Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Kultur af Brain Kapillære Pericytes for cytosolic calcium målinger og calcium Imaging Undersøgelser

Published: May 27, 2020 doi: 10.3791/61253
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Pharmacy, The Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen

Summary

Hjernen kapillær pericytter er væsentlige aktører i reguleringen af blod - hjerne barrieren egenskaber og blodgennemstrømning. Denne protokol beskriver, hvordan hjernen kapillær pericytter kan isoleres, kulturperler, karakteriseret med hensyn til celletype og anvendes til undersøgelser af intracellulære calcium signalering med fluorescerende sonder.

Abstract

Pericytter er forbundet med endotelceller og astrocytiske endfeet i en struktur kendt som neurovaskulær enhed (NVU). Hjernen kapillær pericyte funktion er ikke fuldt kendt. Pericytter er blevet foreslået at være involveret i kapillær udvikling, regulering af endotel barriere tæthed og trancytose aktivitet, regulering af kapillær tone og til at spille afgørende roller i visse hjernen patologier.

Pericytes er udfordrende at undersøge i den intakte hjerne på grund af vanskelighederne med at visualisere processer i hjernen parenkym, samt tæt på de andre celler i NVU. Denne protokol beskriver en metode til isolering og kultur af primære kvæg hjerne kapillær pericytter og deres følgende brug i calcium billeddannelse undersøgelser, hvor virkningerne af agonister involveret i hjernen signalering og patologier kan undersøges. Kortikale kapillærfragmenter får lov til at binde sig til bunden af kulturkolber, og efter 6 dage er endotelceller og pericytter vokset ud af kapillærfragmenterne. Endotelcellerne fjernes ved blid trypsinisering, og pericytter dyrkes i yderligere 5 dage, før de passerer.

Isolerede pericytter er seedet i 96-brønd kultur plader og fyldt med calcium indikator farvestof (Fura-2 acetoxymethyl (AM)) for at give mulighed for målinger af intracellulære calcium niveauer i en pladelæser setup. Alternativt er pericytter sået på coverslips og monteret i cellekamre. Efter belastning med calciumindikatoren (Cal-520 AM) kan calcium levende billeddannelse udføres ved hjælp af konfokal mikroskopi ved en excitationsbølgelængde på 488 nm og emissionsbølgelængde på 510-520 nm.

Den metode, der er beskrevet her, er blevet anvendt til at opnå de første intracellulære calciummålinger fra primære hjernekapillære pericytter, hvilket viser, at pericytter stimuleres via ATP og er i stand til at indgå kontrakter in vitro.

Introduction

Hjerne kapillær pericytter, sammen med endotelceller og astrocytter, udgør NVU1,2,3. Endotelcellerne, som udgør det strukturelle grundlag for kapillærerne, danner lange cylindriske rør med en diameter på 5-8 μm. Endotelcellerne er sporadisk dækket med pericytter og omgivet af fremspring fra astrocytter; den astrocyte endfeet.

Blod- og hjernebarrieren (BBB), der ligger ved hjernekapillærerne, er det vigtigste sted for udveksling af næringsstoffer, gasser og affaldsprodukter mellem hjernen og blodet. BBB beskytter også hjernen mod endogene og udefrakommende neurotoksiner og fungerer som en barriere for levering af et stort antal narkotikaforbindelser. Barrierefunktionen er et fokusområde, samt en hindring for medicinalfirmaer, der udvikler lægemidler fra centralnervesystemet (CNS). Dette har ansporet en stor interesse i at undersøge cellerne i NVU i kultur4. Hjernen astrocytter og endotelceller er blevet dyrket og karakteriseret i en række undersøgelser, mens undersøgelser og protokoller for pericyte kultur er sparsomme.

Tidligere offentliggjorte protokoller har beskrevet generation af hjernen kapillær pericyte kulturer til en vis grad, ved hjælp af en række forskellige tilgange såsom immunopanning5,høj- og lavglose medier6, fluorescerende-aktiveret celle sortering7, tæthed gradient centrifugering8, osv. Selv om disse metoder synes tilstrækkelige til at opnå kulturer af pericytes, nogle er tidskrævende, omkostninger dyre og pericytes opnået måske ikke være ideel på grund af antallet af kultur passager, der kan de-differentiere pericytes9. Desuden har potentialet i dyrkede pericytes in vitro signalering undersøgelser været temmelig uudforsket indtil nu.

Det nuværende arbejde fokuserer på generation af pericytkulturer fra isolerede kvæghjernens kapillærer og den efterfølgende opsætning til målinger og billeddannelsesundersøgelser af ændringer i intracellulært calcium, en vigtig intracellulær anden budbringer. Vi beskriver kort isoleringen af kapillærer fra kortikale grå materie (se Helms et al.10) og pericytes isolation og kultur i ren monokultur uden forurening med endotel- eller gliaceller. Vi giver derefter en protokol for såning af pericytter i 96-brønd plader og lastning protokoller for calcium sonden Fura-2 AM. Endelig viser vi, hvordan pericytter kan bruges i realtid konfokal billeddannelse i mikroskop kultur kamre og beskrive protokollerne for dette.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Udarbejdelse af buffere og opløsninger til celledyrkning

  1. Forbered kollagen stock opløsning ved at opløse 5 mg kollagen IV fra human placenta i 50 ml PBS natten over ved 4 °C. Forstænker lageropløsningen i 5 ml portioner og opbevares ved -20 °C.
  2. Forbered fibronectin stock opløsning ved at opløse 5 mg fibronectin i 5 ml sterilt vand natten over. Fibronectinlagrene opbevares i aliquots på 500 μL ved -20 °C. Ved optøning tilsættes PBS til et slutvolumen på 50 ml for at klargøre arbejdsopløsningen og opbevare den ved 4 °C.
  3. Forbered Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) komplet medium ved at tilføje 50 ml føtal kvæg serum (FBS), 5 ml MEM uvæsentlige aminosyrer og 5 ml penicillin//streptomycin (0,1 g/L streptomycinsulfat og 100.000 U/L penicillin G natrium) til 500 ml DMEM.
  4. Der klargøres 5 mg/ml heparinbestandopløsning ved at opløse heparinsnatiumsalt i PBS og gennemsendes et 0,2 μm filter til sterilisation. Lageropløsningen opbevares ved 4 °C.
  5. Forbered vækstmedium (GM) umiddelbart før brug 10 ml DMEM-comp og 250 μL heparinbestandopløsning pr. T75-kolbe blandes.

2. Isolering af kapillærer fra frisk kvæghjernen

BEMÆRK: Kvæghjernens kapillærer isoleres og dyrkes som tidligere beskrevet (Helms et al.10).

  1. Indsamle hjerner fra kalve, ikke ældre end 12 måneder, fra et slagteri og bringe direkte til laboratoriet på is.
  2. Fjern meninges og indsamle alle grå stof fra hjernen ved hjælp af en skalpel. Identificer meninges som filmen, der dækker hjernen og den grå sagen ved sin grå farve.
  3. Brug en 40 ml Dounce vævssliber til at homogenisere det grå stof i Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM). Fyld den slanke del af vævssliberen 1/5 med grå stofaffjedring, og tilsæt DMEM, indtil den slanke del er fyldt.
  4. Kapillærerne adskilles fra frie celler og mindre vævsstykker ved filtrering af homogenatet gennem et 160 μm nylonnetfilter. Skyl filtrene med DMEM-comp. Hent kapillærerne og pool suspensionerne i 50 ml centrifugeringsrør.
  5. Resuspend kapillærerne i DMEM-comp og tilsæt en enzym blanding af DNase I (170 U/mL), kollagen type III (200 U/mL) og trypsin (90 U/mL). Suspensionen i 1 time i et 37 °C vandbad til fordøjelse af kapillærerne.
  6. Suspensionen køres gennem et 200 μm mesh filter og opsbruges i FBS med 10% dimethylsulfoxid (DMSO). Kapillærerne fryses natten over ved -80 °C, og flyt dem til flydende nitrogen dagen efter til langtidsopbevaring.
    BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her.

3. Såning og dyrkning af kapillærer fra kvæg

  1. Dag 0: Bland 0,7 ml kollagen IV lager med 6,3 ml PBS. Opløsningen anbringes på en T75-kolbe, og kolben efterlades i 2 timer ved stuetemperatur (RT), eller den skal være natten over ved 4 °C.
  2. Kollagenopløsningen fjernes fra kolben og vaskes tre gange med PBS.
  3. Der tilsættes 7 ml fibronectinarbejdsopløsning, og kolben skal efterlades i 30 min. ved RT. Derefter fjernes fibronectin opløsning og frø kapillærerne umiddelbart efter.
  4. I løbet af den 30 minutters ventetid optø et hætteglas med kapillærer i et 37 °C vandbad.
  5. Når kapillærerne optøes, overføres straks til et centrifugeringsrør med 30 ml DMEM-comp og centrifuge i 5 min ved 500 x g og RT. Fjern DMEM-comp fra røret, og kapillær pellets skal hænges igen i 10 ml frisk DMEM-comp.
  6. Affjedringen på 10 ml overføres til den overtruderede T75-kolbe, og kapillærerne skal klæbes til kolbens bund i 4-6 timer i en 37 °C-inkubator ved 10 % CO2.
    BEMÆRK: Cellevækstraten er højere ved 10% CO2 i stedet for den konventionelle 5% CO2.
  7. Efter 4-6 timers inkubation inspicere kolben under et let mikroskop. Fraktioner af kapillærer skal nu fastgøres til bunden af kolben (figur 1, dag 0).
  8. Forbered GM og aspirere DMEN-comp medium meget forsigtig fra kapillærer og erstatte det med 10 ml frisklavet GM.
  9. Dag 2: Fjern GM fra kapillærerne og erstatte med 10 ml frisklavet GM. Cellulære udvækst fra kapillærerne skal være synlige under et lysmikroskop på dette punkt (Figur 1, dag 2-3).

4. Isolering af primære pericytter fra kvæghjernens kapillærer

  1. Dag 4: Undersøg kapillærerne under et let mikroskop.
    BEMÆRK: Kolben skal nu være ca. 60-70 % sammenløb for at give en passende mængde pericytter(figur 1, dag 4). Hvis dette ikke er tilfældet; GM'en erstattes med 10 ml frisk medium, og kolben efterlades i rugemaskinen i endnu en dag.
  2. Inspirer mediet og vask cellerne forsigtigt i PBS.
  3. Der tilsættes 2 ml optøet Trypsin-EDTA til endotelceller, og kolben efterlades i inkubatoren i 1-3 min. Kolben tages ofte ud, og overhold den med mikroskopet i denne periode.
    BEMÆRK: Endotelcellerne skal runde op og løsne sig fra kolben. pericytter skal være synlige som celler med et "spøgelse"-morfologi og stadig være fastgjort til kolbens overflade. Det er et vanskeligt og vigtigt skridt. Det er vigtigt at fjerne de fleste endotelceller for at undgå forurening af pericyt monokultur, men langvarig trypsinization kan også løsne pericytter. Trypsiniseringstiden kan variere en smule fra tid til anden, og det er derfor yderst vigtigt at observere kolben hyppigt med mikroskopet under behandlingen.
  4. Bank forsigtigt på kolben, når endotelcellerne er begyndt at runde op, for at løsne de løsnede endotelceller.
  5. For at stoppe trypsinisering, tilsæt 10 ml DMEM-comp til kolben. Kolben skylles forsigtigt et par gange med mediet for at fjerne endotelcellerne. Indsugning af endotelcellesuspensionen fra kolben. Endotelcellerne kan nu bruges til andre formål.
  6. Der tilsættes 10 ml DMEM-comp til kolben. Kig under lyset mikroskop for at sikre pericytter er stadig til stede og fastgjort til bunden. Kolben sættes tilbage i kuvøsen, så den pericyteberigede dyrre kan vokse.
    BEMÆRK: Det er vigtigt at observere kulturen i de følgende dage. Hvis der stadig er en hel del endotelceller vokser en anden trypsin-behandling kan udføres.
  7. Lad pericyt monokultur til at vokse med ændring af DMEM-comp. mediet hver anden dag. Kontroller cellernes vækst under lysmikroskopet (Figur 1, dag 5-8).

5. Produktion og oplagring af monokultur af primære kvægpericyter

  1. Dag 8-9: Undersøg kapillærerne under et let mikroskop
    BEMÆRK: Pericytterne skulle nu have nået 70-80% sammenløbet og vokse på øer i kolben (Figur 1, dag 9). Hvis sammenløbet af pericytterne er mindre end 70%, skal cellerne vokse til en anden dag. Pericytterne danner ikke et komplet monolag, som endotelcellerne ville gøre.
  2. Aspirat DMEM-comp og vask pericytterne med 7 ml PBS.
  3. Der tilsættes 2 ml trypsin-EDTA til kolben, og den efterlades i inkubatoren i 2-3 min. Kolben anbringes hyppigt under det lyse mikroskop for at observere, når pericyterne rundes op og løsner sig fra kolben. Når pericytterne er begyndt at runde op, kan kolben forsigtigt tappes for at løsne cellerne.
  4. Bank forsigtigt på kolben, når pericyterne er begyndt at runde op, for at løsne cellerne.
  5. Der tilsættes 10 ml DMEM-comp til kolben for at stoppe trypsiniseringsprocessen. Kolben skylles et par gange med mediet for at hjælpe med at løsne de sidste pericytter.
  6. 12 ml celleaffjedring overføres til et 50 ml centrifugeringsrør, og opfyld op til 30 ml med DMEM-comp.
  7. Centrifuge celle suspension i 5 min ved 500 x g og RT. Aspirere DMEM-comp. forsigtigt uden at røre ved cellepillets. Opslæm cellepillets i 3 ml FBS med 10% DMSO.
  8. Cellesuspension overføres til kryovials. tilsættes 1 ml til hver, så der vil være i alt 3 hætteglas pr. T75-kolbe pericytter. Pericytterne frys ved -80 °C natten over, og flyt dem til flydende nitrogen dagen efter til langtidsopbevaring.
    BEMÆRK: Celler kan tælles før frysning for et senere skøn over overlevelsesprocenten. Protokollen kan sættes på pause her.

6. Oprettelse af en pericyt monokultur til eksperimenter

  1. En T75-kolbe med kollagen IV og fibronectin anvendes efter samme fremgangsmåde som nævnt i punkt 3.1-3.4.
  2. Mens kolben er ved at blive belagt med fibronectin, tø et hætteglas pericytter i en 37 °C vandbad.
  3. Overfør de nu optøede pericytter fra kryovial til et centrifugeringsrør med 30 ml DMEM-comp. Centrifuge cellen suspension i 5 min ved 500 x g,RT.
  4. Modsugning forsigtigt mediet, så cellepellet efterlades i bunden af røret. Re-suspendere pellet i 10 ml DMEM-comp.
  5. Cellesuspensionen opsamles og overføres til den overtrerede kolbe. Kolben med pericyter skal vokse i en inkubator på 37 °C ved 10 % CO2.
  6. Hver anden dag opdateres mediet med 10 ml frisk DMEM-comp.
    BEMÆRK: Efter 5 dages vækst skulle pericyterne have nået ca. 80% sammenløb. Hvis sammenløbet er mindre, lad cellerne vokse til en anden dag eller to. Cellerne skulle nu være klar til såning til yderligere eksperimenter.

7. Såning af pericytter i en belagt 96-brønds plade

  1. Kollagen IV som beskrevet i trin 3.1 fortyndes. Der tilsættes 100 μL til hver brønd i en 96-brøndplade og inkuberes i 2 timer ved RT eller natten over ved 4 °C.
  2. Aspirere opløsningen og vask brøndene tre gange med PBS.
  3. Der tilsættes 100 μL fortyndet fibronectin til hver brønd og inkuberes ved RT i 30 min. Fjern fibronectinopløsningen, og brug straks pladen.
    BEMÆRK: Afhængigt af hvor godt pericyt-batchen vokser, bør der være nok celler til såning af to plader.
  4. Tag pericytterne ud af kuvøsen og inspirer mediet. Vask cellerne med PBS.
  5. Tilsæt 2 ml trypsin-EDTA til pericytterne, og følg samme procedure som i trin 5.3-5.6.
  6. Aspirere mediet, uden at skade cellepellet og re-suspendere pellet i 1 ml frisk DMEM-comp.
  7. Tag 12 μL celleaffjedring ud og tilsættes til et tællekammer. Under det lette mikroskop skal du tælle mindst 3 af 3x3 gitre og bruge det gennemsnitlige celletal pr. gitter.
  8. Brug ligningen nedenfor til at beregne mængden af celle suspension, der skal føjes til hver brønd til frø 10.000 celler pr brønd, i 96-brønd plade.
  9. Der tilsættes DMEM-comp og den beregnede mængde cellesuspension i hver brønd for at nå et endeligt volumen på 200 μL.
  10. Pladen med 96 brønde hældes i en 37 °C-inkubator ved 10 % CO2. Lad cellerne vokse i 4 dage med en ændring af medium efter 2 dage.

8. Udarbejdelse af buffere og løsninger til Ca2+-billeddannelse

  1. Autoklave coverslip celle kamre og coverslips.
  2. Analysebuffer: Tilsæt 1,19 g HEPES til 500 ml HBSS-buffer for en endelig koncentration på 10 mM HEPES. PH-3 til 7,4.
  3. Der klargøres 20% (w/v) Pluronic F127 + 1% (v/v) polyethoxyeret ricinusolieopløsning ved at opløse 0,5 g Pluronic F127-opløsning i 2,5 ml vandfri DMSO i et glashætteglas. Varm til 40 °C i ca. 30 min. eller indtil den er opløst og vortex. Der tilsættes 25 μL polyethoxyleret ricinusolie og opbevares på RT. Må ikke fryses.
  4. Der klargøres 2 mM Fura-2 AM-materiel ved at opløse 1 mg i 500 μL vandfri DMSO. Opbevares i aliquots på 20 μL ved -20 °C beskyttet mod lys.
  5. Der tilberedes 5 μM Fura-2 AM-belastningsopløsning ved at blande 20 μL af 20% Pluronic F-127 + 1% polyethoxyleret ricinusoliestrømopløsning med 20 μL på 2 mM Fura-2 AM-aliquot. Der tilsættes 500 μL analysebuffer og vortex. Tilføj analysebuffer til et endeligt volumen på 8 ml. Opløsningen skal fremstilles umiddelbart før brug og beskyttes mod lys.
  6. Der tilberedes 4 mM Cal-520 AM ved at opløse 1 mg i 226,7 μL vandfri DMSO. Opbevares i aliquots på 20 μL ved -20 °C beskyttet mod lys.
  7. Der tilberedes 20 μM Cal-520 AM-belastningsopløsning ved at blande 20 μL på 20% Pluronic F-127 + 1% polyethoxyleret ricinusolieopløsning med 20 μL 4 mM Cal-520 aliquot. Der tilsættes 500 μL analysebuffer og vortex. Tilføj analysebuffer til et endeligt volumen på 4 ml. Opløsningen skal fremstilles umiddelbart før brug og beskyttes mod lys.

9. Indlæsning af pericytter med Fura-2 AM calcium indikator farvestof i en plade-læser setup

BEMÆRK: Alle opløsninger skal være på RT, før forsøget starter.

  1. Tag den 96-brønd plade med celler fra inkubatoren og aspirere mediet fra brøndene. Vask cellerne to gange med analysebuffer.
  2. Tilsæt 100 μL læsseopløsning til hver brønd og pak pladen med stanniol for at undgå fotoblegning. Inkuber i 45 min med 30 omrystning på RT.
    BEMÆRK: Fura-2 AM må ikke læsses ved 37 °C, da den kan laste indvendige rum. Husk at efterlade brønde med celler i analysebufferen i stedet for at indlæse buffer. disse er de "emner", der anvendes til måling af baggrundsfluorescens.
  3. Aspirere læssebufferen og vask cellerne med analysebuffer to gange. Der tilsættes 100 μL frisk analysebuffer, og cellerne inkuberes i 30 min. ved RT. Dette giver mulighed for kontinuerlig spaltning af AM-ester og dermed fældefangst Fura-2 AM inde i cellerne.
  4. Før Ca2+-billeddannelse vaskes og udskiftes bufferen med 100 μL frisk analysebuffer.

10. Well-plade fluorescens aflæsning af pericytter i en plade-læser setup

  1. Pladelæserens temperatur indstilles til 37 °C, og 96-brøndpladen overføres med cellerne til prøvepladens position. Anlæg reagenspladen med agonist i reagenspladens position.
  2. Start med at måle belastning af cellerne for at sikre lige belastning af Fura-2 AM i alle brønde.
  3. Målingerne udføres med excitationfluorescensbølgelængde ved 340 nm/380 nm og emissionsbølgelængden ved 510 nm. Der tilsættes 50 μL agonist ved hastighed 150 μL/s fra reagenspladen til hver brønd med celler i prøvepladens position.
  4. Gem dataene, og eksporter som xlsx-filer til yderligere analyse. Figur 2 viser det cykliske Ca2+-respons målt som forholdet mellem de to excitation bølgelængder over tid, hvor baggrundfluorescens trækkes fra.
    BEMÆRK: Pladelæseren skal være en dobbelt mikropladelæser med plads til en "cellebakke" og en "prøvebakke" og et integreret pipettorsystem.

11. Såning af pericytter i et belagt cellekammer til levende billeddannelse

BEMÆRK: Dækslæber kan også placeres i bunden af kultur brønde, belagt og seedet med pericytes som beskrevet ovenfor, og derefter monteret i kammeret forud for eksperimenter.

  1. Monter en dæksling ind i cellekammeret og gør det stramt for at undgå utæthed.
  2. Kollagen IV som beskrevet i trin 3.1 fortyndes. Der tilsættes 500 μL til hvert cellekammer og inkuberes i 2 timer ved RT eller natten over ved 4 °C.
  3. Aspirer kollagenopløsningen og vask kamrene tre gange med 500 μL PBS.
  4. Der tilsættes 500 μL fortyndet fibronectin til hver brønd og inkuberes ved RT i 30 min. Fjern fibronectinopløsningen, og brug cellekammeret lige bagefter.
  5. I mellemtiden skal kolben ud med sammenløb pericytes og vaskes med 7 ml PBS.
  6. Tilsæt 2 ml trypsin-EDTA til pericytterne, og følg samme procedure som i trin 5.3-5.6.
  7. Fortsæt ved at følge de samme trin som i trin 8.6-8.7.
  8. Brug ligningen nedenfor til at beregne mængden af celle suspension, som bør føjes til hvert kammer til frø 90.000 celler pr kammer.
  9. Dmem-comp og den beregnede mængde cellesuspension i hvert kammer tilsættes et endeligt volumen på 500 μL.
  10. Cellere i inkubatoren sættes i ved 37 °C, 10 % CO2. Lad cellerne vokse i 6 dage (eller indtil sammenløbet).
    BEMÆRK: Pericyterne vokser langsommere på glasdias sammenlignet med plast; flere dage med vækst er nødvendige.

12. Belastning af pericytter med Cal-520 AM calcium indikator farvestof til levende billeddannelse

BEMÆRK: Alle opløsninger skal være på RT, før forsøget starter.

  1. Forbered 20 μM Cal-520 AM loading buffer: Bland 20 μL af 20% Pluronic F-127 + 1% polyethoxyleret ricinusolie propiøs oliestrømopløsning med 20 μL 4 mM Cal-520 aliquot. Der tilsættes 500 μL assaybuffer og vortex. Tilføj analysebuffer til et endeligt volumen på 4 ml. Opløsningen skal fremstilles umiddelbart før brug og beskyttes mod lys.
    BEMÆRK: Beskyt opløsninger, der indeholder Cal-520 AM mod lyseksponering.
  2. Tag cellekamrene ud af inkubatoren og inspirer mediet. Vask cellerne to gange med analysebuffer.
  3. Der tilsættes 500 μL læssebuffer til hvert kammer og inkuberes ved RT i 45 min.
  4. Aspirere læssebufferen og vask cellerne to gange med analysebuffer.
  5. Der tilsættes 500 μL frisk analysebuffer til hvert kammer, og der inkuberes i 30 min ved RT for at tillade spaltning af AM-esteren.
  6. Udskift bufferen med 500 μL frisk analysebuffer, før den levende billeddannelse udføres ved et konfokal mikroskop.

13. Levende billeddannelse af intracellulære Ca2 +-niveauer

BEMÆRK: En række mikroskoptyper kan bruges til billeddannelse. Opretstående eller omvendt konventionelle fluorescensmikroskoper samt opretstående eller omvendt konfokale laserscanningsmikroskoper med passende excitationskilde (488 nm) og emissionsfiltre (510-520 nm) kan anvendes. Målene skal være velegnede til fluorescens og være af høj kvalitet og med høj numerisk blændeåbning (NA).

  1. Monter cellekammeret på scenen af konfokale mikroskop så skånsomt som muligt, for at undgå forstyrrelse af cellerne.
  2. Vælg en excitation bølgelængde på 488 nm, emission ved 515 nm, sekventiel billederhvervelse med 5 sekunders intervaller, en XY billedstørrelse på 512 x 512 pixels og måle i 2 min at måle baseline calcium signaler.
  3. Der tilsættes 3 μL 100 mM ATP til cellekammeret med en pipette, og fortsæt den sekventielle billedoptagelse. Udfør tilsætningen langsomt og forsigtigt for ikke at forstyrre præparatet og flytte cellerne ud af fokus.
  4. Overhold ændringsgraden, og forøg tidsintervallet over tid efter behov i ca. 18 min. indtil der ikke konstateres yderligere morfologiske ændringer (Figur 3).
  5. Spar time-lapse billeder og eksportere dem som TIFF og / eller AVI filer til yderligere analyse.
    BEMÆRK: Et hætteglas pericytter skal give nok celler til såning i 1-2 96-brøndsplader og flere dækslæd, hvilket betyder, at du kan forberede celler til begge typer calciummålinger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Kvæghjernens kapillærer blev isoleret fra frisk hjernevæv, og figur 1 præsenterer kapillær såning og cellulær udvækst over dage og efterfølgende rensning af pericytter. Kapillærerne er fuldt fastgjort til kolben på dag 1, og på dag 2 er endotelspirering blevet synlig(figur 1,dag 2). Efter 4 dage, den cellulære udvækst er meget karakteristisk(Figur 1, dag 4a) og endotelceller fjernes ved blid trypsinization som i henhold til den beskrevne protokol. Rester af kapillærerne kan være til stede efter trypsinisering, men vil forsvinde fra kolben i de følgende dage(Figur 1, dag 4b-6). Efter fjernelse af endotellaget kan pericytter let detekteres med morfologi, der adskiller sig fra endotelcellerne. Pericytterne præsenterer fingerlignende processer, der fastgøres kraftigt til kolben (Figur 1,dag 4b). Efterfølgende får pericytter lov til at vokse indtil sammenløbet (Figur 1, dag 4b-9), og på dag 9 har pericytterne nået ca. 80% sammenløb og vokser på øer. Dette er i modsætning til de endotelceller, der skaber en kontakthæmmet monolag observeret på dag 4.

ATP er en velkendt endogent inducer af intracellulær Ca2 +-signalering11 og blev brugt som en ekstracellulær stimulerende at fremkalde cykliske ændringer i Ca2 +-niveauer i pericytes. Tilsætning af ATP til Fura-2-belastede pericytter, som ifølge den beskrevne protokol, resulterede i en stigning i cyklisk Ca2+-niveauer målt som lysstofrøret som vist i figur 2. Det ATP-inducerede respons opstår umiddelbart efter tilsætning af ATP til pericytterne og falder langsomt over den målte tidsperiode.

Ved hjælp af denne protokol til konfokal billeddannelse i realtid af intracellulære Ca2+-responser blev pericytteret på belagte dæksæber, fyldt med Cal-520 AM og placeret ved det konfokale mikroskop. Figur 3 (0 s) viser pericytterne med baseline niveauer af fluorescens før behandling. Under live-optagelse, ATP er føjet til pericytes og en stærk intracellulær Ca2 +-respons er tydeligt kort efter (64 s). Kort tid efter er den cykliske Ca2+ opdelt i cellerne, og en reduktion i celleområdet er synlig (189 s). Ved 300 s. post starten af optagelserne, er celleområdet stærkt reduceret, og Ca2 +-signalet er faldet til intensitet tæt på baseline fluorescens.

Figure 1
Figur 1: Dyrkning af kapillærer og isolering af pericytter. Kapillærer er blevet isoleret fra frisk kvæghjerne og seedet i dyrk kolber på dag 0. Udvækst fra kvæghjernens kapillærer og følgende isolering af pericytter blev fulgt over dage med et let mikroskop. Dag 4a viser endotelcellevæksten før behandling med trypsin for at fjerne endotelceller, og dag 4b viser resterne umiddelbart efter behandlingen. Dag 8a viser fokusplanet, hvor eventuelle kapillære rester ville være synlige, mens dag 8b er fokuseret på det plan, hvor pericytes vækst er synlig.  Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Repræsentativt eksempel på intracellulær calciummåling ved hjælp af Fura-2 calciumindikatorfarve. Primære pericytter er blevet seedet i 96 brøndplader og fyldt med Fura-2 AM for at visualisere ændringer i intracellulær calcium. Der tilsættes 10 μM ATP til pericytterne ved 30 s., og den cykliske Ca2+-respons måles som forholdet mellem de to excitationsbølgelængder. 340 nm og 380 nm over tid. Skaleringslinjer defineres som standardafvigelse (N=3, n=1). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Repræsentativt eksempel på intracellulær calcium levende billeddannelse ved hjælp af Cal-520 calcium indikator farvestof. Primære pericytter er blevet seedet i et cellekammer og læsset med Cal-520 for at visualisere ændringer i intracellulær calcium og cellemorfologi. Der tilsættes 600 μM ATP til pericytterne, og der præsenteres snapshots fra forskellige tidspunkter under live-imaging her. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne undersøgelse har vi præsenteret en metode til at isolere primære pericytter fra kvæghjerner. Den beskrevne protokol tillader kultur af denne ellers temmelig utilgængelige celletype. Den efterfølgende opnåede cellekultur var en næsten homogen population af pericytter med ringe eller ingen kontaminering med endotelceller og gliaceller baseret på cellemorfologi og proteinudtryk12. Desuden viste vi en enkel og enkel metode til at indlæse pericytter med calciumfarvestoffer til Ca2 +-imaging ved hjælp af to forskellige metoder, afhængigt af det tilsigtede resultat.

Et af de vigtigste spørgsmål, når isolere primære celler fra hjernevæv er den begrænsede adgang til væv. I flere tidligere undersøgelser, rotter og mus er den traditionelle model dyr, der anvendes, men hjernevævet fra disse små dyr er sparsomme6,13. Isolation fra den menneskelige hjerne er også blevet gennemført14; på grund af etiske spørgsmål er dette dog ikke let tilgængeligt. Derfor foretrækkes et højt celleudbytte fra en tilgængelig kilde. Antallet af cellehætteglas, der er fremstillet ved isolering fra en enkelt kvæghjerne, er langt større end den mængde, der er fremkommet fra enten mus eller rotte, hvilket gør kvægvævet fordelagtigt i forhold til de andre kilder, der er nævnt. En anden fordel ved den metode, der er beskrevet her, er det lave passagenummer for at opnå en ren kultur af pericytter. Passaging af vægmaleri celler kan føre til de-differentiering15 og derfor bør helst undgås. I denne protokol er skånsom trypsinisering for at fjerne endotelcellelaget et enkelt trin, der bruges til at isolere pericytterne og derfor også et af de mest kritiske trin, der er beskrevet i denne protokol. Hvis trypsiniseringen forlænges, begynder pericyterne at løsne sig fra kolben sammen med endotelcellerne, hvilket kun fører til et lille udbytte. På den anden side, kun tillader en meget kort trypsinization tid kan forårsage en uren kultur af pericytes. Det er derfor yderst vigtigt at observere cellerne meget ofte under trypsiniseringstrinnet. Man skal være opmærksom på de morfologiske forskelle mellem pericytter og endotelceller for at kunne skelne mellem de to celletyper under trypsiniseringsproceduren. Selv om dette trin kan kræve en vis uddannelse, metoden er mindre tidskrævende og billig i forhold til andre metoder, der anvendes til at opnå ren pericyte kulturer7,8,14. Desuden viste den opnåede kultur af pericytter her den typiske "spøgelse"-lignende morfologi med finger-lignende processer og udtrykte flere specifikke markører såsom α-SMA, PDGFR-β og Nestin (data ikke vist her)12, som er velkendte markører for primære pericytter i kultur1.

Her præsenterede vi også en simpel metode til Ca2 +-imaging ved hjælp af fluorescerende calcium indikator farvestoffer. Belastning af pericytterne med farvestofferne (Fura-2 og Cal-520) skal ske ved RT og ikke ved 37 °C. Flere undersøgelser har udført belastning af AM estere ved 37 °C16,17, men belastning ved denne temperatur kan føre til estere ind intracellulære rum såsom endoplasmic reticulum. Dette er ikke at foretrække, da Fura-2 AM kan binde sig til gratis Ca2 + fanget i de interne butikker og dermed resultere i en lavere stigning i fluorescerende målinger. Derfor kan det forårsage falske resultater. Selv om vi ikke har oplevet nogen større problemer med lastning af pericytter på RT, hvis man oplever problemer alligevel, kan man overveje at optimere belastningen ved sonikering af lastning løsning i 5 min i et ultralydsbad før lastning af cellerne.

Med den beskrevne metode observeres intracellulære Ca2+-signalering sammen med sammentrækning af pericytter let under live optagelser, som også kan kvantificeres til yderligere analyse. Metoden har tidligere været anvendt til at foretage den første demonstration af in vitro Ca2 +-signalering og sammentrækning af hjernen kapillære pericytes12. I tidligere undersøgelser er der anvendt forskellige metoder til at måle og kvantificere cellesammentrækning som følge af ekstracellulær stimulus18,19,20. Det var imidlertid ikke muligt at observere det foreløbige intracellulære respons direkte efterfulgt af sammentrækning af cellerne i disse undersøgelser. I den aktuelle undersøgelse er det muligt at observere den intracellulære signalering, og den følgende sammentrækning af cellerne og begge målinger kan kvantificeres i det samme eksperiment. Således eliminerer det yderligere eksperimenter, som er mere tidskrævende så godt, og viser den direkte sammenhæng mellem intracellulære Ca2 +-signalering og morfologiske ændringer.

Afslutningsvis, denne undersøgelse repræsenterer en enkel og effektiv metode til isolering og dyrkning primære hjerne pericytes. Derudover demonstrerer vi en nem og reproducerbar metode til at studere intracellulære Ca2+-signalering i dyrkede pericytter. De metoder, der er beskrevet her bør give andre forskere på området med stærke værktøjer til at studere pericyte biologi og intracellulære signalering i pericytes in vitro.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker at anerkende finansiering fra Lundbeckfondens forskningsinitiativ om hjernebarrierer og lægemiddellevering (RIBBDD) og Simon Hougners Family Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ATP Tocris 3245
Cal-520 AM AAT Bioquest 21130
Cell incubator Thermo Fisher
Centrifuge Thermo Fisher Heraeus Multifuge 3SR+ Standard large volume centrifuge for spinning down cells
Collagen IV Sigma Aldrich C5533
Confocal laser scanning microscope Carl Zeiss Zeiss LSM 510 Inverted microscope
Counting chamber FastRead 102
Coverslip cell chamber Airekacells SC15022
Cremophor EL Sigma Aldrich C5135 Formerly known as Kolliphor EL
DMSO Sigma Aldrich 471267
Dulbecco's Modified Eagles Medium Sigma Aldrich D0819
Fetal bovine serum (FBS) PAA/GE Healthcare A15-101
Fibronectin Sigma Aldrich F1141
Fura-2 AM Thermo Fisher F1201
Glass coverslips 22x22 mm VWR International 631-0123
HBSS Gibco 14065-049
Heparin Sigma Aldrich H3149
HEPES AppliChem Panreac A1069
Light microscope Olympus Olympus CK2 Upright light microscope with phase contrast
MEM nonessential amino acids Sigma Aldrich M7145
Microplate Reader BMG LabTech NOVOstar
PBS Sigma Aldrich D8537 Phosphate-buffered saline
penicillin G sodium/streptomycin sulfate Sigma Aldrich P0781
Pluronic F127 Sigma Aldrich P2443
Trypsin-EDTA Sigma Aldrich T4299
T-75 flask Sigma Aldrich CLS3972
96-well plate Corning incorporated 3603

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. Pericytes: Developmental, Physiological, and Pathological Perspectives, Problems, and Promises. Developmental Cell. 21 (2), 193-215 (2011).
  2. Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
  3. Mathiisen, T. M., Lehre, K. P., Danbolt, N. C., Ottersen, O. P. The Perivascular Astroglial Sheath Provides a Complete Covering of the Brain Microvessels: An Electron Microscopic 3D Reconstruction. Glia. 58 (9), 1094-1103 (2010).
  4. Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (5), 862-890 (2016).
  5. Zhou, L., Sohet, F., Daneman, R. Purification of Pericytes from Rodent Optic Nerve by Immunopanning. Cold Spring Harbor Protocols. , 608-617 (2014).
  6. Liu, G. H., et al. Isolation, Purification, and Cultivation of Primary Retinal Microvascular Pericytes: A Novel Model Using Rats. Microcirculation. 21 (6), 478-489 (2014).
  7. Nayak, R. C., Herman, I. M. Bovine retinal microvascular pericytes: isolation, propagation, and identification. Methods In Molecular Medicine. 46, 247-263 (2001).
  8. Nees, S., et al. Isolation, bulk cultivation, and characterization of coronary microvascular pericytes: the second most frequent myocardial cell type in vitro. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 302 (1), H69-H84 (2012).
  9. Armulik, A., Abramsson, A., Betsholtz, C. Endothelial/pericyte interactions. Circulation Research. 97 (6), 512-523 (2005).
  10. Helms, H. C., Brodin, B. Methods in Molecular Biology. Cerebral Angiogenesis: Methods and Protocols. Milner, R. 1135, Humana Press Inc. 365-382 (2014).
  11. Abbracchio, M. P., Burnstock, G., Verkhratsky, A., Zimmermann, H. Purinergic signalling in the nervous system: an overview. Trends in Neurosciences. 32 (1), 19-29 (2009).
  12. Cai, C., et al. Stimulation-induced rises in cerebral blood flow and local capillary vasoconstriction depend on conducted vascular responses in brain capillaries. PNAS. , (2018).
  13. Tigges, U., Welser-Alves, J. V., Boroujerdi, A., Milner, R. A novel and simple method for culturing pericytes from mouse brain. Microvascular Research. 84 (1), 74-80 (2012).
  14. Maier, C. L., Shepherd, B. R., Yi, T., Pober, J. S. Explant Outgrowth, Propagation and Characterization of Human Pericytes. Microcirculation. 17 (5), 367-380 (2010).
  15. Orlidge, A., Damore, P. A. Cell specific effects of glycosaminoglycans on the attachment and proliferation of vascular wall components. Microvascular Research. 31 (1), 41-53 (1986).
  16. Rhinehart, K., Zhang, Z., Pallone, T. L. Ca2+ signaling and membrane potential in descending vasa recta pericytes and endothelia. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 283, F852-F860 (2002).
  17. Bintig, W., et al. Purine receptors and Ca2+ signalling in the human blood-brain barrier endothelial cell line hCMEC/D3. Purinergic Signalling. 8 (1), 71-80 (2012).
  18. Neuhaus, A. A., Couch, Y., Sutherland, B. A., Buchan, A. M. Novel method to study pericyte contractility and responses to ischaemia in vitro using electrical impedance. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (6), 2013-2024 (2017).
  19. Kamouchi, M., et al. Calcium influx pathways in rat CNS pericytes. Molecular Brain Research. 126 (2), 114-120 (2004).
  20. Das, A., et al. ATP Causes Retinal Pericytes to Contract In vitro. Experimental Eye Research. 46, 349-362 (1988).

Tags

Neurovidenskab Pericyte ATP Ca2 +-signalering Fura-2 AM Cal-520 AM celle kultur pladelæser konfokal laserscanning mikroskopi
Kultur af Brain Kapillære Pericytes for cytosolic calcium målinger og calcium Imaging Undersøgelser
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hørlyck, S., Helms, H. C. C.,… More

Hørlyck, S., Helms, H. C. C., Brodin, B. Culture of Brain Capillary Pericytes for Cytosolic Calcium Measurements and Calcium Imaging Studies. J. Vis. Exp. (159), e61253, doi:10.3791/61253 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter