Le but de ce protocole est de surveiller en permanence la dynamique du processus d’engraftage des îlots pancréatiques humains et des cellules d’hôte par rapport aux donneurs. Ceci est accompli en transplantant des îlots humains dans la chambre antérieure de l’oeil (ACE) d’un NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-receveur de souris suivi d’une imagerie répétée à 2 photons.
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Article de méthode
Imagerie in vivo longitudinale et quantification des îlots pancréatiques humains Greffant et contribution des cellules hôtes dans la chambre oculaire antérieure
Dans cet article
Résumé
Résumé
L’imagerie des cellules bêta est une étape clé vers la compréhension de la transplantation d’îlots. Bien que différentes plates-formes d’imagerie pour l’enregistrement de la biologie des cellules bêta aient été développées et utilisées in vivo,elles sont limitées en termes de résolution à cellule unique et d’enregistrements longitudinals continus. En raison de la transparence de la cornée, la chambre antérieure de l’œil (ACE) chez la souris est bien adapté pour étudier la biologie des cellules d’îlots pancréatiques humains et de souris. Voici une description de la façon dont cette approche peut être utilisée pour effectuer des enregistrements longitudinals continus de greffe et de revascularisation des greffes d’îlots humains individuels. Les greffes d’îlots humains sont insérées dans l’ACE, à l’aide de NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-souris en tant que receveurs. Cela permet l’étude de l’expansion des cellules de receveur par rapport aux donneurs et de la contribution des cellules bénéficiaires dans la promotion de l’encapsulation et de la vascularisation de la greffe. De plus, une approche étape par étape pour l’analyse de l’image et la quantification du volume de l’îlot ou de la vasculature segmentée et de la capsule d’îlot formant des cellules destinataires est décrite.
Introduction
Le diabète sucré décrit un groupe de maladies métaboliques caractérisées par des niveaux élevés de glucose sanguin comme résultats de la production insuffisante d’insuline de la perte ou du dysfonctionnement des cellules bêta d’îlot pancréatique, souvent accompagnés par la résistance à l’insuline. Le diabète de type 1 (T1D) et le diabète de type 2 (T2D) sont des maladies complexes dans lesquelles le dysfonctionnement progressif des cellules bêta provoque le développement de la maladie. Le T1D est précipité par une attaque auto-immune sur les cellules bêta, tandis que le T2D est considéré comme étant motivé par des facteurs métaboliques, bien qu’avec des preuves croiss....
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Protocole
Le Comité régional d’éthique de Lund, en Suède, a approuvé l’étude conformément à la Loi sur l’examen éthique de la recherche impliquant des humains. Les expériences animales ont été réalisées dans le strict respect de l’éthique suédoise des expériences animales et approuvées par les comités d’éthique de Malmö et Lund. NOD immunodéficient de 6 à 8 semaines. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/- (NOD. ROSA-tomate. Rag2-/-) souris receveurs ont été utilisés comme receveurs pour la transplantation d’îlots humains10.
1. Préparation des îlots pour la tran....
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Résultats
Des îlots humains non étiquetés ont été transplantés dans l’ACE du NOD femelle de 8 semaines. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-(NOD. ROSA-tomate. Rag2−/−) souris destinataires. Pour empêcher le rejet de tissu humain, les souris knock-out immunodéficientes de Rag2 ont été choisies comme destinataires. Chez ces souris transgéniques, toutes les cellules et tissus ont exprimé une protéine de fluorescence de tomate (mT) ciblée par membrane qui permet un.......
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Discussion
Une méthode est présentée pour étudier le processus de greffe de cellules d’îlot pancréatique humaine en observant la participation du tissu de destinataire et de donneur. Après une chirurgie invasive minimale implantant des îlots humains dans la chambre antérieure d’un œil de souris immunodéficient, la souris récupère rapidement dans les minutes qui s' adressent à la chirurgie. La procédure est effectuée sur un œil. En général, à partir de 5 à 7 jours après l’implantation, la cornée est suffisamment guérie pour effectue.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Cette étude a été soutenue par le Conseil suédois de la recherche, la zone de recherche stratégique Exodiab, Dnr 2009-1039, la Fondation suédoise pour la recherche stratégique Dnr IRC15-0067 à LUDC-IRC, la Royal Physiographic Society à Lund, Diabetesförbundet et Barndiabetesförbundet.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Appareil d’anesthésie, par exemple unité d’anesthésie U-400 | Agnthos | 8323001 | utilisé pour l’anesthésie à l’isofluran pendant l’opération et |
| la chambre d’imagerie d’induction 1,4 L | Agnthos | 8329002 | se connecter via une tubulure à l’interrupteur |
| de routage de gaz | Agnthos | 8433005 | se connecter via une tubulure à l’U-400 |
| AngioSense 680 EX | Percin | Elmer NEV10054EX | agent d’imagerie injectable, utilisé pour l’imagerie des vaisseaux sanguins dans les greffes d’îlots de Langerhans humains |
| Assemblages de tubes d’aspirateur | Sigma | A5177-5EA | se connectent avec des pipettes capillaires tirées pour le prélèvement manuel des îlots de Langerhans |
| Buprénorphine (Temgesic) 0,3 mg/ml | Schering-Plough Europé ; | 64022 | fluide, pour soulager la douleur |
| Pipettes capillaires | VWR | 321242C | utilisées avec les ensembles de tubes d’aspirateur |
| Dextran-Texas Red (TR), 70kDa | Invitrogen | D1830 | d’imagerie pour injection |
| Canule oculaire, extrémité émoussée, 25 G | BVI Visitec/BD | BD585107 | fabriqué sur mesure à partir du linéateur Tapered Hydrode [Blumenthal], dimensions : 0,5 x 22 mm (25G x 7/8 po) (45 ?), pointe effilée à 30 G ( 0,3mm) |
| Gel pour les yeux | Novartis | Viscotears, contient Carbomer 2 mg/g | |
| Seringue Hamilton 0,5 ml, Modèle 1750 TPLT | Hamilton | 81242 | Seringue étanche aux gaz de type piston pour injection d’îlots |
| Support de tête | |||
| Adaptateur de maintien de tête | Narishige | SG-4N-S | monté sur |
| masque à gaz | Narishige | GM-4-S-UST-2 | |
| Joint universel solide | Narishige | UST-2 | assemblé sur plaque |
| métallique-Plaque métallique sur mesure pour l’assemblage | |||
| #5, droit | Agnthos | 0207-5TI-PS ou 0208-5-PS | fixé à UST-2 (sur mesure) |
| Coussin chauffant, fabriqué sur | collé à la plate-forme stéréotaxique | ||
| Milieux de culture d’îlots humains | |||
| -CMRL 1066 | ICN Biomedicals milieux de | culture cellulaire pour îlots | |
| humains-HEPES | GIBCO BRL-L-glutamin | ||
| GIBCO BRL-Gentamycine | |||
| GIBCO BRL-Fungizone | |||
| GIBCO BRL | |||
| -Ciproxfloxacin | Bayer healthcare AG-Nicotinamide | ||
| Sigma | d’analyse d’images | ||
| Bitplane | Imaris 9 | ||
| Logiciel d’acquisition d’images | Zeiss | ZEN 2010 | |
| Lampe infrarouge | VWR | 1010364937 | utilisée pour garder les animaux au chaud dans la cage de réveil |
| Isoflurane Isoflo | Abott Fluide Scandinavia/Apotek | , pour l’anesthésie | |
| Aiguille 25 G (0,5 x 16 mm), orange | BD | 10442204 | utilisé comme scalpel |
| Boîtes de Pétri, 90mm | VWR | 391-0440 | |
| 2-Photon/microscope confocal | |||
| -LSM7 MP microscope vertical | Zeiss-Ti | ||
| :Sapphire laser Tsunami | Spectra-Physics, Mai Tai-lentille | ||
| longue distance de trempage à l’eau 20x/NA1.0 | |||
| /40m (Angiosense 680) | Chroma | ||
| /65m-2p (TR) | Chroma | ||
| /50 (GFP) | |||
| /75 (tomate) | Chroma-faisceau | ||
| principal séparateur T680lpxxr | Chroma | T680lpxxr | Miroir dichroïque pour transmettre 690 nm et plus et réfléchir 440 à 650 nm taille 25,5 x 36 x 1 mm |
| Tube en polyéthylène (0,38 mm ID, 1,09 mm OD) | Smiths Medical Danmark | 800/100/120 | pour se connecter avec la seringue Hamilton et la canule oculaire |
| Stéréomicroscope | Nikon | Modèle SMZ645, pour le prélèvement d’îlots | |
| Stéréomicroscope (Fluorescence) | pour l’imagerie des greffes | ||
| Multizoom | Nikon | grand champ et longue | |
| distance-AZ Plan Apo 1x | Nikon-AZ | ||
| Plan Apo 4x | Nikon-AZ-FL | ||
| Epiflourescence avec lampe C-LHGFI HG | Nikon-HG | ||
| Manuel Nouveau Intensilight | Nikon | ||
| - Bloc de filtre EPI-FL TEXAS RED | Nikon | contient EX540-580, DM595 et BA600-660-Bloc | |
| de filtre Epi-FL G-2A | Nikon | (EX510-560, DM575 et BA590) | |
| -Bloc de filtre Epi-FL B-2A | Nikon | (EX450-490, DM505 et BA520) | |
| -DS-Fi1 Appareil photo numérique couleur (5MP) | |||
| Seringue Nikon 1-ml, Omnitix | Braun | 9161406V | pour injection de buprénorphine, utilisé avec une aiguille de 27 G |
| Ruban chirurgical | 3M |
Références
- Kharroubi, A. T., Darwish, H. M. Diabetes mellitus: The epidemic of the century. World Journal of Diabetes. 6 (6), 850-867 (2015).
- Kanak, M. A., et al. Inflammatory response in islet transplantation. International Journal of Endocrinology. 2014,....
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Réimpressions et autorisations
