Jansen, H. J., Rose, R. A. Isolation of Atrial Myocytes from Adult Mice. Journal of Visualized Experiments. (149), e59588 (2019).
- Yao, C., et al. Enhanced Cardiomyocyte NLRP3 Inflammasome Signaling Promotes Atrial Fibrillation. Circulation. 138 (20), 2227-2242 (2018).
- Cha, Y., Redfield, M. M., Shen, W., Gersh, B. J. Atrial Fibrillation and Ventricular Dysfunction: A Vicious Electromechanical Cycle. Circulation. 109 (23), 2839-2843 (2004).
- Issa, O., et al. Left atrial size and heart failure hospitalization in patients with diastolic dysfunction and preserved ejection fraction. Journal of Cardiovascular Echography. 27 (1), 1-6 (2017).
- de Bold, A. J. Atrial natriuretic factor: a hormone produced by the heart. Science. 230 (4727), 767-770 (1985).
- McGrath, M. F., de Bold, M. L., de Bold, A. J. The endocrine function of the heart. Trends in Endocrinology and Metabolism. 16 (10), 459-477 (2005).
- Doevendans, P. A., Daemen, M. J., de Muinck, E. D., Smits, J. F. Cardiovascular phenotyping in mice. Cardiovascular Research. 39 (1), 34-49 (1998).
- Banerjee, I., Fuseler, J. W., Price, R. L., Borg, T. K., Baudino, T. A. Determination of cell types and numbers during cardiac development in the neonatal and adult rat and mouse. American Journal of Physiology. 293, 1883-1891 (2007).
- Jugdutt, B. I. Ventricular remodeling after infarction and the extracellular collagen matrix: when is enough enough. Circulation. 108, 1395-1403 (2003).
- Omatsu-Kanbe, M., et al. Identification of cardiac progenitors that survive in the ischemic human heart after ventricular myocyte death. Scientific Reports. , 7 (2017).
- Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485, 599-604 (2012).
- Limana, F., et al. bcl-2 overexpression promotes myocyte proliferation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 6257-6262 (2002).
- Pinto, A. R., et al. Revisiting cardiac cellular composition. Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2015).
- Chen, W., Frangogiannis, N. G. The role of inflammatory and fibrogenic pathways in heart failure associated with aging. Heart Failure Reviews. 15, 415-422 (2010).
- Daly, M. J., Elz, J. S., Nayler, W. G. Contracture and the calcium paradox in the rat heart. Circulation Research. 61 (4), 560-569 (1987).
- Li, Z., Sharma, R. V., Duan, D., Davisson, R. L. Adenovirus-mediated gene transfer to adult mouse cardiomyocytes is selectively influenced by culture medium. Journal of Gene Medicine. 5 (9), 765-772 (2003).
