مُقَسَم غير كهربي لقياس فوسفورية البولي نووكليوتيد من ركائز النيوكليوتيدات الصغيرة
Summary
يصف هذا البروتوكول مقايسة غير نشطة لقياس نشاط كيناز من كينازات البولي نوكليوتيد (PNKs) على ركائز الحمض النووي والحمض النووي الريبي الصغيرة.
Abstract
الكنايات المتعددة النوكليوتيدات (PNKs) هي إنزيمات تحفز الفسفر من نهاية الهيدروكسيل 5 ‘من الحمض النووي والحمض النووي الريبي oligonucleotides. ويمكن قياس نشاط الـ PNK باستخدام نهج مباشرة أو غير مباشرة. يُعرض هنا نهج مباشر في المختبر لقياس نشاط PNK الذي يعتمد على الركيزة القلوية ذات التسمية الفلورية وأوليغونوكليوتيد وبوليكريلاميد هلام الكهرباء. يوفر هذا النهج القرار من المنتجات الفوسفورية مع تجنب استخدام ركائز radiolabeled. البروتوكول تفاصيل كيفية إعداد تفاعل الفوسفور، وإعداد وتشغيل المواد الهلامية بوليكلايد كبيرة، وقياس منتجات التفاعل. الجزء الأكثر تحديا من الناحية الفنية من هذا المقايسة هو صب وتشغيل المواد الهلامية بوليكريلايد كبيرة; وبالتالي، يتم توفير تفاصيل هامة للتغلب على الصعوبات المشتركة. تم تحسين هذا البروتوكول لGrc3، وهو PNK الذي يتجمع في مجمع معالجة الحمض النووي الريبي الإلزامي مع شريكه الملزم، النوى Las1. ومع ذلك، يمكن تكييف هذا البروتوكول لقياس نشاط الإنزيمات PNK الأخرى. وعلاوة على ذلك، يمكن أيضا أن يتم تعديل هذا الفحص لتحديد آثار مختلف مكونات التفاعل، مثل ثلاثي الفوسفات النووي، والأيونات المعدنية، وأوليغونوكليوتيدات.
Introduction
3- تلعب الكنايات المتعددة النوكليوتيدات (PNK) أدواراً حاسمة في العديد من مسارات معالجة الحمض النووي والحمض النووي الريبي ( DNA) ، مثل إصلاح الحمض النووي وتجميع الريبوسوم1،2،3،4،5. هذه الإنزيمات الأساسية تحفز نقل محطة (غاما) أحادي الفوسفات من ثلاثي الفوسفات النيوكليوسيد (NTP، في معظم الأحيان ATP) إلى نهاية الهيدروكسيل 5 ‘من الركيزة النيوكليوتيد. واحدة من أكثر PNKs تتميز بشكل جيد هو bacteriophage T4 PNK ، التي لديها خصوصية الركيزة العريضة وتستخدم بشكل كبير من قبل مختبرات البيولوجيا الجزيئية لدمج تسميات النظائر المشعة على 5 ذرة من الحمض النووي أو الركيزة RNA6،7،8،9،10،,12.11 مثال آخر من إنزيم PNK هو CLP1، الذي تم العثور عليه في Eukarya، Eubacteria، و Archaea، وتورط في عدة مسارات معالجة الحمض النووي الريبي4،13،14،15.
تاريخيا، معظم المقايسات التي تقيس نشاط كيناز متعدد النوكليوتيد تعتمد على وضع العلامات النظائر المشعة والتصوير الذاتي اللاحق5،16. في السنوات الأخيرة تم تطوير عدد من المقايسات إضافية لقياس نشاط PNK، بما في ذلك نهج جزيء واحد، electrophoresis رقاقة، منارات الجزيئية، وكذلك colorimetric والإنارة المستندة إلىالمقايسات 17،18،19،20،21،22. وفي حين أن العديد من هذه النهج الجديدة توفر حدوداً معززة للكشف وتتجنب استخدام النشاط الإشعاعي، فإن لكل منها عيوباً، مثل التكلفة والاعتماد على الراتنج غير المُجَدَّد، والقيود المفروضة على اختيار الركيزة.
Grc3 هو كيناز متعدد النوى التي تلعب دورا محوريا في معالجة ما قبل الريبوزوم RNA2,3,23. Grc3 يشكل مجمع ملزم مع endoribonuclease Las1، الذي يشقوق الداخلية المناسخة 2 (ITS2) من الجيش الملكي النيبالي قبل الريبوسوم3. انشقاق ITS2 بواسطة Las1 يولد منتج إيواء 5 ‘الهيدروكسيل التي هي في وقت لاحق phosphorylated من قبل kinase Grc33. للتحقيق في النيوكليوتيد وخصوصية الركيزة من Grc3، كان مطلوبا اختبار غير مكلفة التي سمحت باختبار ركائز oligonucleotide مختلفة. ولذلك، تم تطوير مقايسة فوسفيجيلة PNK باستخدام ركائز مسمّاة بالفلورسنت. تم استخدام هذا الفحص بنجاح لتحديد أن Grc3 يمكن الاستفادة من أي NTP لنشاط نقل الفوسفوريل، ولكن تفضل ATP24. هذا البروتوكول يكيف المقايسة الأصلية لقياس نشاط PNK من Grc3 على تقليد الحمض النووي الريبي لركيزة الحمض النووي الريبي (SC-ITS2، الجدول 1). أحد الجوانب الصعبة لهذا النهج القائم على الفلورسين هو الاعتماد على جلات البولي أكريلاميد الكبيرة لحل ركائز الفوسفور وغير الفوسفورية بشكل فعال. ويوفر البروتوكول تفاصيل محددة حول كيفية صب هذه المواد الهلامية الكبيرة وتجنب المزالق الشائعة عند القيام بذلك.
يتطلب العمل مع الحمض النووي الريبي عناية خاصة لأنه معرض بشدة للتدهور. هناك خطوات وقائية بسيطة يمكن للمرء أن تتخذ للحد من التلوث ريبونوكليس. محطة عمل منفصلة الحمض النووي الريبي التي يمكن علاجها بسهولة مع عامل التنظيف RNase التي تحتوي على مثبطات غالبا ما تكون مفيدة. من الضروري ارتداء القفازات دائمًا عند التعامل مع العينات واستخدام المواد الاستهلاكية المعتمدة الخالية من RNase. لأن المياه هي مصدر آخر للتلوث، فمن الأفضل استخدام المياه النقية الطازجة وتعقيم جميع الحلول باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر.
Protocol
Representative Results
Discussion
وصف هو مقايسة لقياس نشاط كيناز من Grc3 PNK على ركائز النيوكليوتيدات الفلورية التي تحمل علامة. ويمكن تطبيق هذا البروتوكول لتوصيف إنزيمات PNK الأخرى عن طريق تكييف العازلة رد الفعل وركيزة القلة. على سبيل المثال، يستدعي البروتوكول كمية من EDTA. إضافة EDTA مفيد لسببين: أولاً، هذا النهج يفضل Grc3 المرتبطة …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الدكتور أندرو سيكيما وأندريا كامينسكي على قراءتهما النقدية لهذه المخطوطة. وقد دعم هذا العمل المعهد الوطني الأمريكي لبرنامج البحوث الصحية الداخلية؛ المعهد الوطني الأمريكي لعلوم الصحة البيئية (NIEHS) ZIA ES103247 إلى R.E.S) والمعاهد الكندية للبحوث الصحية (CIHR; 146626 إلى M.C.P).
Materials
| 0.4 mm 34-well comb | BioRad | 1653848 | |
| 0.4 mm spacer | BioRad | 1653812 | |
| 0.5 M EDTA ph 8.0 | KD Medical | RGF-3130 | |
| 1M Magnesium Chloride | KD Medical | CAC-5290 | |
| 1M Tris pH 8.0 | KD Medical | RGF-3360 | |
| 40% Acrylamide/Bis Solution 29:1 | BioRad | 1610146 | |
| 5M Sodium Chloride | KD Medical | RGF-3720 | |
| ammonium persulfate (APS) | BioRad | 161-0700 | |
| ATP | Sigma | A2383-1G | |
| boric acid | Sigma | B0394 | |
| bromophenol blue sodium salt | Sigma | B5525-5G | |
| Glass Plates | Thomas Scientific | 1188K51 | |
| Hoefer SQ3 Sequencer | Hoefer | N/A | |
| Image J Software | N/A | N/A | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| Labeled RNA oligonucleotides | IDT | Custom Order | |
| Pharmacia EPS 3500 Power Supply | Pharmacia | N/A | |
| Steriflip 0. 22 um Filter | Millipore | 5FCP00525 | |
| TEMED | BioRad | 161-0800 | |
| tris base | Sigma | TRIS-RO | |
| Typhoon FLA 9500 gel imager | GE Healthcare | N/A | |
| Ultra Pure DEPC Water | Invitrogen | 750023 | |
| Ultra Pure Glycerol | Invitrogen | 19E1056865 | |
| urea | Fisher Chemical | U15-500 |
References
- Pillon, M. C., Stanley, R. E. Nuclease integrated kinase super assemblies (NiKs) and their role in RNA processing. Current Genetics. 64 (1), 183-190 (2018).
- Pillon, M. C., Sobhany, M., Borgnia, M. J., Williams, J. G., Stanley, R. E. Grc3 programs the essential endoribonuclease Las1 for specific RNA cleavage. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 114 (28), E5530-E5538 (2017).
- Gasse, L., Flemming, D., Hurt, E. Coordinated Ribosomal ITS2 RNA Processing by the Las1 Complex Integrating Endonuclease, Polynucleotide Kinase, and Exonuclease Activities. Molecular Cell. 60 (5), 808-815 (2015).
- Dikfidan, A., et al. RNA specificity and regulation of catalysis in the eukaryotic polynucleotide kinase Clp1. Molecular Cell. 54 (6), 975-986 (2014).
- Bernstein, N. K., et al. The molecular architecture of the mammalian DNA repair enzyme, polynucleotide kinase. Molecular Cell. 17 (5), 657-670 (2005).
- Rio, D. C. 5′-end labeling of RNA with [gamma-32P]ATP and T4 polynucleotide kinase. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (4), 441-443 (2014).
- Paredes, E., Evans, M., Das, S. R. RNA labeling, conjugation and ligation. Methods. 54 (2), 251-259 (2011).
- Hilario, E. End labeling procedures: an overview. Molecular Biotechnology. 28 (1), 77-80 (2004).
- Eastberg, J. H., Pelletier, J., Stoddard, B. L. Recognition of DNA substrates by T4 bacteriophage polynucleotide kinase. Nucleic Acids Research. 32 (2), 653-660 (2004).
- Lillehaug, J. R., Kleppe, K. Kinetics and specificity of T4 polynucleotide kinase. Biochemistry. 14 (6), 1221-1225 (1975).
- Richardson, C. C. Phosphorylation of nucleic acid by an enzyme from T4 bacteriophage-infected Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 54 (1), 158-165 (1965).
- Galburt, E. A., Pelletier, J., Wilson, G., Stoddard, B. L. Structure of a tRNA repair enzyme and molecular biology workhorse: T4 polynucleotide kinase. Structure. 10 (9), 1249-1260 (2002).
- Saito, M., et al. Large-Scale Molecular Evolutionary Analysis Uncovers a Variety of Polynucleotide Kinase Clp1 Family Proteins in the Three Domains of Life. Genome Biology Evolution. 11 (10), 2713-2726 (2019).
- Jain, R., Shuman, S. Characterization of a thermostable archaeal polynucleotide kinase homologous to human Clp1. RNA. 15 (5), 923-931 (2009).
- Weitzer, S., Hanada, T., Penninger, J. M., Martinez, J. CLP1 as a novel player in linking tRNA splicing to neurodegenerative disorders. Wiley Interdisciplinary Reviews RNA. 6 (1), 47-63 (2015).
- Wang, L. K., Lima, C. D., Shuman, S. Structure and mechanism of T4 polynucleotide kinase: an RNA repair enzyme. EMBO Journal. 21 (14), 3873-3880 (2002).
- Zhang, Y., Zhao, J., Chen, S., Li, S., Zhao, S. A novel microchip electrophoresis laser induced fluorescence detection method for the assay of T4 polynucleotide kinase activity and inhibitors. Talanta. 202, 317-322 (2019).
- Cui, L., Li, Y., Lu, M., Tang, B., Zhang, C. Y. An ultrasensitive electrochemical biosensor for polynucleotide kinase assay based on gold nanoparticle-mediated lambda exonuclease cleavage-induced signal amplification. Biosensors and Bioelectronics. 99, 1-7 (2018).
- Wang, L. J., Zhang, Q., Tang, B., Zhang, C. Y. Single-Molecule Detection of Polynucleotide Kinase Based on Phosphorylation-Directed Recovery of Fluorescence Quenched by Au Nanoparticles. Analytical Chemistry. 89 (13), 7255-7261 (2017).
- Liu, H., Ma, C., Wang, J., Chen, H., Wang, K. Label-free colorimetric assay for T4 polynucleotide kinase/phosphatase activity and its inhibitors based on G-quadruplex/hemin DNAzyme. Analytical Biochemistry. 517, 18-21 (2017).
- Du, J., Xu, Q., Lu, X., Zhang, C. Y. A label-free bioluminescent sensor for real-time monitoring polynucleotide kinase activity. Analytical Chemistry. 86 (16), 8481-8488 (2014).
- Jiang, C., Yan, C., Jiang, J., Yu, R. Colorimetric assay for T4 polynucleotide kinase activity based on the horseradish peroxidase-mimicking DNAzyme combined with lambda exonuclease cleavage. Analytica Chimica Acta. 766, 88-93 (2013).
- Castle, C. D., et al. Las1 interacts with Grc3 polynucleotide kinase and is required for ribosome synthesis in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 41 (2), 1135-1150 (2013).
- Pillon, M. C., Sobhany, M., Stanley, R. E. Characterization of the molecular crosstalk within the essential Grc3/Las1 pre-rRNA processing complex. RNA. 24 (5), 721-738 (2018).
- Geerlings, T. H., Vos, J. C., Raue, H. A. The final step in the formation of 25S rRNA in Saccharomyces cerevisiae is performed by 5′–>3′ exonucleases. RNA. 6 (12), 1698-1703 (2000).
- Pillon, M. C., et al. Cryo-EM reveals active site coordination within a multienzyme pre-rRNA processing complex. Nature Structural Molecular Biology. 26 (9), 830-839 (2019).
- Solomatin, S., Herschlag, D. Methods of site-specific labeling of RNA with fluorescent dyes. Methods in Enzymology. 469, 47-68 (2009).
- Giusti, W. G., Adriano, T. Synthesis and characterization of 5′-fluorescent-dye-labeled oligonucleotides. PCR Methods Application. 2 (3), 223-227 (1993).
- Petrov, A., Tsa, A., Puglisi, J. D. Analysis of RNA by analytical polyacrylamide gel electrophoresis. Methods in Enzymology. 530, 301-313 (2013).
