इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य मानव अग्नाशय आइलेट एनग्रेफ्टमेंट प्रक्रिया और योगदान मेजबान बनाम दाता कोशिकाओं की गतिशीलता की लगातार निगरानी करना है। यह एक मंजूरी के आंख (ACE) के पूर्ववर्ती कक्ष में मानव आइलेट्स प्रत्यारोपण द्वारा पूरा किया जाता है । (Cg)-gt (ROSA) 26Sortm4-Rag2-/-माउसप्राप्तकर्ता दोहराया 2-फोटॉन इमेजिंग के बाद ।Rag2-/-
इमेजिंग बीटा कोशिकाओं आइलेट प्रत्यारोपण को समझने की दिशा में एक महत्वपूर्ण कदम है। हालांकि बीटा सेल जीव विज्ञान की रिकॉर्डिंग के लिए विभिन्न इमेजिंग प्लेटफार्मों को विकसित किया गया है और वीवो मेंउपयोग किया गया है, वे एकल सेल संकल्प और निरंतर देशांतर रिकॉर्डिंग की अनुमति देने के मामले में सीमित हैं। कॉर्निया की पारदर्शिता के कारण, चूहों में आंख (एसीई) का पूर्वकाल कक्ष मानव और माउस अग्नाशय आइलेट सेल जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है। यहां इस बात का वर्णन दिया गया है कि व्यक्तिगत मानव आइलेट ग्राफ्ट के ग्राफ्टिंग और पुनर्संवहन की निरंतर देशांतर रिकॉर्डिंग करने के लिए इस दृष्टिकोण का उपयोग कैसे किया जा सकता है। मानव आइलेट ग्राफ्ट को एसीई में डाला जाता है, जो मंजूरी का उपयोग करके होता है। (सीजी)-जीटी(रोजा) 26Sortm4-Rag2-/-प्राप्तकर्ताओं के रूप में चूहों ।Rag2-/-tm4 यह प्राप्तकर्ता बनाम दाता कोशिकाओं के विस्तार की जांच और भ्रष्टाचार के एनकैप्सुलेशन और संवहनी को बढ़ावा देने में प्राप्तकर्ता कोशिकाओं के योगदान के लिए अनुमति देता है। इसके अलावा, आइलेट वॉल्यूम या खंडित वैक्यूलेचर और आइलेट कैप्सूल बनाने वाले प्राप्तकर्ता कोशिकाओं के छवि विश्लेषण और मात्राकरण के लिए एक कदम-दर-कदम दृष्टिकोण रेखांकित किया गया है।
मधुमेह मेलिटस मेटाबोलिक रोगों के एक समूह का वर्णन करता है जो रक्त ग्लूकोज के ऊंचा स्तर की विशेषता है, जो अग्नाशय के आइलेट बीटा कोशिकाओं के नुकसान या शिथिलता से अपर्याप्त इंसुलिन उत्पादन के परिणामस्वरूप होता है, अक्सर इंसुलिन प्रतिरोध के साथ। टाइप 1 (T1D) और टाइप 2 डायबिटीज (T2D) जटिल बीमारियां हैं जिनमें बीटा कोशिकाओं की प्रगतिशील शिथिलता रोग विकास का कारण बनती है। T1D बीटा कोशिकाओं पर एक ऑटोइम्यून हमले से उपजी है, जबकि T2D मेटाबोलिक कारकों से प्रेरित माना जाता है, हालांकि कम ग्रेड प्रणालीगत सूजन1के बढ़ते सबूत के साथ । दाता मानव आइलेट्स का प्रत्यारोपण, विशेष रूप से T1D रोगियों के लिए, शारीरिक ग्लाइसेमिक नियंत्रण प्रदान करने की क्षमता प्रदान करता है। हालांकि, ऊतक दाताओं और गरीब आइलेट engraftment की कमी आइलेट प्रत्यारोपण को रोका गया है एक मुख्यधारा के चिकित्सीय विकल्प बन जाते हैं । हाइपोक्सिक, भड़काऊ, इम्यूनोजेनिक होस्टपर्यावरण2,3के कारण तत्काल पोस्टट्रांज्लांटेशन अवधि (24-48 एच) में कार्यात्मक आइलेट भ्रष्टाचार का एक बड़ाहिस्साखो जाता है। आइलेट अस्तित्व में सुधार के लिए हस्तक्षेप विधियों की दक्षता का मूल्यांकन करने के लिए, ऐसे प्रत्यारोपण की निरंतर निगरानी आवश्यक है।
प्रत्यारोपण के बाद प्रत्यारोपित मानव अग्नाशय के आइलेट्स की छवि और ट्रैक करने के लिए वीवो तकनीकों में अभी भी मधुमेह अनुसंधान के लिए एक चुनौती बनी हुई है4,5 ,5. आज तक, पॉजिट्रॉन उत्सर्जन टोमोग्राफी (पीईटी), चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई), या अल्ट्रासाउंड (यूएस) सहित गैर-निवास इमेजिंग तकनीकें प्रायोगिक परिस्थितियों में प्रत्यारोपित आइलेट्स के क्वांटिफिकेशन और कार्यात्मक मूल्यांकन के लिए क्षमता दिखाती हैं5। हालांकि, छोटे आइलेट आकारों को देखते हुए, उन तौर-तरीकों द्वारा मात्रात्मक माप अपर्याप्त संकल्प से पीड़ित हैं । अवलोकन के लिए प्रत्यारोपण स्थल के रूप में आंखों का पूर्वकाल कक्ष (एसीई) एक आशाजनक नॉनइनवेसिव इमेजिंग समाधान है जो प्रभावी रूप से उच्च स्थानिक संकल्प और लंबे समय तक लगातार निगरानी की पेशकश करता है6। माउस आइलेट बायोलॉजी (यांग एट अल7में समीक्षा) का अध्ययन करने के लिए इस विधि का सफलतापूर्वक दोहन किया गया है , ऑटोइम्यून प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाएं8,साथ ही मानव आइलेट ग्राफ्टिंग9,,10।
यहां ऐस प्रत्यारोपण विधि प्रत्यारोपण के बाद 10 महीने तक के लिए व्यक्तिगत आइलेट ग्राफ्ट पर निरंतर और दोहराया रिकॉर्डिंग द्वारा मानव अग्नाशय आइलेट engraftment प्रक्रिया की गतिशीलता की जांच करने के लिए एक 2-फोटॉन इमेजिंग दृष्टिकोण के साथ संयुक्त है । अधिक इमेजिंग गहराई के मल्टीफोटॉन इमेजिंग गुण और समग्र फोटोब्लैचिंग और फोटो क्षति को कम करने से कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी11की इमेजिंग सीमाओं को दूर किया जाता है। फ्लोरोसेंट इमेजिंग के क्वांटिफिकेशन में कई चरण शामिल हैं, जिनमें आइलेट नमूना तैयारी, आइलेट प्रत्यारोपण, छवि अधिग्रहण, आइलेट शोर या पृष्ठभूमि को हटाने के लिए इमेज फ़िल्टरिंग, विभाजन, क्वांटिफिकेशन और डेटा विश्लेषण शामिल हैं। सबसे चुनौतीपूर्ण कदम आमतौर पर कई हिस्सों या क्षेत्रों में एक छवि को विभाजित या विभाजित करना है। इसमें पृष्ठभूमि शोर से सिग्नल को अलग करना, या रंग या आकार में समानताओं के आधार पर स्वरों के क्लस्टरिंग क्षेत्र शामिल हो सकते हैं ताकि 3 डी वॉल्यूम के स्वरों का पता लगाया जा सके और लेबल किया जा सके, जो आइलेट वेक्यूलेचर का प्रतिनिधित्व करता है, उदाहरण के लिए। एक बार खंडित होने के बाद, ऑब्जेक्ट वॉल्यूम आकार जैसे आंकड़े आमतौर पर निकालने के लिए सरल होते हैं। बशर्ते इमेजिंग डेटा की मात्रा और निष्कर्षण के लिए एक विधि है, जैसे विभाजन और डेटा विज़ुअलाइज़ेशन। विशेष ध्यान मानव आइलेट्स में ऑटोफ्लोरेसेंस को हटाने और आइलेट वैक्यूलेचर और आइलेट कैप्सूल बनाने प्राप्तकर्ता कोशिकाओं के बीच अंतर पर ध्यान दिया जाता है।
प्राप्तकर्ता और दाता ऊतक की भागीदारी को देख कर मानव अग्नाशय आइलेट सेल ग्राफ्टिंग प्रक्रिया का अध्ययन करने के लिए एक विधि प्रस्तुत की जाती है। एक इम्यूनोडिफिशिएंसी माउस आंख के पूर्वकाल कक्ष में मानव ?…
The authors have nothing to disclose.
इस अध्ययन को स्वीडिश रिसर्च काउंसिल, स्ट्रैटेजिक रिसर्च एरिया पलायन, डीएनआर 2009-1039, स्वीडिश फाउंडेशन फॉर स्ट्रैटेजिक रिसर्च डीएनआर आईआरसी15-0067 को लुंड-आईआरसी, लुंड में रॉयल फिजियोग्राफिक सोसायटी, डायबिटीजफ्रबंडडेट और बार्नडायबिटेसफोर्डेट द्वारा समर्थित किया गया था।
Anasthesia machine, e.g. Anaesthesia Unit U-400 | Agnthos | 8323001 | used for isofluran anasthesia during surgery and imaging |
-induction chamber 1.4 L | Agnthos | 8329002 | connect via tubing to U-400 |
-gas routing switch | Agnthos | 8433005 | connect via tubing to U-400 |
AngioSense 680 EX | Percin Elmer | NEV10054EX | imaging agent for injection, used to image blood vessels in human islet grafts |
Aspirator tubes assemblies | Sigma | A5177-5EA | connect with pulled capillary pipettes for manual islet picking |
Buprenorphine (Temgesic) 0.3mg/ml | Schering-Plough Europé | 64022 | fluid, for pain relief |
Capillary pipettes | VWR | 321242C | used together with Aspirator tubes assemblies |
Dextran-Texas Red (TR), 70kDa | Invitrogen | D1830 | imaging agent for injection |
Eye cannula, blunt end , 25 G | BVI Visitec/BD | BD585107 | custom made from Tapered Hydrode lineator [Blumenthal], dimensions: 0.5 x 22mm (25G x 7/8in) (45⁰), tip tapered to 30 G (0.3mm) |
Eye gel | Novartis | Viscotears, contains Carbomer 2 mg/g | |
Hamilton syringe 0.5 ml, Model 1750 TPLT | Hamilton | 81242 | Plunger type gas-tight syringe for islet injection |
Head holder | |||
-Head holding adapter | Narishige | SG-4N-S | assemled onto metal plate |
-gas mask | Narishige | GM-4-S | |
-UST-2 Solid Universal Joint | Narishige | UST-2 | assemled onto metal plate |
-custom made metal plate for head-holder assembly | |||
-Dumont #5, straight | Agnthos | 0207-5TI-PS or 0208-5-PS | attached to UST-2 (custom made) |
Heating pad, custom made | taped to the stereotaxic platform | ||
Human islet culture media | |||
-CMRL 1066 | ICN Biomedicals | cell culture media for human islets | |
-HEPES | GIBCO BRL | ||
-L-glutamin | GIBCO BRL | ||
-Gentamycin | GIBCO BRL | ||
-Fungizone | GIBCO BRL | ||
-Ciproxfloxacin | Bayer healthcare AG | ||
-Nicotinamide | Sigma | ||
Image analysis software | Bitplane | Imaris 9 | |
Image Aquisition software | Zeiss | ZEN 2010 | |
Infrared lamp | VWR | 1010364937 | used to keep animals warm in the wake-up cage |
Isoflurane Isoflo | Abott Scandinavia/Apotek | fluid, for anesthesia | |
Needle 25 G (0.5 x 16mm), orange | BD | 10442204 | used as scalpel |
Petri dishes, 90mm | VWR | 391-0440 | |
2-Photon/confocal microscope | |||
-LSM7 MP upright microscope | Zeiss | ||
-Ti:Sapphire laser Tsunami | Spectra-Physics, Mai Tai | ||
-long distance water-dipping lens 20x/NA1.0 | Zeiss | ||
-ET710/40m (Angiosense 680) | Chroma | 288003 | |
-ET645/65m-2p (TR) | Chroma | NC528423 | |
-ET525/50 (GFP) | Chroma | ||
-ET610/75 (tomato) | Chroma | ||
-main beam splitter T680lpxxr | Chroma | T680lpxxr | Dichroic mirror to transmit 690 nm and above and reflect 440 to 650 nm size 25.5 x 36 x 1 mm |
Polythene tubing (0.38mm ID, 1.09 mm OD) | Smiths Medical Danmark | 800/100/120 | to connect with Hamilton syringe and eye canula |
Stereomicroscope | Nikon | Model SMZ645, for islet picking | |
Stereomicroscope (Flourescence) | for islet graft imaging | ||
-AZ100 Multizoom | Nikon | wide field and long distance | |
-AZ Plan Apo 1x | Nikon | ||
-AZ Plan Apo 4x | Nikon | ||
-AZ-FL Epiflourescence with C-LHGFI HG lamp | Nikon | ||
-HG Manual New Intensilight | Nikon | ||
-Epi-FL Filter Block TEXAS RED | Nikon | contains EX540-580, DM595 and BA600-660 | |
-Epi-FL Filter Block G-2A | Nikon | (EX510-560, DM575 and BA590) | |
-Epi-FL Filter Block B-2A | Nikon | (EX450-490, DM505 and BA520) | |
-DS-Fi1 Colour Digital Camera (5MP) | Nikon | ||
Syringe 1-ml, Omnitix | Braun | 9161406V | for Buprenorphine injection, used with 27 G needle |
Surgical tape | 3M |