Summary
Le but de ce protocole est de surveiller en permanence la dynamique du processus d’engraftage des îlots pancréatiques humains et des cellules d’hôte par rapport aux donneurs. Ceci est accompli en transplantant des îlots humains dans la chambre antérieure de l’oeil (ACE) d’un NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-receveur de souris suivi d’une imagerie répétée à 2 photons.
Abstract
L’imagerie des cellules bêta est une étape clé vers la compréhension de la transplantation d’îlots. Bien que différentes plates-formes d’imagerie pour l’enregistrement de la biologie des cellules bêta aient été développées et utilisées in vivo,elles sont limitées en termes de résolution à cellule unique et d’enregistrements longitudinals continus. En raison de la transparence de la cornée, la chambre antérieure de l’œil (ACE) chez la souris est bien adapté pour étudier la biologie des cellules d’îlots pancréatiques humains et de souris. Voici une description de la façon dont cette approche peut être utilisée pour effectuer des enregistrements longitudinals continus de greffe et de revascularisation des greffes d’îlots humains individuels. Les greffes d’îlots humains sont insérées dans l’ACE, à l’aide de NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-souris en tant que receveurs. Cela permet l’étude de l’expansion des cellules de receveur par rapport aux donneurs et de la contribution des cellules bénéficiaires dans la promotion de l’encapsulation et de la vascularisation de la greffe. De plus, une approche étape par étape pour l’analyse de l’image et la quantification du volume de l’îlot ou de la vasculature segmentée et de la capsule d’îlot formant des cellules destinataires est décrite.
Introduction
Le diabète sucré décrit un groupe de maladies métaboliques caractérisées par des niveaux élevés de glucose sanguin comme résultats de la production insuffisante d’insuline de la perte ou du dysfonctionnement des cellules bêta d’îlot pancréatique, souvent accompagnés par la résistance à l’insuline. Le diabète de type 1 (T1D) et le diabète de type 2 (T2D) sont des maladies complexes dans lesquelles le dysfonctionnement progressif des cellules bêta provoque le développement de la maladie. Le T1D est précipité par une attaque auto-immune sur les cellules bêta, tandis que le T2D est considéré comme étant motivé par des facteurs métaboliques, bien qu’avec des preuves croissantes de l’inflammation systémique de qualité basse1. La transplantation d’îlots humains donneurs, en particulier pour les patients atteints de T1D, offre le potentiel de fournir un contrôle glycémique physiologique. Cependant, une pénurie de donneurs de tissus et une mauvaise engreffement d’îlots a empêché la transplantation d’îlots de devenir une option thérapeutique courante. Une proportion substantielle de la greffe fonctionnelle d’îlot est perdue dans la période immédiate de posttransplantation (24–48 h) due à l’environnement d’hôte hypoxique, inflammatoire, immunogénique2,3. Pour évaluer l’efficacité des méthodes d’intervention pour l’amélioration de la survie des îlots, un suivi continu de ces transplantations est nécessaire.
In vivo techniques pour l’image et le suivi du sort des îlots pancréatiques humains transplantés après la transplantation reste un défi pour la recherche sur le diabète4,5. À ce jour, les techniques d’imagerie non invasive, y compris la tomographie par émission de positrons (TEP), l’imagerie par résonance magnétique (IRM) ou l’échographie (US) présentent un potentiel de quantification et d’évaluation fonctionnelle des îlots transplantés dans des conditions expérimentales5. Toutefois, compte tenu de la petite taille des îlots, les mesures quantitatives effectuées par ces modalités souffrent d’une résolution insuffisante. La chambre antérieure de l’œil (ACE) comme site de transplantation pour l’observation est une solution d’imagerie non invasive prometteuse offrant effectivement une résolution spatiale plus élevée et une surveillance fréquente sur de longues périodes de temps6. Cette méthode a été exploitée avec succès pour étudier la biologie des îlots de souris (revue dans Yang et coll.7), les réponses immunitaires auto-immunes8, ainsi que la greffe d’îlot humain9,10.
Ici, la méthode de transplantation ACE est combinée avec une approche d’imagerie de 2 photons pour étudier la dynamique du processus d’engraftment de l’îlot pancréatique humain par des enregistrements continus et répétés sur des greffes d’îlots individuels pendant jusqu’à 10 mois après la transplantation. Les propriétés d’imagerie multiphoton de plus grandes profondeurs d’imagerie et de photobleaching global réduit et dommages de photo surmontent les limitations d’imagerie de la microscopie confocale11. La quantification de l’imagerie fluorescente comporte plusieurs étapes, y compris la préparation de l’échantillon d’îlots, la transplantation d’îlots, l’acquisition d’images, le filtrage d’images pour éliminer le bruit ou le fond des îlots, la segmentation, la quantification et l’analyse des données. L’étape la plus difficile consiste généralement à partitionner ou segmenter une image en plusieurs parties ou régions. Cela pourrait impliquer la séparation du signal du bruit de fond, ou le regroupement des régions de voxels en fonction de similitudes de couleur ou de forme pour détecter et étiqueter les voxels d’un volume 3D qui représente la vascularisation des îlots, par exemple. Une fois segmentées, les statistiques telles que la taille du volume d’objets sont généralement simples à extraire. Fourni est une méthode de quantification et d’extraction des données d’imagerie, telles que la segmentation et la visualisation des données. Une attention particulière est accordée à l’élimination de l’autofluorescence dans les îlots humains et à la distinction entre la vascularisation des îlots et la capsule d’îlot formant des cellules destinataires.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Le Comité régional d’éthique de Lund, en Suède, a approuvé l’étude conformément à la Loi sur l’examen éthique de la recherche impliquant des humains. Les expériences animales ont été réalisées dans le strict respect de l’éthique suédoise des expériences animales et approuvées par les comités d’éthique de Malmö et Lund. NOD immunodéficient de 6 à 8 semaines. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/- (NOD. ROSA-tomate. Rag2-/-) souris receveurs ont été utilisés comme receveurs pour la transplantation d’îlots humains10.
1. Préparation des îlots pour la transplantation
- Îlots humains de culture en CMRL 1066 complétés par 10 mM HEPES, 2 mM L-glutamine, 50 μg/mL de gentamycine, 0,25 μg/mL de champignonszone, 20 μg/mL ciproxfloxacine, 10 mM nicotinamide (NIC), et 10% sérum humain inactivé thermique à 37 °C dans 5% CO2 et l’air humidifié jusqu’à la transplantation, comme décrit précédemment12.
REMARQUE : Les îlots doivent être exempts de tissu exocrine et ne pas se toucher en culture. Les tissus exocrines semblent translucides. - Le jour de la transplantation, transférez des supports de culture contenant les îlots dans une nouvelle boîte de Pétri à l’aide d’un ensemble de tubes d’aspiration relié à un capillaire en verre tiré.
REMARQUE : Sinon, utilisez une pipette de 200 μL. La coloration du dos de la boîte de Pétri permet de rendre les îlots plus facilement reconnaissables sous le microscope stéréo. - À l’aide d’un microscope stéréo, choisissez des îlots de 20 à 40 par transplantation et transférez-les dans un tube de 1,5 mL. Remplissez le tube au sommet avec des supports culturels de l’incubateur.
- Sceller les tubes avec du film de paraffine et les conserver sur la glace jusqu’à la transplantation. Préparer une quantité appropriée pour le nombre de transplantations effectuées.
- Sinon, assurez-vous qu’un incubateur de CO2 est disponible dans la salle de chirurgie pour garder les îlots en culture et les cueillir immédiatement avant chaque transplantation.
2. Préparation de matériel de transplantation et de table de chirurgie
REMARQUE : Tous les outils chirurgicaux doivent être autoclaved, et la table de chirurgie et les instruments désinfectés avec 70% d’alcool.
- Connectez un support de tête stéréotaxique à l’anesthésie via un masque de nez et allumez le coussin chauffant.
- Connectez une seringue Hamilton à un tube en polyéthylène et à une canule émoussée pour les yeux finaux.
REMARQUE : Il est recommandé de remplir toutes les pièces avec pbs avant l’assemblage. Vérifiez s’il y a des bulles d’air emprisonnées et retirez-les si elles sont présentes. - Attachez la seringue Hamilton étroitement à la table (figure 1a) ou à une base mobile (figure 1e)et attachez le tube au microscope stéréo, avec une canule suspendue (c.-à-d. position d’attente).
REMARQUE : Utilisez du ruban chirurgical, car il est facile d’enlever et de rattacher. - Préparer une seringue de 1 mL reliée à une aiguille de 30 G remplie d’une solution de buprénorphine de 0,1 mg/kg.
- Préparer une seringue avec pbs stérile. Sinon, utilisez une pipette.
- Réserver une cage de réveil propre avec lampe chauffante.
3. Anesthésie et positionnement des souris receveurs pour la chirurgie
REMARQUE : Tous les animaux ont été élevés et maintenus dans un environnement exempt d’agents pathogènes dans les installations pour animaux de l’Université de Lund.
- Anesthésiez la souris dans une chambre remplie de 40% O2/60% N2/3% isoflurane et transférez la souris anesthésiée sur la plate-forme du support de tête sur un coussin chauffant chaud (Figure 1a). Vérifiez l’absence de réflexes de pédale.
NOTE : L’anesthésie isoflurane est la méthode préférée d’anesthésie pour la récupération rapide après chirurgie. La salle de microscope doit être correctement ventilée pour utiliser l’isoflurane. - Placez le museau de la souris dans le masque d’anesthésie relié à 40% O2/60% N2/0,9%–1,5% isoflurane machine d’anesthésie. Utilisez le pouce et le doigt pour soulever légèrement la tête et la fixer à l’aide des morceaux métalliques sur les côtés. Assurez-vous que les écouteurs fixent la tête directement sous les oreilles. Injecter une solution de buprénorphine de 0,1 mg/kg à l’arrière de la souris.
REMARQUE : La buprénorphine est utilisée comme analgésique. - Inclinez la tête de sorte que l’œil à opérer est orienté vers le haut et est proche du chercheur.
- Rétractez doucement les paupières de l’œil à transplanter à l’aide de forceps émoussés, sortez l’œil et fixez-les avec une pince à épiler. Assurez-vous que les pointes des pinces sont recouvertes d’un tube de polyéthylène fixé à la plate-forme du support de tête(figure 1a, insert).
- Gardez toujours les deux yeux mouillés en appliquant une gouttelette de PBS stérile sur l’œil.
- Transférer les îlots humains du tube scellé de 1,5 mL (section 1) vers une boîte de Pétri avec pbs stérile et s’assurer que les îlots sont proches les uns des autres pour minimiser la quantité de milieux de culture cellulaire transférés (Figure 1c).
- Ramasser des îlots de 20 à 30 dans la canule oculaire reliées par des tubes en polyéthylène à la seringue hamiltonien.
REMARQUE : Prenez le moins de liquide possible avec les îlots. - Accrochez le tube à l’envers et attachez-le au microscope stéréo (Figure 1d). Collez soigneusement les tubes pour laisser les îlots couler jusqu’à l’extrémité du tube vers la canule.
4. Procédure de transplantation
REMARQUE : Cette méthode a déjà été décrite pour la transplantation d’îlots de souris6. Une procédure légèrement modifiée est présentée ici.
- Pincez les coussinets sur les pattes postérieures pour vous assurer que la souris dort.
- Serrez les forceps qui retiennent l’œil sans perturber le flux sanguin et appliquez une gouttelette de PBS stérile sur l’œil.
- À l’aide d’une aiguille de 25 G comme scalpel, biseauter vers le haut, pénétrer soigneusement seulement la moitié de la pointe dans la cornée et faire une incision latérale unique. Faire le trou dans un angle vers le haut; le trou se scellera plus facilement après la greffe (Figure 1f).
- Soulevez soigneusement la cornée avec la canule préchargée avec des îlots et appliquez lentement les îlots dans l’œil. Évitez l’insertion de la canule dans la chambre antérieure pour éviter les dommages de l’iris, mais plutôt pousser soigneusement contre l’ouverture cornéenne (Figure 1g). Rétractez lentement la canule de l’ACE.
REMARQUE : Visez un volume d’injection de 3 à 8 μL. Si le volume est trop grand, il exposera l’œil à une pression intraoculaire inutilement élevée et peut entraîner le reflux des îlots injectés hors de la chambre antérieure. - Lorsque vous rencontrez des difficultés d’insertion des îlots en raison d’une pression accrue dans la chambre des yeux, agrandir le site d’incision en renforçant le site d’incision latérale et réappliquer les îlots.
REMARQUE : De temps en temps, des bulles d’air introduites peuvent être utilisées comme supports d’espace. - Appliquez du gel pour les yeux sur l’œil, desserrez les forceps qui retiennent les yeux et laissez la souris sur l’isoflurane dans la même position pendant 8 à 10 min pour laisser les îlots se mettre.
- Retirez les forceps qui tiennent la paupière et remettez la paupière à sa position normale.
- Retirez la souris du support de la tête et transférez-la dans une cage de réveil.
- Lorsque la souris est éveillée et en mouvement, transférez-la dans la cage d’origine et gardez-la dans le logement pour animaux jusqu’à ce qu’elle soit scannant (au moins 5 jours sont recommandés).
5. Imagerie des îlots humains implantés par microscopie 2-photon
REMARQUE : Il est recommandé de prendre des images d’ensemble de l’œil à l’aide d’un microscope stéréoscopique fluorescence (figure 2a– c) 4 à 5 jours après la transplantation avant l’imagerie 2-photons pour localiser les îlots d’intérêt. Évitez de retenir l’œil trop étroitement si tôt après la transplantation. Utilisez l’imagerie 2-photon 6–7 jours après la transplantation.
- Démarrez le logiciel d’acquisition d’images(voir Tableau des matériaux ). Dans le menu "Laser" activer le laser Mai Tai (Power "ON« ) et dans le menu "Light Path" définissent la longueur d’onde à 900 nm et appliquent une puissance laser de transmission minimale à partir de 5%–10% de puissance laser (utiliser des curseurs).
REMARQUE : Lors de la numérisation, réglez la puissance laser au besoin. - Placez les canaux verts, oranges et rouges. Recueillir simultanément la lumière d’émission sur trois détecteurs non à inspire (NDD) à l’aide d’un miroir dichronique (LBF 760) et des informations sur les filtres d’émission comme suit : Rouge/Angiosense 680, 690–730 nm; Vert/Autofluorescence, 500–550 nm; et Orange/Tomate, 565–610nm (figure 2d).
- Placez la scène du support de tête sur le stade du microscope motorisé et connectez le masque à gaz au tube de la machine d’anesthésie et aux tubes reliés au système de ventilation. Allumez le coussin chauffant.
- Anesthésiez la souris destinataire, transférez à la plate-forme du support de tête, retenez l’œil pour l’imagerie et administrez la solution de buprénorphine comme décrit ci-dessus (étapes 3.1–3.5).
- Ajuster les vapeurs d’isoflurane au besoin. Un taux d’haleine de ~55–65 respirations par minute (bpm) indique une anesthésie optimale. Si l’anesthésie est trop profonde, le taux sera de <50 bpm avec une respiration lourde ou haletant; si trop léger, le taux sera >70 bpm avec une respiration superficielle. Surveillez attentivement les souris pendant l’anesthésie par inspection visuelle toutes les 15 minutes.
NOTE : L’anesthésie varie d’une souris à l’autre, entre les souches de souris, et au fur et à mesure que le temps sous anesthésie progresse13. - Administrer suffisamment de gel pour les yeux sur l’œil comme liquide d’immersion entre la cornée et la lentille, ce qui lui permet de s’accumuler lentement(figure 2f, insérer). Évitez les bulles d’air.
REMARQUE : L’éclairage latéral avec une lampe flexible de tuyau en métal est recommandé pour ajuster la mise au point et localiser les greffes d’îlot. - Pour visualiser les vaisseaux sanguins, administrer 100 μL de l’agent d’imagerie (p. ex., Angiosense 680) par voie intraveineuse dans la veine de la queue à l’aide d’une seringue jetable d’insuline 30 G.
- Enmode " Acquisition« , ajuster la taille du cadre à 512 x 512 et la vitesse de numérisation.
REMARQUE : Des analyses plus lentes (c.-à-d. augmentation du temps d’habitation) amélioreront le rapport signal/bruit. - Dans le menu "Canaux« , ajustez Master Gain pour chaque PMT en Volts afin d’amplifier le signal jusqu’à ce qu’une image soit vue à l’écran en mode numérisation en direct. Plus cette valeur est élevée, plus le détecteur devient sensible au signal et au bruit.
REMARQUE : De préférence, gardez les valeurs entre 500 et 800 V. - Dans le menu «Z-stack», définissez le début et la fin de la pile z en déplaçant manuellement la mise au point vers le haut de la greffe d’îlot. Enregistrer la position en sélectionnant "Set First« . Passez au dernier plan inférieur qui peut être concentré dans la greffe de l’îlot et enregistrez la position en sélectionnant «Set Last». Utilisez une taille z-step de 2 μm.
- Collectez la pile d’images finale en cliquant sur l’onglet «Démarrer l’expérience» et enregistrez sous forme de fichier CZI 8 bits (c.-à-d. le format Carl Zeiss).
6. Imagerie des îlots humains implantés par microscopie confocale
REMARQUE : Le volume total, la morphologie et la plasticité des îlots transplantés peuvent être évalués en surveillant le signal de diffusion in vivo dans un balayage séparé (c.-à-d. une voie séparée) par détection de la lumière rétrodiffusion laser10.
- Retirez le séparateur de faisceau principal (c.-à-d. filtre LBF) et dans le dialogue «Voie lumineuse» a mis en place une piste distincte pour l’imagerie confocale. Choisissez le laser Argon avec une longueur d’onde de 633 nm et la détection à la même longueur d’onde que la lumière laser. Les piles Z sont acquises avec une taille d’étape de 2 à 3 μm pour le signal lumineux rétrodiffusion.
- Réajuster les paramètres de la pile z pour vous assurer d’enregistrer l’ensemble de l’îlot (voir l’étape 5.10).
- Acquérir la pile d’images et enregistrer sous forme de fichier CZI 8 bits.
7. Analyse d’image
REMARQUE : Un logiciel commercial (voir tableau des matériaux)a été utilisé pour cette étape.
- Suppression de l’autofluorescence des îlots (Figure 3b)
- Dansl’onglet " Traitement d’image" choisissez "Channel arithmétique" et tapez "ch1-ch2« . Cela crée un nouveau canal 4 (ch 4); renommer "Vasculature« .
REMARQUE : Le canal Vert/Autofluorescence est soustrait du canal Red/Angiosense. - Répétez l’étape précédente et tapez «ch3-ch2» pour créer un nouveau canal (ch 5); renommer "Tomate (tous) « .
REMARQUE : Le canal Vert/Autofluorescence est soustrait du canal Orange/Tomate.
- Dansl’onglet " Traitement d’image" choisissez "Channel arithmétique" et tapez "ch1-ch2« . Cela crée un nouveau canal 4 (ch 4); renommer "Vasculature« .
- Définition du masque d’îlot par dessin manuel (Figure 3c)
- Créez une nouvelle surface (symbole bleu) et dans l’Assistant choisissez "Modifier manuellement« . Gardez le pointeur en mode "Sélectionner" et en vue 3D unclick "Volume" (sous Scène) pour visualiser les sections.
- Pour faciliter la discrimination aux frontières des îlots, activez tous les canaux, y compris le ch 1–ch 3.
REMARQUE : Le canal Orange/Tomate est utile pour définir les bordures d’îlots par le signal de la capsule Tomato. Alternativement, augmenter les intensités de canal pour utiliser l’autofluorescence multicanal d’îlot et le signal de fond de détecteur comme orientation. - Dans l’onglet "Dessin" choisissez "Contour" et cliquez sur "Dessiner" pour commencer à dessiner les contours autour de la bordure de l’îlot à partir de la position de tranche 1.
- Passez à une nouvelle position de tranche et répétez les contours du dessin. Terminez avec la dernière tranche sur le dessus de l’îlot et terminez en cliquant sur l’onglet «Créer une surface». Habituellement, il suffit de dessiner des contours toutes les10 e tranche.
- Segmentation de la «vasculature d’îlot» et de la fluorescencede la « tomate islet» à l’aide d’un masque d’îlot ( figure3d).
- Choisissez l’objet «Masque d’îlot» précédemment défini, accédez à l’onglet d’édition (symbolede crayon) et cliquez sur l’onglet «Masque tous», qui ouvre une nouvelle fenêtre.
- Choisissez le canal précédemment nommé "Vasculature" (ch 4) dans le menu déroulant de sélection de canal et activez les options "Double-canal avant d’appliquer le masque« , "Constant inside/outside« , et définissez voxels extérieur à "0.000« , ce qui crée un nouveau canal; renommer "Islet vascularature" (ch 6).
- Répétez les étapes 7.3.1 et 7.3.2 et choisissez le canal précédemment créé "Tomate (tous) " (ch 5) dans le menu déroulant sélection de canal pour créer le nouveau canal ; renommer "Islet tomate" (ch 7).
- Rendu de surface de la vasculature des îlots (Figure 3e)
- Créez une nouvelle surface dans le menu «Scène» et dans l’Assistant, choisissez «Création automatique».
- Définissez le canal source sur la «vascularature de l’îlot» créée précédemment (ch 6) et choisissez la soustraction d’arrière-plan. L’estimation automatique du seuil peut être ajustée si nécessaire. Comparez au canal de fluorescence répondant (p. ex., en mélangeant l’onglet surface nouvellement créé). Procédez dans l’Assistant.
- En option, utilisez des filtres. Par exemple, choisissez «Volume» et réglez le filtre (jaune) dans la fenêtre, qui peut supprimer les objets de surface sélectionnés. Terminez l’assistant et nommez le nouvel objet de surface «Vase vascularature d’îlot».
- Segmentation du signal de fluorescence dela « vasculature de tomate d’îlot» (Figure 3f)
- Dans l’objet de surface «Vaset vascularature » précédemment créé, accédez à l’onglet édition et cliquez sur l’onglet «Masque tous», qui ouvre une nouvelle fenêtre.
- Choisissez le canal précédemment nommé "Islet tomate" (ch 7) dans le menu déroulant de sélection de canal et définissez voxels extérieur surface à "10.000« , qui crée le nouveau canal; renommer "Vasecularature de tomate d’Islet" (ch 8).
- Segmentation du signal de fluorescence dela « capsule de tomate»(figure 3g)
- Choisissez "Channel Arithmetic’s" dans l’onglet "Traitement d’image" et tapez "ch7-ch8« , créant le nouveau canal; renommer "Capsule de tomate" (ch 9).
NOTE: Le signal de fluorescence dela " vasculature de tomate d’îlot" est soustrait du signal total de fluorescence dela tomate d’îlot.
- Choisissez "Channel Arithmetic’s" dans l’onglet "Traitement d’image" et tapez "ch7-ch8« , créant le nouveau canal; renommer "Capsule de tomate" (ch 9).
- Rendu de surface de "Vasecularature de tomate d’îlot" et "Capsule de tomate" ( Figure3h)
- Suivez l’étape 7.4, et dans l’Assistant choisissez les canaux source "Vasecularature de tomate d’îlot" (ch 8) ou "Capsule de tomate" (ch 9) pour créer de nouveaux objets de surface en conséquence.
- Rendu de surface de la surface totale des îlots (Figure 3i)
- Ouvrez le fichier backsdatter de l’îlot et créez une nouvelle surface.
- Dans l’Assistant, choisissez «Création automatique» et définissez «Région d’intérêt».
REMARQUE : «Région d’intérêt» est utilisée pour séparer les signaux de plusieurs îlots et pour définir la profondeur de l’îlot à analyser (p. ex., 75 μm supérieurs). - En "intensité absolue" ajuster le seuil si nécessaire. L’objet de surface peut être cliqué sur ou en dehors pour recouper avec l’intensité correspondante du canal. Fermez l’Assistant.
- Quantification (Figure 3j)
- Sélectionnez un objet de surface créé dans le menu «Scène» et accédez à l’onglet «Statistiques».
- Pour récupérer des données de volume détaillées dans l’objet de surface sélectionné, choisissez l’onglet «Détaillé» et sélectionnez «Valeurs spécifiques» et «Volume» dans le menu déroulant. Pour récupérer une valeur totale en volume de l’objet de surface sélectionné, accédez à l’onglet «Détaillé» et choisissez «Valeurs moyennes».
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Des îlots humains non étiquetés ont été transplantés dans l’ACE du NOD femelle de 8 semaines. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-(NOD. ROSA-tomate. Rag2−/−) souris destinataires. Pour empêcher le rejet de tissu humain, les souris knock-out immunodéficientes de Rag2 ont été choisies comme destinataires. Chez ces souris transgéniques, toutes les cellules et tissus ont exprimé une protéine de fluorescence de tomate (mT) ciblée par membrane qui permet une identification claire du receveur et du tissu donneur. L’imagerie répétée des greffes d’îlots par microscopie à 2 photons haute résolution pourrait identifier les cellules mT+ receveurs impliquées dans le processus d’engrafment et leur modèle de migration dynamique.
En général, la configuration de transplantation d’îlots humains dans l’ACE des souris receveurs (Figure 1a) était similaire aux transplantations d’îlots syngénéiques en ce qui concerne la forme et la taille des îlots (figure 1b,c). Figure 1d,e montre une transplantation typique avec un schéma détaillé montrant le site d’incision latérale (figure 1f) et la dispersion des îlots dans la chambre des yeux (Figure 1g) et un résultat représentatif des îlots de souris injectés (Figure 1h) ou îlots humains (Figure 1i). Le taux de greffe des îlots humains était généralement plus faible (~30%) que les îlots de souris (50–70%). Une raison possible de cet écart est que la disponibilité des îlots humains est imprévisible, généralement avec seulement un préavis d’un jour, et aussi que les îlots obtenus varient dans l’âge du donneur, l’IMC des donneurs, la pureté (45%–86%), et le temps de culture postisolation (2–5 jours). En revanche, les isolements des îlots des souris peuvent être facilement planifiés. Ceux-ci ont été isolés de 6 à 8 semaines (c.-à-d. les jeunes adultes) souris avec une grande pureté et court, temps de culture de nuit. Ces écarts entre les greffes de souris et d’îlots humains doivent être pris en considération lors de l’interprétation des résultats.
L’imagerie par fluorescence in vivo des greffes d’îlots humains a été compromise par une interférence importante de l’autofluorescence tissulaire (figure 4). La visualisation du processus de revascularisation des greffes d’îlots humains transplantées par des agents d’imagerie utilisant des longueurs d’onde traditionnelles dans le spectre visible a été entravée par un faible rapport signal/bruit et un niveau élevé d’autofluorescence naturelle des îlots, illustré par des images d’un balayage λ dans la gamme spectrale de 500–700 nm (figure 4a) ou par le détecteur sensible de PMP non dédessé avec filtre pour la détection du dextran TR (610–675 nm) (figure 4b). Ce fond élevé n’a pas été observé dans les greffes d’îlots de souris (figure 4c). L’agent d’imagerie émetteur NIR Angiosense 680 a montré un rapport signal-arrière visiblement plus élevé en raison de la diminution du bruit de fond dans la plage de NIR 690–730 nm (Figure 4d, Figure 3a). L’enregistrement supplémentaire d’un canal « inutilisé » (c.-à-d. 500–550 nm) pourrait être utilisé dans une étape ultérieure de traitement d’image pour éliminer le bruit de fond restant causé par l’autofluorescence naturelle des îlots. La configuration d’imagerie 2-photon/confocal (figure 2d–f) est similaire à celles décrites précédemment6, sauf pour l’utilisation de 900 nm 2-photon excitation et la détection de fluorescence de Angiosense 680, autofluorescence, et les canaux de tomate avec pmts non dénecés 1-3 (Figure 2d). Il est conseillé de mesurer la puissance de sortie laser atteignant l’échantillon pour chaque configuration de microscope (Figure 2e). En outre, il est recommandé d’imaginer d’abord les îlots greffés avec la stéréomicroscopie (Figure 2a–c), qui aidera à sélectionner les îlots d’intérêt et d’éviter les images de microscopie à 2 photons d’une transplantation infructueuse.
Le but de l’extraction de données quantitatives à partir de nombreuses images était d’éliminer les biais potentiels dans la sélection des données et d’obtenir la puissance statistique nécessaire pour détecter un effet légitime lors de la comparaison des expériences. La quantification de l’imagerie fluorescente des îlots pancréatiques a impliqué plusieurs étapes, chacune d’entre elles pouvant avoir influencé les résultats dans un autre. Ici, un logiciel d’imagerie interactive a été utilisé. Il contient des fonctionnalités permettant la visualisation des images et des objets en volume et l’identification des objets en fonction de leur morphologie ou de leur intensité. La figure 3 illustre les différentes étapes de la segmentation de l’image. L’élimination de l’autofluorescence par soustraction du canal « autofluorescence » a amélioré le rapport signal/bruit (figure 3a,b). La limite de l’îlot appelée « masque d’îlot » (figure 3c) et les canaux correspondants (figure 3d) ont été définies manuellement. La segmentation du signal de tomate dans la vasculature de l’îlot et la capsule d’îlots (figure 3f,g) et le rendu final de surface (figure 3e,h,i) a été utilisée pour extraire des données quantitatives.
La figure 5 montre une séance d’imagerie longitudinale représentative de la même greffe d’îlot humain à 2 semaines, 2 mois, 5 mois et 8 mois après la transplantation dans l’ACE d’un NOD. ROSA-tomate. Rag2-/- souris destinataire. Les projections d’intensité maximale (MIP) sont des images de données RAW enregistrées à l’origine (Figure 5a), des images traitées après l’enlèvement de l’autofluorescence des îlots (figure 5b–e, f–i),et des objets d’îlots segmentés, y compris la capsule (figure 5j,m) ou la vasculature de l’îlot formant mT+ cellules bénéficiaires (rouge, figure 5n–q) et la vasculature totale des îlots (vert, figure 5n–q).
Figure 1 : Transplantation d’îlots pancréatiques dans la chambre antérieure de l’œil.
aa) Configuration de transplantation montrant souris anesthésiée fixée dans le support de tête stéréotaxique et l’œil exposé (encart) à côté de la seringue Hamilton préparée fixée à la table et le stéréomicroscope prêt à ramasser les îlots de souris (b) ou les îlots humains (c). dd) Position d’attente de la canule oculaire chargée d’îlots. ee) Transplantation en cours, etf) dessin schématique d’une seule incision latérale utilisée pour soulever soigneusement la cornée avec la pointe de la canule de l’œil et distribuer des îlots dans la chambre antérieure (g). Image de l’œil immédiatement après l’injection d’îlots de souris (h) ou d’îlots humains (i). Barre d’échelle = 500 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Imagerie des greffes d’îlots pancréatiques implantées par l’ACE.
aa) Configuration expérimentale d’imagerie par microscope stéréo. Widefield (b) ou image fluorescente (c) de B6. ROSA-greffes d’îlots de tomates. d) Schéma simplifié de la trajectoire de la lumière d’émission. LBF : Filtre à blocage laser (séparateur de faisceau principal); LP: Long pass; BP: Passe de bande; PMT: Photomultiplicier. Ee) La puissance de sortie laser dépend fortement de la longueur d’onde. Le diagramme montre la puissance réelle de sortie de laser dans Watts (W) liée au niveau de puissance du faisceau laser (%), mesurée pour la configuration de microscope. Cercle : 800 nm, carré : 900 nm, triangle : 1 000 nm. ff) Configuration expérimentale de l’imagerie montrant la souris destinataire avec des îlots greffés ACE (insert) montés sur le stade motorisé un microscope commercial. Barre d’échelle = 100 μm Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Segmentation d’image d’un îlot humain greffé dans l’ACE d’un NOD. ROSA-tomate. Rag2-/- souris destinataire.
(a) Enregistrement original : Montré est un rendu 3D d’une pile d’images d’un îlot humain avec des canaux fusionnés ou des sections optiques des canaux fractionnés Angiosense 680 (ch 1), l’autofluorescence (ch 2) et la tomate (ch 3). b) Rendu 3D de la pile d’images avec canaux fusionnés ou sections optiques avec canaux fractionnés "Vasculature" (ch 4) et "Tomate(tous)" (ch 5) après l’enlèvement de l’autofluorescence. cc) Masque d’îlot (jaune). (d) Rendu 3D de la pile d’images avec canaux fusionnés ou fendus "vase vasculature d’îlot" (ch 6, blanc), "tomate d’îlot" (ch 7, rouge). (e) Objet de surface "vasesculature d’îlot" créé à partir de ch 6. (f) Rendu 3D de la pile d’images avec canaux fusionnés "vase vasculature d’îlot" (ch 6, vert) et "vase vascularature de tomate d’îlot" (ch 8, rouge). (g) Rendu 3D de la «capsule de tomate» (ch 9) après la soustraction de canal ch 7–ch 8 ou section optique avec canaux fusionnés " capsule detomate" (ch 9, blanc), vaseculature de tomate d’îlot (ch 8, rouge), et vascularature d’îlot (ch 6, vert). hh) Rendu de surface de la capsule de tomate (créée à partir de ch 9) et de la vasculature de tomate d’îlot (créée à partir de ch 8). ii) Segmentation des îlots à partir du signal de rétrodiffusion des îlots humains montrant la sélection de la «région d’intérêt» (à gauche) et de l’objet de surface segmenté (milieu) par rapport à l’intensité du canal (à droite). jj) Récupération des données à partir de l’onglet statistiques. Barre d’échelle = 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4 : Autofluorescence des îlots humains.
Les îlots humains (a,b,d) ou B6 îlots de souris (c) ont été transplantés dans l’ACE de NOD. Rag2-/- ou B6 souris receveurs et injecté avec dextran TR (a–c) ou Angiosense 680 agent d’imagerie (d) pour la visualisation des vaisseaux sanguins. (a) λ-scan de greffe d’îlot humain à la plage de 500 à 700 nm avec excitation de 2 photons à 900 nm. Image maximale de projection d’image (MIP) de greffe d’îlot humain (b) oud’îlotde souris ( c ) excitée à 900 nm et détectée avec le filtre TR (610–675 nm) du NDD. (d) MIP d’une greffe d’îlot humain excité à 900 nm et détection avec le filtre Angiosense 680 (690–730 nm) du NDD. Barre d’échelle = 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5 : Les îlots humains transplantés sont progressivement revascularisés et encapsulés par des cellules exprimant l’état de mT d’origine receveur.
Îlots humains transplantés dans la chambre oculaire antérieure de NOD. ROSA-tomate. Les souris destinataires rag2−/− ont été photographiées à plusieurs reprises pendant une vingtaine de mois. Angiosense 680 a été injecté pour la visualisation de la vascularisation. aa) Projections d’intensité maximale (MIP) des données RAW enregistrées originales des canaux de fractionnement (vasculature, autofluorescence, mT) ou fusionnés et du signal lumineux de rétrodiffusion à 5 mois après la transplantation. MIPS de la vascularisation totale seule (b–e) ou fusionnée avec la fluorescence de tomate à membrane ciblée (mT) (f–i) après l’enlèvement de l’autoflourescence des îlots (vert, a). Rendus 3D de la capsule de tomates d’îlot segmentées (j–m) et de la vasculature de tomate d’îlot (rouge) ou de la vasculature totale d’îlot (vert) (n–q) aux points de temps indiqués après la transplantation. Barre d’échelle = 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Une méthode est présentée pour étudier le processus de greffe de cellules d’îlot pancréatique humaine en observant la participation du tissu de destinataire et de donneur. Après une chirurgie invasive minimale implantant des îlots humains dans la chambre antérieure d’un œil de souris immunodéficient, la souris récupère rapidement dans les minutes qui s' adressent à la chirurgie. La procédure est effectuée sur un œil. En général, à partir de 5 à 7 jours après l’implantation, la cornée est suffisamment guérie pour effectuer l’imagerie intravitale.
Dans ce protocole, la qualité des greffes d’îlots humains est essentielle. La qualité des îlots humains et donc les résultats de transplantation peuvent varier selon l’âge, l’IMC et le processus d’isolement du donneur, ainsi que le temps de la culture des îlots avant et après l’arrivée. Les îlots humains traités à partir de pancréas donneurs d’organes approuvés à des fins cliniques de transplantation et de recherche ont été utilisés avec le consentement des donneurs. Ils ont été obtenus après un processus de digestion du pancréas et de purification des îlots décrit ailleurs12. Semblables aux îlots murins isolés, ces îlots subissent un certain nombre d’agressions cellulaires telles que l’ischémie, le stress mécanique, la perte de protéines du sous-sol et la perturbation partielle des cellules endothéliales intra-îlots (CE) au cours de l’étape de digestion enzymatique14,15. Malgré l’amélioration constante des conditions culturelles et le rétablissement d’un grand nombre d’îlots humains de haute qualité, le temps de la transplantation reste un facteur critique. Au cours des premiers jours de la culture, les îlots humains montrent une perte significative de CE intra-îlot et sur six jours de culture, seules de petites structures endothéliales dans le noyau de l’îlot peuvent être détectées16. Cette perte de cellules endothéliales intra-îlot pourrait constituer un facteur critique dans la réduction de la greffe des îlots humains, parce que les EC des îlots donneurs sont des acteurs importants dans le processus de revascularisation17.
Le maintien de la stérilité pendant la procédure de transplantation est essentiel pour éviter les infections oculaires dans le NOD immunodéprimé. ROSA-tomate. Rag2-/- souris. En règle générale, les procédures de transplantation sont effectuées dans des conditions propres à l’aide de gants, manteau de laboratoire, couvre-chef et masque buccal, mais pas à l’intérieur d’une armoire de biosécurité. Toutes les solutions utilisées sont filtrées stériles, et les seringues, les canules, les tubes et la gaze sont rincés à 70 % d’éthanol. Les cages de réveil sont autoclaved. Bien que la stérilité complète ne peut pas être garantie en raison de la manipulation manuelle de la souris pendant la procédure, la contamination des îlots ou des infections oculaires n’ont pas été des problèmes avec cette procédure.
L’anesthésie stable et adéquate est un facteur important et critique pour réduire les mouvements oculaires et la dérive lors de l’acquisition de données à faible framerate, et l’efficacité peut varier entre les différents agents anesthésiques18. Sous la lumière, anesthésie isoflurane générale, l’œil se déplace occasionnellement d’une manière lente de roulement et de profondeur accrue de l’anesthésie (de 1 à 2%) peut généralement réduire les mouvements oculaires. L’avantage évident de l’utilisation de l’anesthésie inhalable est son effet rapide et le temps de récupération. Il convient toutefois de souligner que l’utilisation de l’isoflurane peut modifier la sécrétion d’insuline19.
L’analyse et la segmentation d’images, ou le partitionnement d’une image en plusieurs régions, sont difficiles et sujettes à un biais potentiel dans la sélection des données20. La segmentation vise à identifier des objets comme la « vasculature d’îlot » pour la quantification. Ici, des méthodes basées sur le seuil d’intensité ont été appliquées à certaines régions (c.-à-d. « intensité absolue ») ou des différences d’intensité pour trouver des bords (c.-à-d. une « soustraction de fond »). Actuellement, il n’existe pas de solutions universelles pour la segmentation de la microscopie fluorescente. Une approche consiste à expérimenter avec des logiciels commerciaux qui supportment. Si le seuil échoue en raison de la variation de l’intensité de l’arrière-plan, de petits changements dans les paramètres de capture d’image peuvent améliorer les résultats de segmentation.
Une limitation de la méthode réside dans le fait que la greffe humaine est plus rapidement remplacée par des cellules receveurs et, en fait, entièrement reconstituée par les cellules endothéliales du receveur de souris. Cela empêcherait les études des interactions des cellules humaines si le but est d’étudier les cellules immunitaires humaines transférées de façon adoptive qui migrent dans le parenchyme de l’îlot par le biais d’interactions avec les cellules endothéliales humaines. Cependant, dans les greffes de souris et d’îlots humains, la revascularisation semblable se produit du destinataire et suit le plan anatomique différent 3D spécifique pour l’espèce.
Les taux de réussite de la thérapie de remplacement des cellules bêta ont continué à s’améliorer. Néanmoins, divers défis dans l’évaluation de l’efficacité de la greffe et de la survie des îlots in vivo restent en suspens en raison du manque de technologies d’imagerie intravitale appropriées. La chambre oculaire antérieure est un site de transplantation utile, soutenant l’imagerie in vivo répétée et à long terme des cellules d’îlot pour l’étude de la morphologie d’îlot, des modèles de vascularisation, de la fonction de cellules bêta, et de la mort de cellules bêta à une résolution cellulaire.
Le protocole d’étude du processus de greffe des greffes d’îlots humains dans le site de transplantation ACE rapporté ici permet la surveillance longitudinale des greffes d’îlots humains avec une résolution considérablement plus élevée que celle obtenue avec d’autres plates-formes longitudinales alternatives telles que l’IRM21,22, PET23, SPECT24, ou Bioluminescence25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Cette étude a été soutenue par le Conseil suédois de la recherche, la zone de recherche stratégique Exodiab, Dnr 2009-1039, la Fondation suédoise pour la recherche stratégique Dnr IRC15-0067 à LUDC-IRC, la Royal Physiographic Society à Lund, Diabetesförbundet et Barndiabetesförbundet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anasthesia machine, e.g. Anaesthesia Unit U-400 | Agnthos | 8323001 | used for isofluran anasthesia during surgery and imaging |
| -induction chamber 1.4 L | Agnthos | 8329002 | connect via tubing to U-400 |
| -gas routing switch | Agnthos | 8433005 | connect via tubing to U-400 |
| AngioSense 680 EX | Percin Elmer | NEV10054EX | imaging agent for injection, used to image blood vessels in human islet grafts |
| Aspirator tubes assemblies | Sigma | A5177-5EA | connect with pulled capillary pipettes for manual islet picking |
| Buprenorphine (Temgesic) 0.3mg/ml | Schering-Plough Europé | 64022 | fluid, for pain relief |
| Capillary pipettes | VWR | 321242C | used together with Aspirator tubes assemblies |
| Dextran-Texas Red (TR), 70kDa | Invitrogen | D1830 | imaging agent for injection |
| Eye cannula, blunt end , 25 G | BVI Visitec/BD | BD585107 | custom made from Tapered Hydrode lineator [Blumenthal], dimensions: 0.5 x 22mm (25G x 7/8in) (45?), tip tapered to 30 G (0.3mm) |
| Eye gel | Novartis | Viscotears, contains Carbomer 2 mg/g | |
| Hamilton syringe 0.5 ml, Model 1750 TPLT | Hamilton | 81242 | Plunger type gas-tight syringe for islet injection |
| Head holder | |||
| -Head holding adapter | Narishige | SG-4N-S | assemled onto metal plate |
| -gas mask | Narishige | GM-4-S | |
| -UST-2 Solid Universal Joint | Narishige | UST-2 | assemled onto metal plate |
| -custom made metal plate for head-holder assembly | |||
| -Dumont #5, straight | Agnthos | 0207-5TI-PS or 0208-5-PS | attached to UST-2 (custom made) |
| Heating pad, custom made | taped to the stereotaxic platform | ||
| Human islet culture media | |||
| -CMRL 1066 | ICN Biomedicals | cell culture media for human islets | |
| -HEPES | GIBCO BRL | ||
| -L-glutamin | GIBCO BRL | ||
| -Gentamycin | GIBCO BRL | ||
| -Fungizone | GIBCO BRL | ||
| -Ciproxfloxacin | Bayer healthcare AG | ||
| -Nicotinamide | Sigma | ||
| Image analysis software | Bitplane | Imaris 9 | |
| Image Aquisition software | Zeiss | ZEN 2010 | |
| Infrared lamp | VWR | 1010364937 | used to keep animals warm in the wake-up cage |
| Isoflurane Isoflo | Abott Scandinavia/Apotek | fluid, for anesthesia | |
| Needle 25 G (0.5 x 16mm), orange | BD | 10442204 | used as scalpel |
| Petri dishes, 90mm | VWR | 391-0440 | |
| 2-Photon/confocal microscope | |||
| -LSM7 MP upright microscope | Zeiss | ||
| -Ti:Sapphire laser Tsunami | Spectra-Physics, Mai Tai | ||
| -long distance water-dipping lens 20x/NA1.0 | Zeiss | ||
| -ET710/40m (Angiosense 680) | Chroma | 288003 | |
| -ET645/65m-2p (TR) | Chroma | NC528423 | |
| -ET525/50 (GFP) | Chroma | ||
| -ET610/75 (tomato) | Chroma | ||
| -main beam splitter T680lpxxr | Chroma | T680lpxxr | Dichroic mirror to transmit 690 nm and above and reflect 440 to 650 nm size 25.5 x 36 x 1 mm |
| Polythene tubing (0.38mm ID, 1.09 mm OD) | Smiths Medical Danmark | 800/100/120 | to connect with Hamilton syringe and eye canula |
| Stereomicroscope | Nikon | Model SMZ645, for islet picking | |
| Stereomicroscope (Flourescence) | for islet graft imaging | ||
| -AZ100 Multizoom | Nikon | wide field and long distance | |
| -AZ Plan Apo 1x | Nikon | ||
| -AZ Plan Apo 4x | Nikon | ||
| -AZ-FL Epiflourescence with C-LHGFI HG lamp | Nikon | ||
| -HG Manual New Intensilight | Nikon | ||
| -Epi-FL Filter Block TEXAS RED | Nikon | contains EX540-580, DM595 and BA600-660 | |
| -Epi-FL Filter Block G-2A | Nikon | (EX510-560, DM575 and BA590) | |
| -Epi-FL Filter Block B-2A | Nikon | (EX450-490, DM505 and BA520) | |
| -DS-Fi1 Colour Digital Camera (5MP) | Nikon | ||
| Syringe 1-ml, Omnitix | Braun | 9161406V | for Buprenorphine injection, used with 27 G needle |
| Surgical tape | 3M |
References
- Kharroubi, A. T., Darwish, H. M. Diabetes mellitus: The epidemic of the century. World Journal of Diabetes. 6 (6), 850-867 (2015).
- Kanak, M. A., et al. Inflammatory response in islet transplantation. International Journal of Endocrinology. 2014, 451035 (2014).
- Nanji, S. A., Shapiro, A. M. Advances in pancreatic islet transplantation in humans. Diabetes, Obesity, Metabolism. 8 (1), 15-25 (2006).
- Malaisse, W. J., Maedler, K. Imaging of the beta cells of the islets of Langerhans. Diabetes Research and Clinical Practice. 98 (1), 11-18 (2012).
- Kim, D., Jun, H. S. In Vivo Imaging of Transplanted Pancreatic Islets. Frontiers in Endocrinology. 8, 382 (2017).
- Speier, S., et al. Noninvasive high-resolution in vivo imaging of cell biology in the anterior chamber of the mouse eye. Nature Protocols. 3 (8), 1278-1286 (2008).
- Yang, S. N., Berggren, P. O. The eye as a novel imaging site in diabetes research. Pharmacology, Therapeutics. 197, 103-121 (2019).
- Schmidt-Christensen, A., et al. Imaging dynamics of CD11c(+) cells and Foxp3(+) cells in progressive autoimmune insulitis in the NOD mouse model of type 1 diabetes. Diabetologia. 56 (12), 2669-2678 (2013).
- Berclaz, C., et al. Longitudinal three-dimensional visualisation of autoimmune diabetes by functional optical coherence imaging. Diabetologia. 59 (3), 550-559 (2016).
- Nilsson, J., et al. Recruited fibroblasts reconstitute the peri-islet membrane: a longitudinal imaging study of human islet grafting and revascularisation. Diabetologia. 63 (1), 137-148 (2020).
- Benninger, R. K., Piston, D. W. Two-photon excitation microscopy for the study of living cells and tissues. Current Protocols in Stem Cell Biology. , Chapteer 4 Unit 4 11-24 (2013).
- Goto, M., et al. Refinement of the automated method for human islet isolation and presentation of a closed system for in vitro islet culture. Transplantation. 78 (9), 1367-1375 (2004).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5563 (2011).
- Jansson, L., Carlsson, P. O. Graft vascular function after transplantation of pancreatic islets. Diabetologia. 45 (6), 749-763 (2002).
- Konstantinova, I., Lammert, E. Microvascular development: learning from pancreatic islets. Bioessays. 26 (10), 1069-1075 (2004).
- Fransson, M., et al. Mesenchymal stromal cells support endothelial cell interactions in an intramuscular islet transplantation model. Regenerative Medicine Research. 3, 1 (2015).
- Nyqvist, D., et al. Donor islet endothelial cells in pancreatic islet revascularization. Diabetes. 60 (10), 2571-2577 (2011).
- Nair, G., et al. Effects of common anesthetics on eye movement and electroretinogram. Documenta Ophthalmologica. Advances in Ophthalmology. 122 (3), 163-176 (2011).
- Iwasaka, H., et al. Glucose intolerance during prolonged sevoflurane anaesthesia. Canadian Journal of Anaesthesia. 43 (10), 1059-1061 (1996).
- Hamilton, N. Quantification and its applications in fluorescent microscopy imaging. Traffic. 10 (8), 951-961 (2009).
- Michelotti, F. C., et al. PET/MRI enables simultaneous in vivo quantification of beta-cell mass and function. Theranostics. 10 (1), 398-410 (2020).
- Wang, P., et al. Monitoring of Allogeneic Islet Grafts in Nonhuman Primates Using MRI. Transplantation. 99 (8), 1574-1581 (2015).
- Gotthardt, M., et al. Detection and quantification of beta cells by PET imaging: why clinical implementation has never been closer. Diabetologia. 61 (12), 2516-2519 (2018).
- Joosten, L., et al. Measuring the Pancreatic beta Cell Mass in Vivo with Exendin SPECT during Hyperglycemia and Severe Insulitis. Molecular Pharmaceutics. 16 (9), 4024-4030 (2019).
- Virostko, J., et al. Bioluminescence imaging in mouse models quantifies beta cell mass in the pancreas and after islet transplantation. Molecular Imaging and Biology. 12 (1), 42-53 (2010).
