Het doel van dit protocol is om continu de dynamiek van het menselijke alvleesklier eilandje engraftment proces en de bijdragende gastheer versus donorcellen te controleren. Dit wordt bereikt door het transplanteren van menselijke eilandjes in de voorste kamer van het oog (ACE) van een NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4–Rag2-/-muisontvanger gevolgd door herhaalde 2-foton beeldvorming.
Imaging bètacellen is een belangrijke stap in de richting van inzicht in eilandjestransplantatie. Hoewel verschillende beeldvormingsplatforms voor de registratie van bètacelbiologie in vivozijn ontwikkeld en gebruikt, zijn ze beperkt in termen van het toestaan van eencellige resolutie en continue longitudinale opnames. Vanwege de transparantie van het hoornvlies is de voorkamer van het oog (ACE) bij muizen zeer geschikt om de biologie van menselijke en muizenalvleeskliercelen te bestuderen. Hier is een beschrijving van hoe deze aanpak kan worden gebruikt om continue longitudinale opnames van enten en revitalisering van individuele menselijke eilandjes enten uit te voeren. Menselijke eilandjestransplantaties worden in de ACE ingebracht met behulp van NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4–Rag2-/-muizen als ontvangers. Dit maakt het mogelijk om de uitbreiding van ontvanger versus donorcellen en de bijdrage van de ontvangende cellen bij het bevorderen van de inkapseling en vascularisatie van het transplantaat mogelijk te maken. Verder wordt een stapsgewijze benadering geschetst voor beeldanalyse en kwantificering van het eilandjevolume of gesegmenteerde vasculatuur en eilandjescapsule die ontvangende cellen vormt.
Diabetes mellitus beschrijft een groep van metabole ziekten gekenmerkt door verhoogde niveaus van bloedglucose als resultaten van onvoldoende insulineproductie van verlies of disfunctie van pancreas islet bètacellen, vaak vergezeld van insulineresistentie. Type 1 (T1D) en type 2 diabetes (T2D) zijn complexe ziekten waarbij de progressieve disfunctie van de bètacellen ziekteontwikkeling veroorzaakt. T1D wordt neergeslagen door een auto-immuunaanval op de bètacellen, terwijl T2D wordt beschouwd als aangedreven door metabole factoren, zij het met toenemend bewijs van low-grade systemische ontsteking1. Transplantatie van donor menselijke eilandjes, met name voor T1D-patiënten, biedt het potentieel voor het verstrekken van fysiologische glycemische controle. Echter, een tekort aan weefseldonoren en slechte eilandjes engraftment heeft voorkomen dat eilandjetransplantatie uitgegroeid tot een mainstream therapeutische optie. Een aanzienlijk deel van het functionele eilandjetransplantatie gaat verloren in de onmiddellijke posttransplantatieperiode (24-48 uur) als gevolg van de hypoxische, inflammatoire, immunogene gastheeromgeving2,3. Om de efficiëntie van interventiemethoden voor de verbetering van de overleving van eilandjes te evalueren, is continue monitoring van dergelijke transplantaties noodzakelijk.
In vivo technieken om beeld en het lot van getransplanteerde menselijke alvleesklier eilandjes na transplantatie blijft nog steeds een uitdaging voor diabetes onderzoek4,5. Tot op heden tonen niet-invasieve beeldvormingstechnieken, waaronder positronemissietomografie (PET), magnetic resonance imaging (MRI) of echografie (VS) potentieel voor de kwantificering en functionele evaluatie van getransplanteerde eilandjes in experimentele omstandigheden5. Gezien de kleine eilandjesgroottes hebben kwantitatieve metingen op deze modaliteiten echter onvoldoende resolutie. De voorste oogkamer (ACE) als transplantatielocatie voor observatie is een veelbelovende niet-invasieve beeldvormingsoplossing die effectief een hogere ruimtelijke resolutie en frequente monitoring over lange periodenbiedt 6. Deze methode is met succes benut om muis eilandje biologie te bestuderen (beoordeeld in Yang et al.7), auto-immuunreacties 8 ,evenalsmenselijk eilandje enten9,10.
Hier wordt de ACE-transplantatiemethode gecombineerd met een 2-fotonbeeldvormingsbenadering om de dynamiek van het menselijke alvleesklierenteletproces te onderzoeken door continue en herhaalde opnames op individuele eilandjestransplantaten tot 10 maanden na transplantatie. De multifoton beeldvormingseigenschappen van grotere beelddiepten en verminderde algehele fotobleaching en fotoschade overwinnen de beeldvormingsbeperkingen van confocale microscopie11. Kwantificering van fluorescerende beeldvorming omvat verschillende fasen, waaronder het voorbereiden van eilandjesvoorbeelden, eilandjestransplantatie, beeldverwerving, beeldfiltering om eilandjesruis of achtergrond, segmentatie, kwantificering en gegevensanalyse te verwijderen. De meest uitdagende stap is meestal het partitioneren of segmenteren van een afbeelding in meerdere delen of regio’s. Dit kan het scheiden van signaal van achtergrondgeluid, of clustering regio’s van voxels op basis van gelijkenissen in kleur of vorm te detecteren en labelvoxels van een 3D-volume dat eilandje vasculatuur vertegenwoordigt, bijvoorbeeld. Eenmaal gesegmenteerd, statistieken zoals object volume maten zijn meestal eenvoudig te extraheren. Voorzien is een methode voor de kwantificering en extractie van de beeldgegevens, zoals segmentatie en datavisualisatie. Bijzondere aandacht wordt besteed aan het verwijderen van autofluorescentie in menselijke eilandjes en onderscheid tussen eilandje vasculatuur en eilandje capsule vormen ontvanger cellen.
Een methode wordt gepresenteerd om het menselijke alvleesklier eilandjeceltransplantatieproces te bestuderen door de betrokkenheid van ontvanger en donorweefsel te observeren. Na een minimale invasieve operatie die menselijke eilandjes implanteert in de voorkamer van een immunodeficiënt muizenoog, herstelt de muis snel binnen enkele minuten na de operatie. De procedure wordt uitgevoerd op één oog. Over het algemeen is het hoornvlies vanaf 5-7 dagen na de implantatie voldoende genezen om intravital beeldvorming uit te …
The authors have nothing to disclose.
Deze studie werd ondersteund door de Zweedse Onderzoeksraad, Strategisch Onderzoeksgebied Exodiab, Dnr 2009-1039, de Zweedse Stichting voor Strategisch Onderzoek Dnr IRC15-0067 aan LUDC-IRC, de Royal Physiographic Society in Lund, Diabetesförbundet en Barndiabetesförbundet.
Anasthesia machine, e.g. Anaesthesia Unit U-400 | Agnthos | 8323001 | used for isofluran anasthesia during surgery and imaging |
-induction chamber 1.4 L | Agnthos | 8329002 | connect via tubing to U-400 |
-gas routing switch | Agnthos | 8433005 | connect via tubing to U-400 |
AngioSense 680 EX | Percin Elmer | NEV10054EX | imaging agent for injection, used to image blood vessels in human islet grafts |
Aspirator tubes assemblies | Sigma | A5177-5EA | connect with pulled capillary pipettes for manual islet picking |
Buprenorphine (Temgesic) 0.3mg/ml | Schering-Plough Europé | 64022 | fluid, for pain relief |
Capillary pipettes | VWR | 321242C | used together with Aspirator tubes assemblies |
Dextran-Texas Red (TR), 70kDa | Invitrogen | D1830 | imaging agent for injection |
Eye cannula, blunt end , 25 G | BVI Visitec/BD | BD585107 | custom made from Tapered Hydrode lineator [Blumenthal], dimensions: 0.5 x 22mm (25G x 7/8in) (45⁰), tip tapered to 30 G (0.3mm) |
Eye gel | Novartis | Viscotears, contains Carbomer 2 mg/g | |
Hamilton syringe 0.5 ml, Model 1750 TPLT | Hamilton | 81242 | Plunger type gas-tight syringe for islet injection |
Head holder | |||
-Head holding adapter | Narishige | SG-4N-S | assemled onto metal plate |
-gas mask | Narishige | GM-4-S | |
-UST-2 Solid Universal Joint | Narishige | UST-2 | assemled onto metal plate |
-custom made metal plate for head-holder assembly | |||
-Dumont #5, straight | Agnthos | 0207-5TI-PS or 0208-5-PS | attached to UST-2 (custom made) |
Heating pad, custom made | taped to the stereotaxic platform | ||
Human islet culture media | |||
-CMRL 1066 | ICN Biomedicals | cell culture media for human islets | |
-HEPES | GIBCO BRL | ||
-L-glutamin | GIBCO BRL | ||
-Gentamycin | GIBCO BRL | ||
-Fungizone | GIBCO BRL | ||
-Ciproxfloxacin | Bayer healthcare AG | ||
-Nicotinamide | Sigma | ||
Image analysis software | Bitplane | Imaris 9 | |
Image Aquisition software | Zeiss | ZEN 2010 | |
Infrared lamp | VWR | 1010364937 | used to keep animals warm in the wake-up cage |
Isoflurane Isoflo | Abott Scandinavia/Apotek | fluid, for anesthesia | |
Needle 25 G (0.5 x 16mm), orange | BD | 10442204 | used as scalpel |
Petri dishes, 90mm | VWR | 391-0440 | |
2-Photon/confocal microscope | |||
-LSM7 MP upright microscope | Zeiss | ||
-Ti:Sapphire laser Tsunami | Spectra-Physics, Mai Tai | ||
-long distance water-dipping lens 20x/NA1.0 | Zeiss | ||
-ET710/40m (Angiosense 680) | Chroma | 288003 | |
-ET645/65m-2p (TR) | Chroma | NC528423 | |
-ET525/50 (GFP) | Chroma | ||
-ET610/75 (tomato) | Chroma | ||
-main beam splitter T680lpxxr | Chroma | T680lpxxr | Dichroic mirror to transmit 690 nm and above and reflect 440 to 650 nm size 25.5 x 36 x 1 mm |
Polythene tubing (0.38mm ID, 1.09 mm OD) | Smiths Medical Danmark | 800/100/120 | to connect with Hamilton syringe and eye canula |
Stereomicroscope | Nikon | Model SMZ645, for islet picking | |
Stereomicroscope (Flourescence) | for islet graft imaging | ||
-AZ100 Multizoom | Nikon | wide field and long distance | |
-AZ Plan Apo 1x | Nikon | ||
-AZ Plan Apo 4x | Nikon | ||
-AZ-FL Epiflourescence with C-LHGFI HG lamp | Nikon | ||
-HG Manual New Intensilight | Nikon | ||
-Epi-FL Filter Block TEXAS RED | Nikon | contains EX540-580, DM595 and BA600-660 | |
-Epi-FL Filter Block G-2A | Nikon | (EX510-560, DM575 and BA590) | |
-Epi-FL Filter Block B-2A | Nikon | (EX450-490, DM505 and BA520) | |
-DS-Fi1 Colour Digital Camera (5MP) | Nikon | ||
Syringe 1-ml, Omnitix | Braun | 9161406V | for Buprenorphine injection, used with 27 G needle |
Surgical tape | 3M |