Summary
En metod beskrivs för samtidig isolering av myocyter och icke-myocyter från både atria och ventriklarna i en enda vuxen mus hjärta. Detta protokoll resulterar i konsekventa utbyten av mycket livskraftiga hjärt myocyter och icke-myocyter och detaljer optimal cell-specifika kultur villkor för fenotypning och in vitro analys.
Abstract
Isolering och odling av hjärt myocyter från möss har varit avgörande för att främja förståelsen av hjärt fysiologi och patofysiologi. Medan isolera myocyter från neonatal mus hjärtan är relativt enkelt, myocyter från den vuxna murin hjärtat föredras. Detta beror på att jämfört med neonatala celler, vuxna myocyter mer exakt rekapitulera cellfunktionen som det förekommer i det vuxna hjärtat in vivo. Det är dock tekniskt svårt att isolera vuxna mus hjärt myocyter i de nödvändiga mängderna och livskraften, vilket bidrar till ett experimentellt dödläge. Dessutom är offentliggjorda förfaranden specifika för isolering av antingen förmaksflimmer eller ventrikulära myocyter på bekostnad av förmaks- och ventrikulära icke-myocytceller. Beskrivs här är en detaljerad metod för att isolera både förmaksflimmer och Ventrikulärt hjärt myocyter, tillsammans med förmaksflimmer och ventrikulära icke-myocyter, samtidigt från en enda mus hjärtat. Dessutom finns detaljerna för optimala cellspecifika odlingsmetoder, vilket förbättrar cellens livskraft och funktion. Detta protokoll syftar inte bara till att påskynda processen för vuxna murin hjärtcell isolering, men också att öka utbytet och livskraften hos celler för undersökningar av förmaksflimmer och ventrikulära hjärtceller.
Introduction
Primär cellkultur är en integrerad resurs som erbjuder en kontrollerad miljö för detaljerade mekanistiska studier av hjärt myocyt funktion. På grund av deras mer hållbara natur och enkel isolering har neonatal råtta förmaksflimmer och ventrikulära myocyter varit den gemensamma källan till sådana cellkulturer1. Vuxna mus förmaksflimmer och ventrikulära myocyter (AMAMs och AMVMs) är dock mycket önskvärda för in vitro studier, eftersom deras molekylära och funktionella egenskaper bättre efterliknar vuxna hjärtceller. Således har de blivit relevanta för studier relaterade till hjärtpatologier, varav de flesta utvecklas hos vuxna2.
Dessutom utökar tillgängligheten och användningen av transgena och sjukdomsmusmodeller nyttan av isolerade vuxna hjärt myocyter. Protokoll för isolering och kultur av mus AMVMs för kort- och långtidsstudier har beskrivits i många tidigare publikationer2,3,4,5,6,7,8,9,10,11. I jämförelse har få protokoll beskrivits för isolering av AMAMs. Dessutom är de som beskrivs främst optimerade för akuta studier av nyisolerade celler, utan något långsiktigt odlingsprotokoll beskrivethittills 11,12,13. Amam-isoleringsprotokollen utformades därför inte för att ge användbarheten och mångsidigheten hos publicerade protokoll för isolering och kultur av amvm-skivor. Även om de banbrytande studierna för isolering av AMAMs och AMVMs har visat sig vara resursstarka, finns det inga protokoll för optimal samtidig isolering och kultur av både AMAMs och AMVMs, vilket resulterar i effektiv användning av hela hjärtat för varje beredning.
Hittills har publicerade AMAM- och AMVM-isoleringsprotokoll inte utformats för samtidig isolering av båda celltyperna, eftersom de flesta studier på förmaks- och ventrikulär funktion har ett kammarspecifikt fokus. Till exempel används AMAMs främst för att studera förmaksmyocytelektrofysiologi, delvis på grund av intresset för förmaksflimmer (AF), den vanligaste hjärtrytmrubbningen i USA. AF är dock inte en sjukdom som påverkar atria i isolering, och det har varit inblandad som att ha en orsakande roll i mild till svår vänster Ventrikulärt dysfunktion14. Dessutom har elektrokardiogram från patienter med hjärtsvikt med bevarad utmatningsfraktion (HFpEF) visat att vänster förmaksstorlek är en av de starkaste prediktorerna för mottaglighet för hjärtsvikt15.
Förutom sin roll i elektrofysiologi och kontraktilitet är atriumet också ett endokrint organ som utsöndrar kardiokiner (dvs. förmaksflimmernatriuretisk peptid [ANP]) som homeostatiskt reglerar blodtrycket ochvolymen 16,17. Dessutom har ANP (förmodligen från förmaksflimmer myocyter) en framträdande skyddande och antihypertrofisk roll i ventrikulära myocyter16,17. Medan det finns en stark implikation av neurohormonal kommunikation mellan atria och ventriklarna i olika sjukdom stater, mekanismerna bakom detta meddelande har inte utforskats fullt ut. Denna punkt exemplifieras ytterligare av ökningen av forskning med fokus på 1) rollen av icke-myocyter (särskilt hjärtfibroblaster och immunceller) i det sjuka hjärtat och 2) hur hjärtombyggnad som en funktion av sjukdom direkt påverkar hjärtmyocyt livskraft och global hjärtfunktion18,19,20,21,22. Att studera hjärtceller från både atria och ventriklar är således ett nödvändigt tillvägagångssätt för att få en mer fullständig bild av deras roller i hjärtpatofysiologi.
Följande protokoll beskriver samtidig isolering av förmaksflimmer och ventrikulära myocyter och icke-myocyter från ett enda mushjärta under fysiologiska och patofysiologiska förhållanden. Dessutom är denna metod den första att beskriva optimala villkor som är nödvändiga för att upprätthålla kulturer av förmaksflimmer hjärt myocyter, som villkor för att upprätthålla kulturer av Ventrikulärt myocyter har redan publicerats.
Protocol
All forskning som utförts på möss som rapporterats i detta dokument har granskats och godkänts av SDSU Institutional Animal Care and Use Committee och den överensstämmer med Guide for the Care and Use of Laboratory Animals som publicerats av National Research Council.
1. Förberedelse av isolerings- och kulturmedier och plätering
- Förbered 1 L hjärtperfusionsmedier före användning genom att tillsätta Joklik modifierade minsta essentiella medier (MMEM) till 1 L sterilt vatten. Justera pH-talet till 7,36 med 10 N NaOH, filtrera sedan genom ett filter på 0,2 μm och förvara vid 4 °C i upp till 2 veckor.
OBS: Joklik MMEM består av 112 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 1 mM MgCl2,9 mM NaH2PO4och 11,1 mM D-glukos. Detta kompletteras med 10 mM HEPES (2,38 g/L), 30 mM taurin (3,75 g/L), 2 mM D-l-karnitin (0,4 g/L), 2 mM kreatin och 10 mM butanedione monoxim (1,01 g/L). - Förbered matsmältningsbuffert strax före perfusion enligt följande: tillägg 50 ml hjärtperfusionsmedier med 6,25 μL 100 mM CaCl2 (se steg 1,3) och kollagenas typ 2 (enzymatisk aktivitet ~310–320 U/mg dw).
OBS: Väg djuret före avoffring. Mängden kollagenas typ 2 kompletterad i matsmältningsbufferten dikteras av djurets vikt (2,25 mg kollagenas typ 2 per 1 g kroppsvikt). - För att förbereda 100 mM CaCl2, tillsätt 1,47 g CaCl2 till 100 ml molekylärbiologiskt vatten. Rör om tills det är upplöst, passera sedan genom ett filter på 0,2 μm och förvara i rumstemperatur i upp till 2 månader.
- Förbered myocytstoppbuffert 1 genom att komplettera 90 ml hjärtperfusionsbuffert med 10 ml fetala nötkreatursserum (FBS) och 125 μL 100 mM CaCl2. Passera genom ett filter på 0,2 μm och förvara vid 4 °C i upp till 2 veckor.
- Förbered myocytstoppbuffert 2 genom att komplettera 114 ml hjärtperfusionsbuffert med 6 ml FBS och 150 μL 10 mM CaCl2. Passera genom ett filter på 0,2 μm och förvara vid 4 °C i upp till 2 veckor.
- Förbered förmaksflimmer myocytplätering medium strax före perfusion genom att komplettera 95 ml av Dulbeccos modifierade Eagle medium (DMEM) med 4 ml FBS, 1 ml 1 mL 100x penna/strep-glutamin, 1 ml 100x insulin-transferrin-selen och 1 ml 10 μM dexametason. Passera genom ett filter på 0,2 μm och förvara vid 37 °C tills plätering.
- Förbered ventrikulärt myocytpläteringsmedium genom att komplettera 95 ml minimalt essentiellt medium (MEM) med 4 ml FBS, 1 ml 100x penna/strep-glutamin, 10 ml 1 M HEPES-lösning, 1 ml 100x insulinöverföringsflöde-selen och 0,1 g butanedione monoxim. Passera genom ett filter på 0,2 μm och förvara vid 4 °C i upp till 2 veckor.
- Förbered ventrikulärt myocyt bibehållande medium genom att komplettera 99 ml MEM med 1 ml 100x insulin-transferrin-selen, 0,1 mg/mL bovin serum albumin (BSA), 10 mL 1 M HEPES lösning och 1 ml 100x penna/strep-glutamin. Passera genom ett filter på 0,2 μm och förvara vid 4 °C i upp till 2 veckor.
- För att förbereda lamininbelagda experimentella plattor och diabilder, tina mus laminin stamlösning (1,19 mg/ml). Tillsätt 10 μL lamininbuljonglösning till varje 1 ml DMEM och blanda. Täck experimentella plattor och diabilder jämnt och förvara i en 37 °C, 5% CO2 inkubator i minst 1 timme före perfusion för att möjliggöra jämvikt.
OBS: Belagda experimentplattor och diabilder kan förvaras vid 4 °C i upp till 2 dagar.
2. Isoleringsapparat
- Före varje isolering, rengör slangarna och andra komponenter i systemet med tre kompletta tvättar på 70% EtOH genom att fylla bubbelfällan till toppen (stäng av den nedre kranen och håll den övre kranen öppen).
- Skölj hela systemet 3x med sterilT H2O genom att fylla bubbelfällan till toppen (stäng av den nedre kranen och håll den övre kranen öppen).
- Skölj ut hela systemet med hjärtperfusionsbuffert och fyll bubbelfällan halvvägs med media.
- Ställ in det cirkulerande vattenbadet på 37 °C.
- Ställ in ett vattenbad för media till 37 °C.
- Ta bort eventuella luftbubblor i den peristaltiska pumpslangen.
- Justera flödeshastigheten för den peristaltiska pumpen till 3 ml/min.
3. Kirurgiskt ingrepp (icke-överlevnad)
- Blötlägg kirurgiska instrument i 70% EtOH i minst 5 min.
- Placera hjärtat perfusion media, myocyte stoppa buffertar och matsmältning buffert i 37 °C vattenbadet.
- Placera det förmaksflimmer myocytpläteringsmediet, ventrikulärt myocytpläteringsmedium och ventrikulärt myocyt bibehållande medium i en 37 °C, 5% CO2 inkubator 1 h före användning och lossa locken för att möjliggöra jämvikt.
- Injicera 10 veckor gamla han- eller hondjur C57b6/j möss intraperitoneally (dvs. med 0, 35 ml heparin, utspädd i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) till 100 IE/ml. Låt läkemedlet träda i kraft i ca 10 min.
OBS: Om två hjärtan ska utsättas för denna isoleringsprocedur kan den andra musen bedövas och administreras heparin vid denna tidpunkt i det första förfarandet. För att minimera belastningen på djuret kan lätt anestesi administreras med 2% isofluran/syreblandning i en hermetiskt tillsluten induktionskammare. - Söv djuret med en 2% isofluran/syreblandning och injicera i.p. med pentobarbital (0,3 ml från 10 mg/ml stam), förbered sedan bröstet genom att svabba med 70% EtOH.
- Förbered en bunden 5-0 silke sutur för att vara redo att ligate hjärtat till perfusion kanylen. Montera kanylen bredvid kirurgiskt mikroskop.
- Öppna snabbt bröstet genom att först göra ett midline hudsnitt, från mitten av buken till käken och sedan gå in i bukhinnan med den stora saxen och rensa bort membranet genom trubbig dissekering. Skär sedan bort revbenskorgen med saxen med skär upp bröstväggen på den laterala aspekten av båda sidor.
- Klipp bort fibrösa kopplingar mellan hjärtat och bröstväggen (inklusive tymus). Skär sedan bort bröstkorgen tillsammans. Använd de små tångarna och saxarna, lyft försiktigt hjärtat vid toppen och exponera den bakre aspekten av hjärtat.
- Explant hjärtat genom att dissekera omedelbart sämre än den innominate gatan på stigande stora kroppspulsådern och omedelbart placera hjärtat i iskalla PBS eller kallt hjärta perfusion media. Därefter dissekera snabbt bort återstående vävnad från det explanterade hjärtat i iskalla hjärtat perfusion media, exponera den stigande stora kroppspulsådern.
OBS: Det är användbart att explantera hjärtat med tymus intakt att använda som ett anatomiskt landmärke. - Rengör området kring stora kroppsdelar av överskottsvävnad med mikroavledande tång och sax. Placera aortan på kanylen med finspetsade tångar och säkra med en 5-0 silkessutur.
OBS: Den bästa placeringen sker vanligtvis med aortan som sträcker sig ca 2 mm upp på kanylen. - Granska det kanylerade hjärtat med hjärtperfusionsmedier med ett flöde på 3 ml/min i 4 min. Byt sedan media från hjärtperfusionsmedier till matsmältningsbuffert i 15,0−17,5 min perfusion (Figur 1A).
OBS: Kranskärlens flöde kommer sannolikt att öka, vilket indikerar effektiv vävnadssammanfattning (dvs. blekt, svullet hjärta). - Samla 8 ml matsmältningsbuffertflöde igenom under de sista minuterna av perfusion för senare användning i steg 5.4.
- Ta bort hjärtat från kanylen och placera den på en 60 mm plastkulturrätt. Ta bort överflödig vävnad (dvs. aorta, vener) och sänk ner hjärtat i 2,5 ml rötningsbuffert som förberedelse för mekanisk separation.
OBS: Vid denna tidpunkt dissekeras atria bort, och en experimenterare bör utföra det förmakscellisoleringsprotokollet, medan en andra experimentör bör utföra ventrikulär cellisolering.
4. Förmakscellsisolering och kultur
- Dissekera atria bort från hjärtat och placera den i en 30 mm plastkulturrätt. Sänk ner den i 0,75 ml rötningsbuffert för mekanisk separation. Förvara ventriklarna i 60 mm-skålen (steg 3.12) och utför de separata isoleringsmetoderna samtidigt (avsnitt 5, figur 1B).
OBS: Vid denna tidpunkt kan atria och ventriklarna genomgå ytterligare separation om det finns behov av att isolera vänster- och högercellerna. - Börja hacka och reta atria isär, ursprungligen med finspets kirurgisk sax och följt av fina tång för ytterligare malning. Undvik att agitera vävnaden och dra inte snabbt isär muskelfibrer.
- Använd en steril överföringspipettspets och fortsätt att försiktigt blanda och ta bort vävnaden i 15 minuter. Var 5: e minut, observera förmaksflimmer myocyt disassociation från vävnad under ett 10x objektivt brightfield mikroskop. När vävnaden smälts ytterligare, fortsätt försiktigt blanda och dissociera vävnad med hjälp av en steril överföringspipettspets med en mindre porstorlek.
- Överför cellfjädringen till ett 2 ml sterilt mikrocentrifugrör. Skölj 30 mm-plattan med 0,75 ml myocytstoppbuffert 1 vid 37 °C och kombinera med cellfjädringen (ändvolym = 1,5 ml).
- Låt de förmaksflimmer myocyterna sedimentera genom gravitation i 10 minuter vid rumstemperatur. Omrör försiktigt cellfjädringen så att myocyter kan sedimenteras till botten av det koniska röret och bildar en synlig pellet.
- Centrifugera cellfjädringen i 5 min vid 20 x g. Ta försiktigt bort supernatanten, som innehåller icke-myocyterna, och överför till ett 15 ml polypropylenkoniskt rör med hjälp av en steril pipettspets utan att störa pelleten av förmaksflimmer myocyter.
- Centrifugera icke-myocytfraktionen i 5 min vid 20 000 x g. Aspirera supernatant och återanvänd icke-myocyt pellet i 10 mL DMEM kompletteras med 10% fetala kalv serum (FCS).
- Räkna icke-myocyter med hjälp av en hemocytometer eller annan metod, plätera sedan enligt experimentella behov eller isolera ytterligare i enskilda specifika cellpopulationer via fluorescensaktiverad cellsortering (Figur 1C).
- Återanvänd pelleten av isolerade förmaksflimmer myocyter från steg 4, 6 i 1 ml förmaksflimmer myocytplätering medium och applicera 10 μL av denna suspension på en hemocytometer. Utför ett cellantal stavformade myocyter per fält.
- Aspirate laminin från förbelagda experimentella plattor/diabilder och återanvänd isolerade förmaksflimmer myocyter i lämplig volym av förmaksflimmer myocyt plätering medium kompletteras med 25 μM blebbistatin. Platta med önskad densitet per experimentellt behov (Figur 1C).
OBS: Typisk pläteringstäthet för den långsiktiga odling som beskrivs här är 5 x 105 celler/kammare på fyrakammarbilder (1,7 cm2).
5. Ventrikulär cellisolering och kultur
- Börja hacka och reta upp hjärtats ventrikulära vävnad, först med finspetsad kirurgisk sax och följt av fina tångar för ytterligare malning (Figur 1B). Undvik att agitera vävnaden genom att snabbt dra isär muskelfibrer.
- Överför cellfjädringen till ett 15 ml polypropylenkoniskt rör. Skölj plattan med 2,5 ml myocytstoppbuffert 1 vid 37 °C och kombinera med cellfjädringen (ändvolym = 5 ml).
- Använd en steril överföringspipettspets och fortsätt att försiktigt blanda och ta bort vävnaden i 4 minuter. Applicera 10 μL av denna cellupphängning på bilden och visualisera närvaron av stavformade myocyter för att säkerställa isoleringens kvalitet.
- För cellfjädringen genom ett 100 μm sterilt nylonfilter till ett 50 ml polypropylenkoniskt rör. Använd 2 ml rötbuffert som samlats in i steg 3.12 för att tvätta bort eventuella kvarvarande celler från det sterila nylonfiltret.
- Låt ventrikulära myocyter sedimentera genom gravitation i 6 minuter vid rumstemperatur. Omrör försiktigt den filtrerade cellupphängningen så att myocyter kan sedimenteras längst ner i koniska, bildar en synlig pellet.
- Utan att störa pelleten av ventrikulära myocyter, ta försiktigt bort supernatanten (icke-myocyter) och överför till ett 50 ml polypropylenkoniskt rör med en steril pipettspets. Centrifugera icke-myocytfraktionen i 5 min vid 20 000 x g. Aspirera supernatant och återanvänd icke-myocyt pellet i 10 mL DMEM kompletteras med 10% FCS.
- Räkna icke-myocyter med hjälp av en hemocytometer och återanvänd i en lämplig volym DMEM kompletteras med 10% FCS. Plätera sedan enligt experimentella behov, eller isolera ytterligare i enskilda specifika cellpopulationer via fluorescensaktiverad cellsortering (Figur 1C).
- Återanvänd de isolerade ventrikulära myocyterna i 2 ml myocytstoppbuffert 2 och applicera 10 μL cellfjädring på hemocytometern. Utför ett cellantal stavformade myocyter per fält.
- Återinförande av Ca2+ med ett stegvis paradigm
OBS: Kalcium återintroduktion steg är specifika för Ventrikulärt myocyter och bör inte utföras för förmaksflimmer myocyter, eftersom detta kommer att leda till celldöd.- Tillsätt 50 μL cacl2 på 10 mM till ventrikulär myocytcellsupphängning. Blanda väl och inkubera i 4 min vid rumstemperatur.
- Tillsätt ytterligare 50 μL cacl2 på 10 mM till ventrikulär myocytcellsupphängning. Blanda väl och inkubera i 4 min vid rumstemperatur.
- Tillsätt ytterligare 100 μL 10 mM CaCl2 till ventrikulär myocytcellsupphängning. Blanda väl och inkubera i 4 min vid rumstemperatur.
- Tillsätt 80 μL cacl2 på 100 mM till ventrikulär myocytcellsupphängning. Blanda väl och inkubera i 4 min vid rumstemperatur.
- Avlägsna lamininbeläggningen från plattor eller diabilder och återanvänd de isolerade ventrikulära myocyterna i en lämplig volym ventrikulärt myocytpläteringsmedium enligt experimentella behov (figur 1C).
OBS: Typisk pläteringstäthet för den långsiktiga odling som beskrivs här är 5 x 105 celler/kammare på fyrakammarbilder (1,7 cm2). Undvik plätering med en densitet på mer än 75% sammanflöde, eftersom cellulär överförtätning främjar cellklumpning och därigenom hämmar fastsättningen på plattan. Dessutom kommer ett stort antal celler att gå förlorade under den första mellanförändringen. Plåtceller snabbt efter isolering, som extracellulära Ca2 + främjar hypercontraction och förlust av livskraftiga myocyter. - Låt ventrikulära myocyter sätta sig och klibba i minst 1 timme. Därefter ändra media till Ventrikulärt myocyt upprätthålla medium kompletteras med 25 μM blebbistatin.
OBS: Ventrikulära myocyter kan odlas upp till 96 timmar efter plätering i μM blebbistatin. Experiment bör utföras i Ventrikulärt myocyt upprätthålla medium i avsaknad av blebbistatin.
Representative Results
En wildtype 10-veckor gammal C57b6/j mus hjärta resulterar vanligtvis i mellan 75,000−150,000 förmaksflimmer myocyter och 1,0−1,5 x 106 ventrikulära myocyter, vilket motsvarar en ungefärlig avkastning på 30%−50% för förmaks- och ventrikulära myocyter18,19. Under och omedelbart efter isoleringen ska livskraftiga hjärt myocyter verka stavformade och icke-kontrakterande. En majoritet av isolerade hjärt myocyter bör anpassa denna morfologi, som är en indikation på effektiv perfusion. Stavformens morfologi kan också vara en prediktor för livskraft. Protokollet syftar till att förbättra utbytet och livskraften hos myocyter och icke-myocyter isolerade från ett sjukt mushjärta. Dessutom har det testats i en modell av trycköverbelastning-inducerad hjärtsvikt (data visas inte).
För att bekräfta adekvat och reproducerbar isolering av myocyter och icke-myocyter från förmaks- och ventrikulär vävnad observerades och fotograferades cellerna vid olika kulturdagar (figur 2). Kvantitativ omvänd transkription polymeras kedjereaktion (qRT-PCR) utfördes dessutom för att mäta nivåerna av transkriptioner som var cell typ-specifika. Hjärtmuskel troponin T (Tnnt2) är en markör för hjärt myocyter och uttrycktes kraftfullt i både förmaksflimmer och ventrikulära hjärt myocyt kulturer (Figur 3A). Däremot var förmaksflimmer natriuretisk peptid (Nppa, som vanligtvis uttrycks uteslutande i vuxna förmaksflimmer hjärt myocyter under fysiologiska förhållanden) och myosin ljuskedja 2 (Myl2, som är en ventrikulär myocyt specifik gen) robust och specifikt uttryckt i förmaks- respektive ventrikulära hjärt myocyt kulturer, respektive (Figur 3B, C).
Fibroblastmarkörer, transkriptionsfaktor 21 (Tcf21), trombocyt-härledd tillväxtfaktorreceptor A (Pdgfra) och monocyt-härledda cellmarkörkluster av differentiering 68 (Cd68) uttrycktes uteslutande i icke-myocytkulturer isolerade från både förmaks- och ventrikulära kammare (figur 3D−F). Det uppskattas att icke-myocyter kompromissar ~ 65% av alla hjärtceller och att en majoritet av dessa härrör från en fibroblast eller monocyt-härstamning18,19,23,24. Markörer för dessa två härstamningar valdes därför att vara representativa, med tanke på intresset för dessa cellulära populationer i studier av olika modeller och etiologies av hjärt patologi.
Immunostaining av AMAMs och AMVMs för t-tubule markör dihydropyridine (DHPR, som är en spänningsberoende (L)-typ kalciumkanal) samt ryanodin receptorn (RYR2) visat intakt t-tubules under isolering och långsiktig kultur (Figur 4A, B). Överflöd av DHPR och lokalisering som var karakteristiska och unika för förmaksflimmer och Ventrikulärt myocyter anges förekomsten av t-tubules. Dessutom var colocalization av DHPR med RYR2 immunostaining en indikator på intakta diad strukturer. Immunostaining för sarkomiskt protein alfa-aktinin i förmaks- och ventrikulära hjärt myocyter resulterade i det förväntade sarkomiska strimman mönstret. Det sarkomiska strimationsmönstret användes för att bedöma renheten och livskraften hos isolerade hjärt myocyter i kombination med stavformad morfologisk form och nukleär färgning med TOPRO-3 (Figur 4C, D; lila och röd). Som förväntat var Ventrikulärt hjärt myocyter stora, uppvisar en genomsnittlig längd på ~ 150 mm, medan förmaksflimmer hjärt myocyter i genomsnitt ~ 75 mm. Vid immunostaining analys uppvisade förmaksflimmer hjärt myocyter (men inte ventrikulära hjärt myocyter) robusta uttryck för förmaksflimmer natriuretic peptid (ANP) i ett färgning mönster som var karakteristiska för lokalisering till endoplasmic reticulum och secretory granulat(Figur 4C, D; grön).
En egenskap som är unik för förmaksflimmer hjärt myocyter är dess klassificering som en endokrin cell utöver contractile cell. Medan förmaksmyocyter utsöndrar ANP under basala förhållanden, ökar utsöndring som svar på sekregor (dvs. alfa-adrenerga agonisten, fenylefrinet [PE]). Dessutom utsöndrar förmaksflimmer hjärt myocyter ANP och processar samtidigt en del av hormonet från dess prekursortillstånd (Pro-ANP, 15 kD) till produktpeptiden (ANP 3kD)16,17. Denna sekretoriska förmåga kan kvantifieras genom immunoblot detektion av ANP i media av isolerade förmaksflimmer hjärt myocyter som svar på akut PE behandling (Figur 4E). Denna sekretoriska och bearbetning förmåga av förmaksflimmer hjärt myocyt konstaterades vara känsliga för odling villkor. Således är det absolut nödvändigt att det förmaksbara myocytpläteringsmediet kompletteras med dexametason, insulin, transferrin och selen.
Figur 1: Schematisk översikt över bakåtsträvande hjärtperfusion, matsmältning och cellisolering. Visas är de viktigaste stegen som är involverade i cellisolering från både förmaks- och ventrikulära kamrar samtidigt från ett enda mushjärta. A) Ett enda mushjärta kannuleras snabbt via den stigande aortan och perfunderas på ett bakåtsträvande sätt. B)Hjärtat är uppdelat i förmaks- och ventrikulära vävnader för ytterligare matsmältning och fysisk separation. C)Efter adekvat matsmältning separeras cellerna via gravitationsfiltrering till totalt fyra cellulära fraktioner som odlas för efterföljande experiment. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Morfologisk analys av isolerade förmaksflimmer och ventrikulära hjärt myocyter och icke-myocyter i kultur. a)Isolerade vuxna mus förmaksflimmer myocyter (AMAMs),(B)vuxna mus förmaksflimmer icke-myocyter (AMANMs),(C)vuxna mus ventrikulära myocyter (AMVM), eller (D) vuxna mus ventrikulära icke-myocyter (AMVNMs) pläterades till 5 x 10 5 celler/kammare på fyra-kammare (1,7 cm2) glas bilder i respektive pläterade medier. Fas bilder erhölls vid angivna dagar i kultur med hjälp av ett 10x mål under ett epifluorescens mikroskop. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: Representativ qRT-PCR-analys av isolerade cellkulturer. RNA extraherades från nyligen isolerade hjärt myocyter och icke-myocyter, och mRNA nivåer för cell-specifika gen markörer fastställdes av qRT-PCR4. A) Tnnt2, hjärtmuskel troponin T (hjärt myocyt markör); B) Nppa,förmaksflimmer natriuretisk peptid (förmaksflimmer myocytmarkör); C) Myl2, myosin ljuskedja 2 (ventrikulär myocytmarkör); D) Tcf21,transkriptionsfaktor 21 (fibroblastmarkör). (E) Pdgfra,trombocyt-härledd tillväxtfaktorreceptor A (fibroblastmarkör); (F) Cd68, differentieringskluster 68 (monocyt-härledd cellmarkör). Data representerar genomsnittlig ± SEM (*p ≤ 0,05 skiljer sig från alla andra värden, enligt ANOVA följt av Newman Keuls post hoc-analys). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4: Representativ morfologisk och funktionell analys av isolerade förmaks- och ventrikulära hjärtmustoyctes. A)AMAMs eller (B) AMVMs pläterades till 5 x 105 celler/kammare på fyrakammarbilder (1,7 cm2)i respektive pläteringsmedier i 1 h för att möjliggöra vidhäftning. Detta följdes av antingen refeeding förmaksflimmer myocyte plätering media eller byta till Ventrikulärt myocyte upprätthålla medier kompletteras med blebbistatin för ytterligare 16 h. Kulturer fixades därefter därefter immunostained för RYR2 (lila), DHPR (gräsplan) och kärn- fläck TOPRO-3 (rött). C)AMAMs eller (D) AMVMs isolerades och pläterades, sedan immunostained för a-aktinin (lila), ANP (grön) och TOPRO-3 (röd). Visas är två representativa bilder för varje celltyp. (E) AMAMs pläterades på 5 x 105 celler/väl på en 12 brunn kultur maträtt för 16 h i förmaksflimmer myocyt plätering media. AMAMs behandlades därefter för 0,5 h med fordon eller ANP secretagogue (fenylefrin, 50 mM) innan media samlades in och utsattes för immunoblot analys för ANP. Före immunoblot analys, media prover centrifugerades vid 500 x g i 5 min för att ta bort cellulära skräp och säkerställa att den observerade ANP var resultatet av aktiv utsöndring från AMAMs. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Discussion
Kvaliteten på de celler som isoleras med hjälp av det förfarande som beskrivs här, som bestäms av cellutbytet och den övergripande hälsan hos cellerna i kulturen, beror på många kontrollerbara faktorer. Från och med musen själv har det dokumenterats att stress som åläggs djuret kan påverka cellutbytet och livskraften i kulturen negativt, förmodligen på grund av överskott av systemiskt kortisol, katekolaminer och hjärtvävnadens hyperkontraktila tillstånd2,5,7. Av dessa skäl bör åtgärder vidtas för att undvika att skrämma djuret före offer. Sådana åtgärder omfattar att täcka djurets bur och begränsa tiden utanför vivarium före uppoffring. Heparin och många barbiturater som ofta används för dödshjälp kan påverka signalvägar; Den optimala metoden för dödshjälp bör därför anpassas i enlighet med detta. Djurets ålder har en betydande inverkan på kvaliteten och livskraften hos isolerade celler, sannolikt på grund av progressiv ackumulering av interstitiell fibros som förekommer samtidigt med åldrandeprocessen, vilket kan påverka vävnadssammanfattningen25. I data som inte presenteras här, medan metoden som beskrivs ovan fungerar hos möss upp till 78 veckor gamla, var cellernas kvalitet lägre hos dessa äldre djur.
Det mest kritiska steget i isoleringsprocessen som beskrivs, liksom andra protokoll med en Langendorff-apparat för retrograd perfusion, är kannuleringen och den första perfusionen av hjärtat. För optimala resultat bör tiden från hjärt explantation till cannulation av stigande stora kroppsmassa och inledandet av perfusion inte ta mer än 90 s. Förutom tid är två ytterligare viktiga faktorer kanylens djup och möjligheten att införa luftemboli från perfusionsapparaten. Följaktligen bör kanylen föras in i den stigande stora kroppsorten för att inte komma in i aortaroten och hindra aortaventilen, vilket skulle försämra perfusionen av kranskärlen.
Under matsmältningsprocessen är det viktigt att regelbundet testa hjärtats styvhet för att undvika långvarig exponering för matsmältningsenzymet kollagenas, vilket minskar kalciumtoleransen för hjärt myocyt. Protokollet som beskrivs ovan för kalcium återintroduktion i isolerade Ventrikulärt myocyt kulturer utformades för att begränsa hjärt myocyt död via olämpliga kalcium tillströmning via lagra drivs kalcium kanaler. Det bör noteras att stegvis kalcium återintroduktion inte bör utföras för isolerade förmaksflimmer myocyt kulturer, eftersom detta kommer att främja celldöd under kort- och långsiktiga kultur12. För ytterligare försiktighet, perfusion och matsmältning buffertar som används här inkluderar hjärt muskel sammandragning hämmare butanedione monoxime (BDM) för att undvika hypercontraction av isolerade myocyter, liksom kalcium paradoxen, som båda påverkar myocyt livskraft26. Övergången från BDM till blebbistatin bör dock noteras, eftersom det är det föredragna antikontraktila medlet för att upprätthålla media för isolerade hjärt myocyter. I data som inte visas ger blebbistatin större livskraft för långvarig odling av isolerade hjärt myocyter.
Omedelbart efter isolering är det viktigt att överväga konsekvenserna av långvarig kultur av hjärtceller, särskilt myocyter. Hjärt icke-myocyt isolering och odling protokoll beskrivs här är baserat på vanliga metoder som dra nytta av de olika densiteterna och självhäftande egenskaperna hos olika hjärtceller. Fördelen med icke-myocyter är deras höga expansionspotential inom kulturen; Således, till skillnad från hjärtmyocyter, är de mottagliga för att passa för fortlevnad. Emellertid, Det är känt att odling villkor, inklusive medium tillskott med FBS, kan påverka hjärt myocyt funktionalitet27. Kulturmedierna som beskrivs här utformades för att optimera livskraften och begränsa funktionella derangements, särskilt för isolerade förmaksflimmer myocyter. Medan ingen alltför nedsatt kontraktil förmåga observerades i isolerade hjärt myocyter efter kultur i avsaknad av blebbistatin tillskott, studier som fokuserar på elektrofysiologi, contractility och andra encellig in vivo-baserade molekylär signalering bör utföras strax efter isolering, när sarkomisk struktur och molekylär signatur fortfarande efterliknar det intakta hjärtat.
Ett kännetecken för den förmaksmyocyt är dess förmåga att månsken som en endokrin cell med enorm sekretersförmåga, förutom deras kontraktila funktion. Under fysiologiska förhållanden producerar förmaksflimmer myocyter stora mängder ANP, som lagras i det endoplasmatiska retikulumet och i stora täta kärnsekretoriska granulat redo för reglerad exocytos när de får en stimulans16,17. Medan många isolerade förmaksmyocytstudier fokuserar på deras unika elektrofysiologiska egenskaper, är detta den första studien för att designa ett kulturmedier. Detta möjliggör långsiktig livskraft samt främjande av de underhållna funktionerna i endokrina och kontraktila egenskaper hos förmaksmyocyter. Denna nya metod för odling, liksom samtidig isolering av alla celltyper från förmaks- och ventrikulära kammare från ett enda mushjärta, kommer att vara användbar och effektiv för studier av de fysiologiska och patofysiologiska egenskaperna hos både förmaks- och ventrikulära myocyter.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
E.A.B. stöddes av National Institutes of Health (1F31HL140850), ARCS Foundation, Inc., San Diego Chapter, och är en Rees-Stealy Research Foundation Phillips Gausewitz, M.D. Scholar vid SDSU Heart Institute. E.A.B. och A.S.B. stöddes av Inamori Foundation. CCG by (NIH) beviljar R01 HL135893, R01 HL141463 och HL149931.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (-)-Blebbistatin | Sigma-Aldrich | B0560 | |
| 1 Liter Water Jacketed Reservoir | Radnoti | 120142-1 | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| 5-0 Silk Suture Thread | Fine Science Tools | 18020-50 | |
| Adenosine | Sigma-Aldrich | A9251 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A6003 | |
| Bubble Trap Compliance Chamber | Radnoti | 130149 | |
| Calcium Chloride Anhydrous | Fisher Scientific | C614-500 | |
| Carnitine hydrochloride | Sigma-Aldrich | C9500 | |
| Collagenase type 2 | Worthington Biochemical Corporation | LS004176 | |
| Creatine | Sigma-Aldrich | C0780 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D2915 | |
| DMEM/F12 (1:1; 1X) | Gibco | 11330-032 | |
| Dumont #7 - Fine Forceps | Fine Science Tools | 11274-20 | |
| Epifluorescent micropscpe | Olympus X70 | IX70 | |
| Fetal Bovine Serum (Heat Inactivated) | Omega Scientific | FB-12 | Lot# 206018 |
| Fine Scissors - Sharp | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Headband Magnifiers | Fine Science Tools | 28030-04 | |
| Hemacytometer (Bright-Line) | Hausser Scientific | 1475 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Inosine | Sigma-Aldrich | I4125 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-X | Gibco | 51500-056 | |
| Isotemp 105 Water Bath | Fisher Scientific | NC0858659 | |
| Isotemp 3006 | Fisher Scientific | 13-874-182 | |
| Joklik Modified Minimum Essential Media | Sigma-Aldrich | M-0518 | |
| Laminin (Natural, Mouse) | Gibco | 1795024 | Lot# 1735572 |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G8540 | |
| Masterflex C/L Single-Channel Variable-Speed Compact Pump | Cole-Palmer | EW-77122-24 | |
| Minimum Essential Medium (MEM 1X) | Gibco | 12350-039 | |
| Molecular Biology Grade Water | Corning | 46-000-CM | |
| Pen Strep Glutamine (100X) | Gibco | 10378-016 | |
| Spring Scissors - 6mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15020-15 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T-8691 |
References
- Peter, A. K., Bjerke, M. A., Leinwand, L. A. Biology of the cardiac myocyte in heart disease. Molecular Biology of the Cell. 27 (14), 2149-2160 (2016).
- Kruppenbacher, J. P., May, T., Eggers, H. J., Piper, H. M. Cardiomyocytes of adult mice in long-term culture. Naturwissenschaften. 80 (3), 132-134 (1993).
- Ackers-Johnson, M., et al. A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart. Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).
- Jin, J. K., et al. ATF6 decreases myocardial ischemia/reperfusion damage and links ER stress and oxidative stress signaling pathways in the heart. Circulation Research. 120 (5), 862-875 (2017).
- Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. (114), e54012 (2016).
- Li, D., Wu, J., Bai, Y., Zhao, X., Liu, L. Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy. Journal of Visualized Experiments. (87), e51357 (2014).
- O'Connell, T. D., Ni, Y. G., Lin, K. M., Han, H. P., Yan, Z. Isolation and culture of adult cardiac myocytes for signaling studies. AfCS Research Reports. 1 (5), 1-9 (2003).
- Pinz, I., Zhu, M., Mende, U., Ingwall, J. S. An improvised isolation procedure for adult mouse cardiomyocytes. Cell Biochemistry and Biophysics. 61 (1), 93-101 (2011).
- Piper, H. Culturing of calcium stable adult cardiac myocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 14 (7), 397-412 (1982).
- Shioya, T. A simple technique for isolating healthy heart cells from mouse models. Journal of Physiological Sciences. 57 (6), 327-335 (2007).
- Omatsu-Kanbe, M., Yoshioka, K., Fukunaga, R., Sagawa, H., Matsuura, H. A simple antegrade perfusion method for isolating viable single cardiomyocytes from neonatal and aged mice. Physiological Reports. 6 (9), 13688 (2018).
- Jansen, H. J., Rose, R. A. Isolation of Atrial Myocytes from Adult Mice. Journal of Visualized Experiments. (149), e59588 (2019).
- Yao, C., et al. Enhanced Cardiomyocyte NLRP3 Inflammasome Signaling Promotes Atrial Fibrillation. Circulation. 138 (20), 2227-2242 (2018).
- Cha, Y., Redfield, M. M., Shen, W., Gersh, B. J. Atrial Fibrillation and Ventricular Dysfunction: A Vicious Electromechanical Cycle. Circulation. 109 (23), 2839-2843 (2004).
- Issa, O., et al. Left atrial size and heart failure hospitalization in patients with diastolic dysfunction and preserved ejection fraction. Journal of Cardiovascular Echography. 27 (1), 1-6 (2017).
- de Bold, A. J. Atrial natriuretic factor: a hormone produced by the heart. Science. 230 (4727), 767-770 (1985).
- McGrath, M. F., de Bold, M. L., de Bold, A. J. The endocrine function of the heart. Trends in Endocrinology and Metabolism. 16 (10), 459-477 (2005).
- Doevendans, P. A., Daemen, M. J., de Muinck, E. D., Smits, J. F. Cardiovascular phenotyping in mice. Cardiovascular Research. 39 (1), 34-49 (1998).
- Banerjee, I., Fuseler, J. W., Price, R. L., Borg, T. K., Baudino, T. A. Determination of cell types and numbers during cardiac development in the neonatal and adult rat and mouse. American Journal of Physiology. 293, 1883-1891 (2007).
- Jugdutt, B. I. Ventricular remodeling after infarction and the extracellular collagen matrix: when is enough enough. Circulation. 108, 1395-1403 (2003).
- Omatsu-Kanbe, M., et al. Identification of cardiac progenitors that survive in the ischemic human heart after ventricular myocyte death. Scientific Reports. , 7 (2017).
- Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485, 599-604 (2012).
- Limana, F., et al. bcl-2 overexpression promotes myocyte proliferation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 6257-6262 (2002).
- Pinto, A. R., et al. Revisiting cardiac cellular composition. Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2015).
- Chen, W., Frangogiannis, N. G. The role of inflammatory and fibrogenic pathways in heart failure associated with aging. Heart Failure Reviews. 15, 415-422 (2010).
- Daly, M. J., Elz, J. S., Nayler, W. G. Contracture and the calcium paradox in the rat heart. Circulation Research. 61 (4), 560-569 (1987).
- Li, Z., Sharma, R. V., Duan, D., Davisson, R. L. Adenovirus-mediated gene transfer to adult mouse cardiomyocytes is selectively influenced by culture medium. Journal of Gene Medicine. 5 (9), 765-772 (2003).
